發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌課件

1、第三部分 微生物工程生產(chǎn)設(shè)備18 培養(yǎng)基滅菌及滅菌設(shè)備第1頁，共76頁。11、由于雜菌的污染，使生物反應(yīng)中的基質(zhì)或產(chǎn)物因雜菌的消耗而損失，造成生產(chǎn)能力的下降； 2、由于雜菌所產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物，或在染菌后改變了培養(yǎng)液的某些理化性質(zhì)，使產(chǎn)物 的提取和分離變得困難，造成收率降低或使產(chǎn)品的質(zhì)量下降；3、雜菌會(huì)大量繁殖，會(huì)改變反應(yīng)介質(zhì)的PH值，從而使生物反應(yīng)發(fā)生異常變化；4、雜菌可能會(huì)分解產(chǎn)物，從而使生產(chǎn)過程失??； 5、發(fā)生噬菌體污染，微生物細(xì)胞被裂解，而使生產(chǎn)失敗，等等 在發(fā)酵生產(chǎn)中，為什么要進(jìn)行滅菌操作？ 問題1第2頁，共76頁。21、為防止雜菌的污染，哪些需要滅菌？培養(yǎng)基、發(fā)酵設(shè)備、空氣問題2滅

2、菌的定義滅菌利用物理和化學(xué)的方法殺滅或除去物料及設(shè)備中一切生命物質(zhì)的過程。 。消毒是指用物理或化學(xué)的方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病源微生物，一般只能殺死營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞而不能殺死芽孢。第3頁，共76頁。3 消毒與滅菌在發(fā)酵工業(yè)中均有廣泛應(yīng)用。消毒是指用物理或化學(xué)方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病源微生物。一般只能殺死營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞而不能殺死細(xì)菌芽孢。例如，用于消牛奶、啤酒和釀酒原汁等的巴氏消毒法，是將物料加熱至60維持30min，以殺死不耐高溫的物料中的微生物營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。 滅菌是用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽孢和孢子。 消毒不一定能達(dá)到滅菌要求，而滅菌則可達(dá)到消毒的目的 消毒

3、與滅菌的區(qū)別第4頁，共76頁。4一、常用滅菌方法的基本原理（一）化學(xué)試劑滅菌法 （二）射線滅菌法（三）干熱滅菌法 化學(xué)試劑：甲醛、乙醇或新潔爾滅、高錳酸鉀等 適用范圍：環(huán)境空氣、皮膚及器械的表面消毒電磁波、紫外線或放射性物質(zhì)適用范圍：無菌室、接種箱常用烘箱，滅菌條件為在160下保溫1h 適用范圍：金屬或玻璃器皿第5頁，共76頁。5消毒劑用途常用濃度使用方法1 氧化劑：高錳酸鉀漂白粉皮膚消毒發(fā)酵工廠環(huán)境消毒0.1-0.25%2-5%環(huán)境消毒可直接用于粉體2醇類：乙醇皮膚及器物的消毒70-75%器物消毒浸泡30 min3 酚類：石碳酸來蘇爾浸泡衣物、擦拭房間桌面、噴霧消毒皮膚、桌面、器械消毒1-5

4、%3-5%4 甲醛空氣消毒1-2%（10-15ml/m3）加熱熏蒸4h5 銨鹽新潔而滅皮膚、器械、環(huán)境消毒0.1-0.25%浸泡30min常用化學(xué)消毒劑及其使用方法第6頁，共76頁。6. 電磁波、射線滅菌法.原理：利用高能電磁波、紫外線或放射性物質(zhì)產(chǎn)生的高能粒子可以起到滅菌的作用。 波長(zhǎng)在(2.1-3.1) 10-7 m的紫外線 表面或空氣滅菌。 波長(zhǎng)在(0.06-1.4) 10-7 m的 X 射線/射線(Co60) 在 工業(yè)上還少采用。穿透力差設(shè)備投資高第7頁，共76頁。7（四）濕熱滅菌法 （五）過濾除菌法 （六）火焰滅菌法 利用飽和蒸汽進(jìn)行滅菌、條件為：121，30min 。由于蒸汽有很強(qiáng)

