《滅菌技術》教學課件

1、第三章 滅菌技術【本章學習的目的和要求】1.了解培養(yǎng)基滅菌的原理；了解發(fā)酵培養(yǎng)液的無菌檢查方法；了解空氣除菌的原理。 2.熟悉空氣過濾除菌的流程和常見設備無菌。3.掌握常用的滅菌方法和原理；掌握培養(yǎng)基分批滅菌和連續(xù)滅菌的操作流程；掌握發(fā)酵用空氣的質量標準。第1頁，共44頁。8/3/20221第一節(jié) 滅菌滅菌是指用物理的或化學的方法殺滅或除掉物料及設備中一切有生命的有機體的技術或工藝過程。一、常用滅菌方法的基本原理（一）化學物質（藥劑）滅菌化學藥劑適用于生產車間環(huán)境的滅菌，接種操作前小型器具的滅菌等。常用的化學藥劑介紹如下： 第2頁，共44頁。8/3/202221乙醇 70%-75%乙醇溶液殺菌

2、作用最強 2甲醛 將甲醛溶液（37%）直接加熱，按18ml/m3計算用量 3新潔而滅 0.25%的溶液 4石炭酸3%-5%的水溶液 (二)輻射滅菌紫外線波長在240-300nm范圍內 （三）干熱滅菌一般要求160-170，保溫1-2h。 第3頁，共44頁。8/3/20223滅菌溫度（）滅菌時間（min）17060160120150150140180121過夜表4-1 干熱滅菌所需溫度和時間第4頁，共44頁。8/3/20224(四)濕熱滅菌 一般的濕熱滅菌條件為121，30min（五）過濾除菌二、培養(yǎng)基的滅菌目前在工業(yè)生產中培養(yǎng)基的滅菌通常采用濕熱滅菌法，包括實罐滅菌（實消）、連續(xù)滅菌（連消）兩

3、種方法第5頁，共44頁。8/3/20225滅菌溫度（）滅菌時間(min)培養(yǎng)基營養(yǎng)成分破壞量（%）10040099.3110306711515501204271300.581400.0821500.011表4-2 不同滅菌條件下對培養(yǎng)基營養(yǎng)成分破壞的情況第6頁，共44頁。8/3/20226（一）微生物的死亡速率與理論滅菌時間1微生物的熱阻致死溫度:殺死微生物的極限溫度。致死時間:在致死溫度下，殺死全部微生物所需要的時間成。在致死溫度以上，溫度越高，致死時間越短。 第7頁，共44頁。8/3/20227熱阻:是指微生物在某一特定條件（主要是溫度和加熱方式）下的致死時間。相對熱阻是指某一微生物在某條

4、件下的致死時間與另一微生物在相同條件下的致死時間的比值。表4-3 微生物對濕熱的相對抵抗力微生物名稱細菌芽孢霉菌孢子病毒大腸桿菌相對抵抗力31062-101-51第8頁，共44頁。8/3/20228表4-4 在不同溫度下的濕熱滅菌殺死芽孢所需要的時間溫度（）時間（min）100120011018011530121151256.51302.51400.9第9頁，共44頁。8/3/202292微生物的熱死規(guī)律對數殘留定律微生物熱死是指微生物受熱失活直到死亡。微生物受熱死亡主要是由于微生物細胞內酶蛋白受熱凝固變性所致。在培養(yǎng)基進行濕熱滅菌時，微生物受熱后，其死亡細胞的個數變化與化學法反應的濃度變化一

5、樣，遵循一定的規(guī)律，培養(yǎng)基中的微生物受熱死亡的速率與任一瞬間殘存的微生物數量成正比，這就是“對數殘留定律”，用下式表示：dN/dt= - kN （4-1） 式中 N培養(yǎng)基中殘存活菌數 t 受熱時間，min k 反應速率常數(又稱比死亡速率常數)，min-1；與滅菌溫度、菌種特性有關 第10頁，共44頁。8/3/202210 Nt=N0e-kt式中N0滅菌開始時原有的菌數，個； Nt 滅菌結束時殘留的菌數，個。根據上述的對數殘留方程式，如果要求達到徹底滅菌，即Nt=0,則所需的滅菌時間t為無限長，這在實際生產中是不可行的，因此實際設計時，常采用Nt=0.001（即在1000批次滅菌中只有1批是失