5、的穿透力，冷凝時(shí)放出大量的潛熱，來源方便，價(jià)格低廉，滅菌效果好，是目前最基本的適合培養(yǎng)基和設(shè)備的滅菌方法。適用范圍：廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)設(shè)備及培養(yǎng)基的滅菌 。例：高壓滅菌鍋利用過濾方法阻留微生物 適用范圍：制備無菌空氣 酒精燈火焰 。方法簡(jiǎn)單、滅菌徹底，但適用范圍有限適用范圍：接種針、玻璃棒、三角瓶口 第8頁，共76頁。8接種針、試管口皮膚表面無菌室、接種箱培養(yǎng)基的滅菌空氣過濾除菌法火焰滅菌法濕熱滅菌法射線滅菌法化學(xué)試劑滅菌法營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、芽孢、病毒或孢子？比較各種微生物對(duì)熱的抵抗能力大小滅菌方法連線題第9頁，共76頁。91.熱滅菌的原理濕熱滅菌原理滅菌條件滅菌不利方面同時(shí)也會(huì)破壞培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分，甚

6、至?xí)a(chǎn)生不利于菌體生長(zhǎng)的物質(zhì)。因此，在工業(yè)培養(yǎng)過程中，除了盡可能殺死培養(yǎng)基中的雜菌外，還要盡可能減少培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分的損失 由于蒸汽具有很強(qiáng)的穿透能力，而且在冷凝時(shí)會(huì)放出大量的冷凝熱，很容易使蛋白質(zhì)凝固而殺死各種微生物。 121，30min。 第10頁，共76頁。10衡量熱滅菌指標(biāo) 致死溫度：殺死微生物的極限溫度。致死時(shí)間：在此溫度下，殺死全部微生物所需要的時(shí)間。熱 阻：對(duì)熱的抵抗力，指微生物在某一特定條件（主要是溫度和加熱方式）下的致死時(shí)間。相對(duì)熱阻：幾種微生物對(duì)熱的相對(duì)抵抗能力。指微生物在某一特定條件下的致死時(shí)間與另一微生物在相同條件下的致死時(shí)間的比值。 第11頁，共76頁。11 微生物

7、相對(duì)熱阻細(xì)菌和酵母的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞 1細(xì)菌芽孢 3106霉菌孢子 2-10病毒及噬菌體 1-5微生物對(duì)熱的抵抗力稱為熱阻（heat resistance）第12頁，共76頁。12某些微生物的相對(duì)熱阻。滅菌方式大腸桿菌霉菌孢子細(xì)菌芽孢噬菌體或病毒干熱滅菌12-1010001濕熱滅菌12-1031051-5苯酚11-2110930甲醛12-102502紫外線15-1002-55-10說說芽孢或孢子的熱阻要比營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的熱阻大的原因？第13頁，共76頁。13芽孢或孢子的熱阻要比生長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的熱阻大得多，這是由于芽孢或孢子內(nèi)吡啶二羧酸含量對(duì)熱阻的增加有關(guān)。另外，芽孢子中蛋白質(zhì)含水量較營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞低（特別是游離水

8、分少），也是芽孢耐熱強(qiáng)的一個(gè)原因。圖FS7954芽孢桿菌的芽孢在不同溫度下的死亡情況。 10t (min)N/N010-110-210-310-4510152025121116110108105嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢在不同溫度下的死亡曲線第14頁，共76頁。14微生物的熱死規(guī)律和影響滅菌的因素 在發(fā)酵工業(yè)中，對(duì)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌，廣泛使用濕熱滅菌法。工廠里，蒸汽比較容易獲得，控制操作條件方便，是一種簡(jiǎn)單而又價(jià)廉、有效的滅菌方法。用濕熱滅菌的方法處理培養(yǎng)基，其加熱受熱時(shí)間與滅菌程度和營(yíng)養(yǎng)成分的破壞都有關(guān)系。營(yíng)養(yǎng)成分的減少將影響菌種的培養(yǎng)和產(chǎn)物的生成，所以滅菌程度和營(yíng)養(yǎng)成分的破壞成為滅菌工作中的

9、主要矛盾，恰當(dāng)掌握加熱受熱時(shí)間是滅菌工作的關(guān)鍵。受熱時(shí)間如何確定？第15頁，共76頁。151、 微生物的死亡速率：對(duì)數(shù)殘留定律 微生物受熱死亡的原因，主要是因高溫使微生物體內(nèi)的一些重要蛋白質(zhì)，如酶等，發(fā)生凝固、變性，從而導(dǎo)致微生物無法生存而死亡。微生物受熱而喪失活力，但其物理性質(zhì)不變。 第16頁，共76頁。16 在一定溫度下，微生物的受熱死亡遵照分子反應(yīng)速度理論。在滅菌過程中，微生物的死亡速率與任一瞬時(shí)殘存的活菌數(shù)成正比,對(duì)數(shù)殘留定律.數(shù)學(xué)表達(dá)式：- dN/d = NN ：培養(yǎng)基中活的微生物個(gè)數(shù)； ：時(shí)間（s）; ：比死亡速率（s-1） (死亡速率常數(shù))dN/d ： 微生物的瞬間變化率，即死亡

10、速率第17頁，共76頁。17 若開始滅菌（ = 0）時(shí)，培養(yǎng)基中活的微生物數(shù)為N0 =( 2.303 logN0/N )/- dN/d = NlnN/N0 = - 積分2.303logN0/N = or第18頁，共76頁。18各種微生物在同樣的溫度下K值是不同的，K值愈小，則此微生物愈耐熱在121度，枯草桿菌FS5230的K為0.047s-1，梭狀芽孢桿菌PA3679的K值為0.03 s-1 ，請(qǐng)問哪一種微生物更耐熱?上式是計(jì)算滅菌的基本公式，滅菌速度常數(shù)K是判斷微生物受熱死亡難易程度的基本依據(jù)。10t (min)N/N0大腸桿菌在不同溫度下的死亡曲線10-110-210-310-424681

11、060585654 = (2.303 logN0/N) / 第19頁，共76頁。19可見滅菌時(shí)間取決于污染程度(N0)、滅菌程度（殘留菌數(shù)N）和值在培養(yǎng)基中有各種各樣的微生物，不可能逐一加以考慮。一般只考慮芽孢細(xì)菌和細(xì)菌的芽孢數(shù)之和作為計(jì)算依據(jù)。滅菌程度，即殘留菌數(shù)，如果要求完全徹底滅菌，即N = 0，則 為，上式無意義，事實(shí)上也不可能。一般取N = 0.001，即1000次滅菌中有1 次失敗。 = (2.303 logN0/N) / 第20頁，共76頁。20例：有一發(fā)酵罐內(nèi)裝40m3培養(yǎng)基，在121溫度下進(jìn)行實(shí)罐滅菌。原污染程度為每1mL有2*105個(gè)耐熱細(xì)菌芽孢，121度時(shí)滅菌速度常數(shù)為1

12、.8min-1。求滅菌失敗機(jī)率為0.001時(shí)所需要的滅菌時(shí)間。 解： N0=40 106 2 105=8 1012（個(gè)） Ns=0.001（個(gè)） K= 1.8min-1第21頁，共76頁。21連續(xù)滅菌（連消） 連續(xù)滅菌的滅菌時(shí)間，仍可用滅菌公式計(jì)算，但培養(yǎng)基中的含菌數(shù)，應(yīng)改為每單位體積(1mL)培養(yǎng)基的含菌數(shù)，則滅菌公式變換為下式式中 c0單位體積培養(yǎng)基滅菌前的含菌數(shù)，個(gè)mL ;cs單位體積培養(yǎng)基滅菌后的含菌數(shù)，個(gè)mL。第22頁，共76頁。22【例】若將上例中的培養(yǎng)基采用連續(xù)滅菌，滅菌溫度為131，此溫度下滅菌速率常數(shù)為15min-1，求滅菌所需的維持時(shí)間。解第23頁，共76頁。232、滅菌的