6、敗的）。如以殘留菌數的對數與滅菌時間t的實測數在半對數坐標紙上繪圖，得出的殘留曲線為一直線其斜率的絕對值為比死亡速率常數k。第11頁，共44頁。8/3/2022114-5表121下，不同細菌芽孢的k值細菌名稱K值/ min-1枯草芽孢桿菌3.8-2.6硬脂嗜熱芽孢桿菌FS15180.77硬脂嗜熱芽孢桿菌FS6172.9產氣梭狀芽孢桿菌PA36791.8第12頁，共44頁。8/3/202212（二）培養(yǎng)基的分批滅菌（實罐滅菌、實消）1培養(yǎng)基預熱 滅菌時，培養(yǎng)基需要先加熱到80-90，然后再導入蒸汽升溫到120-130進行滅菌。預熱的方法是：先將各排氣閥門打開，將蒸汽引入夾套或蛇管進行預熱，待罐溫

7、升到80-90，將排氣閥門逐漸關小。預熱的目的：一是防止直接導入蒸汽時由于培養(yǎng)基與蒸汽的溫差過大而產生大量的冷凝水使培養(yǎng)基稀釋，二是防止直接導入蒸汽容易造成泡沫急劇上升而引起物料外溢。第13頁，共44頁。8/3/2022132培養(yǎng)基滅菌 當罐溫升到80-90時，將蒸汽從進氣口、排料口、取樣口直接導入罐內、使罐溫上升到120-130，保溫30min。滅菌時應注意：各路蒸汽進口要暢通，防止逆流；罐內液體翻動要劇烈，以使罐內物料達到均一的滅菌溫度；排氣量不宜過大，以節(jié)約蒸汽用量。第14頁，共44頁。8/3/202214圖4-1 實罐滅菌設備示意圖第15頁，共44頁。8/3/2022153冷卻 待滅菌

8、將要結束時，應立即引入無菌空氣以保持罐壓，然后打開夾套或蛇管冷卻水冷卻，以避免罐壓迅速下降，產生負壓而抽吸外界空氣。注意：在引入無菌空氣前，罐內壓力必須低于過濾器壓力，否則培養(yǎng)基（或物料）將倒流入過濾器內。第16頁，共44頁。8/3/202216（三）培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌（連消）培養(yǎng)基配料配料罐 預熱桶 加熱器 維持罐 冷卻器 發(fā)酵罐 加入滅菌的培養(yǎng)基連消泵第17頁，共44頁。8/3/2022171連續(xù)滅菌工藝的特點（1）在較高的溫度和較短的時間內滅菌，營養(yǎng)成分破壞的少；（2）發(fā)酵罐非生產占用時間縮短，容積利用率提高；（3）熱能利用合理，適于實現自動化控制；（4）不適用于粘度大或固形物含量高的培養(yǎng)

9、基滅菌；（5）增加了一套連續(xù)滅菌裝置，操作環(huán)節(jié)增多，從而增加了染菌的機率。第18頁，共44頁。8/3/2022182連續(xù)滅菌操作步驟（1）配料 （2）培養(yǎng)基預熱 在預熱桶內，一般可先將培養(yǎng)基預熱到70-90。 （3）加熱使料液溫度在較短的時間（20-30s）內迅速達到滅菌溫度，連續(xù)滅菌的溫度一般以126-132為宜，加熱采用的蒸汽壓力一般為4.5-8105Pa，加熱器有塔式和噴射式兩種。第19頁，共44頁。8/3/202219（4）保溫（維持） 圖3維持罐結構第20頁，共44頁。8/3/202220（5）降溫 （40-45） 圖4 噴淋冷卻器第21頁，共44頁。8/3/202221三、空罐滅菌