13、溫度和時(shí)間 上面說過，當(dāng)培養(yǎng)基被加熱滅菌時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)這樣的矛盾，這就是，加熱時(shí)，微生物固然會(huì)被殺死，但培養(yǎng)基中的有用成分也會(huì)隨之遭到破壞，那么有何良策可以既達(dá)到滅菌要求，同時(shí)又不破壞或盡可能少破壞培養(yǎng)基中的有用成分呢？ 實(shí)踐證明，在高壓加熱的情況下，培養(yǎng)基中的氨基酸和維生素極易被破壞，如在121，僅20min，就有59%的賴氨酸和精氨酸及其他堿性氨基酸被破壞，蛋氨酸和色氨酸也有相當(dāng)數(shù)量被破壞。因此，必須選擇一個(gè)既能滿足滅菌需要，又可使培養(yǎng)基的破壞盡可能養(yǎng)活的滅菌工藝條件。 第24頁，共76頁。24 微生物的受熱死亡屬于單分子反應(yīng)，其滅菌速率常數(shù)K與溫度之間的關(guān)系可用阿累尼烏斯公式表示：K滅菌速

14、度常數(shù)（s-1），也稱反應(yīng)速度常數(shù)或比死亡速度常數(shù). = A eR TEA 比例常數(shù)；E 殺死細(xì)菌所需的活化能，(E) （4.18 J/mol）;T 絕對(duì)溫度，(K)R 氣體常數(shù)，1.9784.18 J/(molK)e 2.71 (exp)第25頁，共76頁。25= A eR TEA 比例常數(shù)；E 分解活化能，(E) （4.18 J/mol）;T 絕對(duì)溫度，(K)R 氣體常數(shù)，1.9784.18 J/(molK)e 2.71 (exp)滅菌時(shí)，培養(yǎng)基成分分解速率常數(shù)K與溫度之間的關(guān)系也可用阿累尼烏斯公式表示：第26頁，共76頁。261= A eR T1E2= A eER T2相除取對(duì)數(shù)ln21

15、= E 1 1R T1 T2 在滅菌時(shí)，當(dāng)溫度變化，菌死亡速率常數(shù)和培養(yǎng)基成分破壞速率常數(shù)都變化。溫度由T1升高到T2，值分別為：同樣，滅菌時(shí)培養(yǎng)基成分的破壞也可得類似關(guān)系：ln2 1 = R T1 T2E 1 1第27頁，共76頁。27ln(2 /1)ln(2 /1)EE上面兩式相除，得第28頁，共76頁。28名稱E (J/mol)葉酸泛酸維生素B12維生素B1嗜熱脂肪芽孢桿菌枯草桿菌肉毒梭菌70.387.996.792.1283318343第29頁，共76頁。29通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定可知： 滅菌時(shí)殺死微生物的活化能大于培養(yǎng)基成分的破壞活化能值，因此： 結(jié)論1：當(dāng)滅菌溫度上升時(shí)，微生物殺死速率的提高

16、要超過培養(yǎng)基成分的破壞速率的增加。 第30頁，共76頁。30從上述的分析可知，在熱滅菌過程中，同時(shí)會(huì)發(fā)生微生物死亡和培養(yǎng)基破壞這兩種過程，且這兩種過程的進(jìn)行速度都隨溫度的升高而加速，但微生物的死亡速率隨溫度的升高更為顯著。因此，可選擇合適的滅菌溫度和時(shí)間來調(diào)和二者之間的矛盾。 滅菌溫度滅菌時(shí)間（分）營(yíng)養(yǎng)成分破壞量%10040099.31103667.01151550.0120427.01300.58.01450.082.01500.011.0 再看表滅菌溫度、時(shí)間與營(yíng)養(yǎng)成分破壞量的關(guān)系（N/No=0.001） 據(jù)測(cè)定，每升高10時(shí)一般化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率的增加倍數(shù)是1.5-2.0，而殺死芽孢為5

17、-10，殺死微生物細(xì)胞為35左右。 第31頁，共76頁。31 由此可見，若要減少營(yíng)養(yǎng)成分的破壞，可升高溫度滅菌。結(jié)論2：在滅菌時(shí)選擇較高的溫度、較短的時(shí)間，這樣便既可達(dá)到需要的滅菌程度，同時(shí)又可減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失。 問題滅菌要達(dá)到殺死99.99%的細(xì)菌芽孢，有兩種方法可以采用，一種是118滅菌15min，另一種是128滅菌5min。哪一種方法好，為什么？ 答：從理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐都可證明，在滅菌過程中，同時(shí)會(huì)發(fā)生微生物死亡和培養(yǎng)基破壞這兩種過程，且這兩種過程的進(jìn)行速度都隨溫度的升高而加速，但微生物的死亡速率隨溫度的升高更為顯著。因此，對(duì)于同一滅菌效果，選擇較高的溫度、較短的時(shí)間，這樣便既可達(dá)到

18、需要的滅菌程度，同時(shí)又可減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失。 第32頁，共76頁。323、影響滅菌的因素培養(yǎng)基中氫離子濃度對(duì)滅菌的影響 培養(yǎng)基中氫離子濃度直接影響滅菌的效果。培養(yǎng)基的 酸堿度越大，所需殺滅微生物的溫度越低。溫度/孢子數(shù)/（個(gè)/ml）滅菌時(shí)間/minpH值6.1pH值5.3pH值5.0pH值4.7pH值4.5120100008753311510000252512131311010000706535302410010000740720180150150pH ，微生物最耐熱；pH ，氫離子易滲入微生物細(xì)胞內(nèi)，從而改變細(xì)胞的生理反應(yīng)，促使其死亡。所以，培養(yǎng)基pH值愈低，滅菌所需的時(shí)間愈短。第33頁，共

19、76頁。33微生物細(xì)胞中水分對(duì)滅菌的影響細(xì)胞含水越多，蛋白質(zhì)變性的溫度越低微生物細(xì)胞菌齡對(duì)滅菌的影響老細(xì)胞水分含量低、低齡細(xì)胞水分含量高培養(yǎng)基的物理狀態(tài)對(duì)滅菌的影響培養(yǎng)基中微生物數(shù)量對(duì)滅菌的影響第34頁，共76頁。34 為什么說培養(yǎng)基中脂肪、糖分和蛋白質(zhì)的含量越 高，滅菌溫度就得相應(yīng)高些 ？問題問題 滅菌的徹底與否應(yīng)以殺死營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞為準(zhǔn)還是殺死細(xì)菌孢為標(biāo)準(zhǔn)，為什么？ 環(huán)境耐熱性大腸桿菌水6065便死亡10糖液70，46min30糖液70，30min答：培養(yǎng)液中油脂、糖類及一定濃度的蛋白質(zhì)會(huì)增加微生物的耐熱性，高濃度有機(jī)物會(huì)包于細(xì)胞周圍形成一層薄膜，影響熱的傳遞；因此，在固形物含量高的情況下，滅菌

20、溫度可高些。高濃度鹽類、色素能削減其耐熱性 。第35頁，共76頁。35答：泡沫中的空氣形成隔熱層,使傳熱困難，熱難穿透過去殺滅微生物。因而有時(shí)需要在培養(yǎng)基中加入消泡沫劑以減少泡沫的產(chǎn)生，或適當(dāng)提高滅菌溫度，延長(zhǎng)滅菌時(shí)間。問題 在滅菌過程中，為什么說培養(yǎng)基發(fā)生泡沫對(duì)滅菌很不利？ 液膜空氣空氣第36頁，共76頁。36問題答：蒸汽滅菌過程中，溫度的控制是通過控制罐內(nèi)的蒸汽壓力來實(shí)現(xiàn)。壓力表顯示的壓力應(yīng)與罐內(nèi)蒸汽壓力相對(duì)應(yīng)，即壓力表的壓力所對(duì)應(yīng)的溫度應(yīng)是罐內(nèi)的實(shí)際溫度。但是如果罐內(nèi)空氣排除不完全，壓力表所顯示的壓力就不單是罐內(nèi)蒸汽壓力，還包括了空氣分壓，因此，此時(shí)罐內(nèi)的實(shí)際溫度就低于壓力表顯示壓力所對(duì)