10、與發(fā)酵附屬設備及管路的滅菌（一）空罐滅菌（空消）空罐滅菌即發(fā)酵罐罐體的滅菌?？展逌缇话憔S持罐壓1.5105-2.0105Pa、罐溫為125-130、時間為30-45min。滅菌時要求總蒸汽壓力不低于3.0105-3.5105Pa、使用壓力不低于2.5105-3.0105Pa。第22頁，共44頁。8/3/202222（二）發(fā)酵附屬設備的滅菌發(fā)酵附屬設備有總（分）空氣過濾器、管道、計量罐、補料罐、消沫系統(tǒng)等。1.糖水罐的滅菌 一般糖水罐滅菌時罐壓為1105 Pa，保溫時間為30min。 2.油（消沫劑）罐的滅菌 油（消沫劑）罐滅菌時的罐壓為1.5105-1.8105 Pa，保溫時間為60min。

11、3.總（分）空氣過濾器的滅菌 維持壓力1.74105 Pa，滅菌時間2h。4.管道的滅菌 管道滅菌時的蒸汽壓力不應低于3.4105Pa，保溫時間為1h。 第23頁，共44頁。8/3/202223第二節(jié) 空氣除菌一、空氣的過濾除菌（一）空氣過濾除菌的原理1絕對過濾 絕對過濾所用介質的孔隙小于營養(yǎng)細胞和孢子，能將微生物阻留在介質的一側，從而獲得無菌空氣。如用聚四氟乙烯或者纖維素酯材料做成的微孔濾膜（孔徑在0.22m）。2深層介質過濾第24頁，共44頁。8/3/202224圖4-5 帶微粒空氣圍繞一圓柱形纖維流動的模型（引自熊宗貴 發(fā)酵工藝原理，2003）深層介質過濾所用介質(如棉花、玻璃纖維等)孔

12、隙大于微生物，例如，空氣中微粒的直徑dp一般為0.5-10m，而作為過濾介質的棉花纖維直徑dt在16-20m，玻璃纖維直徑dt在5-19m，同時，纖維之間存在著較大空隙，（在50m左右），那么纖維是如何捕集空氣中的微生物粒子呢？第25頁，共44頁。8/3/202225主要有以下幾種機理：微粒隨氣流通過濾層時，過濾層具有一定的厚度，濾層纖維所形成的網格阻礙氣流前進，迫使氣體在流動過程中產生無數次改變氣流速度大小和方向的繞流運動，這些改變引起微粒對濾層纖維產生慣性沖擊、重力沉降、攔截、布郎擴散、靜電吸附等作用而將微粒滯留在纖維表面。同時因為濾層是由無數單纖維層組成，所以就增加了捕獲微粒的機會。第2

13、6頁，共44頁。8/3/202226圖4-6 除去液滴或顆粒的纖維工作原理圖4-6 除去液滴或顆粒的纖維工作原理在上述五種除菌機制中，截留和靜電吸附作用不受外界影響，而其他三種機制遇空氣流速直接相關。一般認為慣性沖擊、攔截、布朗擴散截流的作用較大，如圖4-6所示。而重力沉降和靜電吸附的作用較小，但最終的結果是幾種作用的綜合效應。第27頁，共44頁。8/3/202227（二）空氣過濾介質常用的過濾介質有棉花（未脫脂）、顆粒狀活性炭、玻璃纖維、超細玻璃纖維紙、石棉濾板、燒結材料。常用的濾膜有：新型絕對過濾介質可耐蒸汽滅菌的膜材料PVDF（聚偏氟乙烯）和PTFE（聚四氟乙烯）以及尼龍膜等，增加了滅菌

14、效果。 第28頁，共44頁。8/3/202228（三）空氣過濾器表4-6幾種過濾器的適用條件及性能比較過 濾 器 類 型適 用 條 件 及 性 能傳統(tǒng)過濾棉花、活性炭可以反復蒸汽滅菌、但介質經滅菌后過濾效率降低，拆裝勞動強度大，環(huán)保條件差。活性炭對油霧的吸附效果較好，可作為總過濾汽用于去除油霧、灰塵、管垢和鐵銹等。維尼綸無需蒸汽滅菌，靠過濾介質本身的“自凈”作用。要求有一定的填充密度和厚度，管路設計有一定的要求，介質一旦受潮容易失效?？勺鳛榭傔^濾器及微孔濾膜過濾器的預過濾。超細玻璃纖維紙可蒸汽滅菌，但重復次數有限，拆裝不便，裝填要求高，可作為終過濾器，但不能保證絕對除菌。金屬燒結材料耐高溫?？?/p>