21、應(yīng)的溫度，以致造成滅菌溫度不夠而滅菌不徹底在滅菌過程中，為什么要排除罐內(nèi)空氣？蒸汽壓力與溫度的關(guān)系 蒸汽壓力(atm)相應(yīng)的溫度（）空氣完全驅(qū)除程度罐內(nèi)實(shí)際溫度（）0.3107.7完全驅(qū)除121.60.7115.5驅(qū)除2/3115.01.0121.6驅(qū)除1/2112.01.3126.6驅(qū)除1/3109.01.5130.5全未驅(qū)除100.0第37頁，共76頁。37 培養(yǎng)基的PH值越低，滅菌所需的時(shí)間就愈短。（ ）問題判斷 在實(shí)際生產(chǎn)中，不宜采用嚴(yán)重霉腐的腐敗的水質(zhì)，是因?yàn)槠湮⑸飻?shù)量多，影響滅菌效果。（ ） 微生物含水量越多，滅菌時(shí)間就得越長(zhǎng)。（ ） 年輕細(xì)胞比年老細(xì)胞更易殺死。（ ） 在滅菌過

22、程中，充分?jǐn)嚢韪欣跍缇?。?）第38頁，共76頁。38二生產(chǎn)上培養(yǎng)基的滅菌方法（一）分批滅菌概念：先將輸料管內(nèi)的污水放凈并沖洗干凈將配制好的培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐、種子罐或補(bǔ)料罐，用蒸汽直接加熱，達(dá)到滅菌要求的溫度和壓力后維持一定時(shí)間，再冷卻至發(fā)酵要求的溫度，這一工藝過程稱分批滅菌（實(shí)罐滅菌）優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備要求低，操作簡(jiǎn)便缺點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成份有損失罐利用率低不能采用高溫快速滅菌工藝第39頁，共76頁。39操作1、在進(jìn)行培養(yǎng)基滅菌之前，通常應(yīng)先把發(fā)酵罐的分空氣過濾器滅菌并用無菌空氣吹干。若已先行空罐滅菌，此步可不進(jìn)行2、預(yù)熱 向夾套或蛇管中通入蒸汽，間接將培養(yǎng)基加熱至70左右。作 用： 利于糊化；減少冷凝水

23、的生成；減輕噪音第40頁，共76頁。403、開啟蒸汽管，向培養(yǎng)基中通入蒸汽，升溫。4、罐壓達(dá)1kg/cm2 ( 0.1 MPa)時(shí)，按裝在發(fā)酵罐封頭的接種管、補(bǔ)料管、消泡劑管等應(yīng)排汽。5、保溫 調(diào)節(jié)好各進(jìn)汽和排汽閥門，使罐壓和溫度保持在一穩(wěn)定水平，維持一定時(shí)間。 在保溫階段，凡進(jìn)口在培養(yǎng)基液面下的各管道都應(yīng)通入蒸汽；在液面上的其余管道則應(yīng)排放蒸汽，這樣才能保證滅菌徹底，不留死角。第41頁，共76頁。416、保溫結(jié)束后，依次關(guān)閉各排汽、進(jìn)汽閥；待罐內(nèi)壓力降至0.5kg/cm2左右時(shí)，向罐內(nèi)通入無菌空氣，向夾套或蛇管中通入冷水，使培養(yǎng)基降至所需溫度。通入無菌空氣的作用：加速降溫；保持罐內(nèi)正壓第42