15、反復蒸汽滅菌，過濾介質空隙在1030m，過濾阻力小，可作為終過濾器，但無法保證絕對除菌。新型過濾器硼硅酸纖維親水性，無需蒸汽滅菌，95%容塵空間，過濾精度1u，介質受潮后處理能力和過濾效率下降；適合在無油干燥的空壓系統(tǒng)中，作為預過濾器、除塵、管垢及鐵銹等；過濾介質經折疊后制成濾芯，過濾面積大，阻力小，更換方便，容塵空間大、處理量大聚偏氟乙烯疏水性，可反復高壓蒸汽滅菌，容塵空間為65%，過濾精度0.10.01u；可以作為無菌空氣的終端過濾器；過濾介質經折疊后制成濾芯過濾面積大、阻力小、更換方便聚四氟乙烯疏水性，可反復高壓蒸汽滅菌，容塵空間為85%，過濾精度0.01u，可100%除去微生物；可以作

16、為無菌空氣的終端過濾器，無菌槽、罐的呼吸過濾器及發(fā)酵罐尾氣除菌過濾器；過濾介質經折疊后制成濾芯過濾面積大、阻力小、更換方便第29頁，共44頁。8/3/202229二、發(fā)酵用空氣的質量標準生物濃度104個/m3作為空氣的污染指標發(fā)酵用無菌空氣，就是將自然界的空氣經過壓縮、冷卻、減濕、過濾等過程，達到以下標準：1連續(xù)提供一定流量的壓縮空氣。 2空氣的壓強（表壓）為2105-4105Pa，壓強過低不利于克服發(fā)酵罐中的下游阻力，壓強過高，則是浪費能源。3空氣在進入過濾器前，相對濕度70%。這是為了防止空氣過濾器過濾介質受潮，影響過濾效果。第30頁，共44頁。8/3/2022304進入發(fā)酵罐的空氣溫度可

17、以比培養(yǎng)溫度高10-30。 5壓縮空氣的潔凈度，在設計空氣過濾器時，一般指標取失敗概率為10-3，也可以把100級作為無菌空氣的潔凈指標。100級指每立方米空氣中，塵埃粒子數最大允許值0.5m的為3500個/m3，塵埃粒子數最大允許值5m的為0個/m3；微生物最大允許值為5個浮游菌，1個沉降菌/m3。第31頁，共44頁。8/3/202231圖4-7空氣凈化設備系統(tǒng)流程圖1-粗過濾器；2-壓縮機；3-貯罐；4，6-冷卻器；5-旋風分離器；7-絲網除沫器；8-加熱器；9-空氣過濾器第32頁，共44頁。8/3/202232一般把這個流程中空氣進入空氣過濾器以前的部分稱為空氣預處理階段。下面我們將預處

18、理階段的設備簡單介紹如下：1采風塔 采風塔應建在工廠的上風口，遠離煙囪。采風塔越高越好，至少10m，設計氣流速度8m/s左右 2粗過濾器 過濾介質可采用泡沫塑料（平板式）或者無紡布（折疊式），設計流速為0.1-0.5m/s。3空氣壓縮機第33頁，共44頁。8/3/2022334空氣貯罐 5冷卻器 6汽液分離設備 （1）旋風分離器 旋風分離器是利用離心力沉降進行汽-液或汽-固沉降分離的設備。主要除去空氣中較大的霧滴（油、水），可以除去空氣中絕大多數的20m以上的液滴。（2）絲網除沫（分離）器 絲網分離器是利用慣性攔截的原理來進行汽液分離的設備。主要分離空氣中較小的霧滴（1m以上），去除率約為98%。7空氣加熱設備 第34頁，共44頁。8/3/202234第35頁，共44頁。8/3/202235第36頁，共44頁。8/3/2022361、 高空采風、兩次冷卻、兩次分油水、適當加熱流程特點 ：兩次冷卻、兩次分油水、適當加熱?？諝獾谝淮卫鋮s到3035，第二級冷卻至2025，經分水后加熱到3035，因為溫度升高，相對濕度下降。第37頁，共44頁。8/3/202237 2、冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程 特點 ：省去一級冷卻和分離設備及空氣再加熱設備，簡化了流程，使冷卻水用量也降低了。壓縮空氣從貯罐出來分兩路，一部分進冷卻器，經分離器分離