24、頁，共76頁。42事故2002年9月5日衡陽市某啤酒廠釀造車間一臺(tái)容積100m3的不銹鋼發(fā)酵糖在清洗過程中發(fā)生收縮變形而吸癟，造成直接經(jīng)濟(jì)損失22萬元的重大設(shè)備事故。第43頁，共76頁。4350m3發(fā)酵罐失穩(wěn)事故分析1事故情況 1998年安陽市某化工廠車間一臺(tái)50m3發(fā)酵罐在空罐消毒后水冷卻過程中突然失穩(wěn)。無傷亡事故，直接經(jīng)濟(jì)損失20余萬元。2事故原因分析 現(xiàn)場(chǎng)勘察發(fā)現(xiàn)，該罐進(jìn)汽口和出汽門閥門關(guān)閉。冷卻水閥門敞開。這說明，失穩(wěn)是在冷卻過程中發(fā)生的。 許用壓力計(jì)算 100以下罐體就會(huì)承受外壓。外壓值等于大氣壓與水的飽和蒸汽壓之差。70以下水的飽和蒸汽壓與罐內(nèi)負(fù)壓值見附表。 實(shí)測(cè)筒體許用外壓力0.

25、0832MPa。 比較上表不難看出，當(dāng)罐內(nèi)溫度降到60 以下后，罐體失穩(wěn)隨時(shí)都有可能發(fā)生。第44頁，共76頁。443、分批滅菌的注意事項(xiàng)1）各路蒸汽進(jìn)口要暢通，防止短路逆流；罐內(nèi)液體翻動(dòng)要?jiǎng)×?，以使罐?nèi)物料達(dá)到均一的滅菌溫度。2）排氣量不宜過大，以節(jié)約蒸汽3）滅菌將要結(jié)束時(shí)，應(yīng)立即引入無菌空氣以保持罐壓，然后開夾套或蛇管冷卻，以避免罐壓迅速下降產(chǎn)生負(fù)壓而吸入外界空氣，或引起發(fā)酵罐破壞。4）在引入無菌空氣前，罐內(nèi)壓力必須低于過濾器壓力，否則培養(yǎng)基將倒流入過濾器。第45頁，共76頁。45過程包括：升溫、保溫和冷卻等三個(gè)階段。各階段對(duì)滅菌的貢獻(xiàn)：20%、75%、5%024016012080時(shí)間（mi

26、n)50100150溫度升溫冷卻保溫圖為培養(yǎng)基間歇滅菌過程中的溫度變化情況第46頁，共76頁。46V = V加熱 + V維持 + V冷卻 RT2 (E 2RT)V 加熱 = t 加熱 (T-T0)E2 RT2 (E 2RT)V 冷卻 = t 冷卻 (T-T0)E2第47頁，共76頁。47R ：氣體常數(shù)；= 1. 986 卡/克分子KE ：耐熱孢子致死的活化能；= 65000 卡/克分子T：滅菌維持溫度； 121 （393 K）T0：開始計(jì)算滅菌效果的溫度；100 （373 K）第48頁，共76頁。48例 1）小型發(fā)酵罐在120滅菌維持15分鐘，由100 （100以下滅菌效果不計(jì)）加熱至120的

27、時(shí)間為5分鐘，由120冷卻到100的時(shí)間為3分鐘，計(jì)算總的滅菌時(shí)間。 1.9863932(65000 21.986 393)V加熱 = 5 = 1.15 (393-373) 650002 RT2 (E 2RT)V 加熱 = t 加熱 (T-T0)E2第49頁，共76頁。49 1.9863932(65000 21.986 393)V冷卻 = 3 = 0. 69 (393-373) 650002V = V加熱 + V維持 + V冷卻 = 1.15 + 15 + 0.69 = 16.6 (min) RT2 (E 2RT)V 冷卻 = t 冷卻 (T-T0)E2第50頁，共76頁。50例 ）如果滅菌條

28、件不變，大罐由100加熱到120需24分鐘；冷卻至100的時(shí)間為16分鐘；求大罐的維持時(shí)間。 1.9863932(65000 1.986 393)V加熱 V冷卻 = （ ） (393-373) 650002.min則大罐維持時(shí)間V維持 = V（V加熱V冷卻）16.6 9.2 = 7.4 min第51頁，共76頁。51在不同規(guī)模的發(fā)酵罐中達(dá)到同樣滅菌效果所需時(shí)間發(fā)酵罐規(guī)模（升） 維持時(shí)間（分） 200 17. 5 500 12. 6 5000 11. 3 50000 8. 8第52頁，共76頁。52 在實(shí)際生產(chǎn)中，也可能遇到所供蒸汽不足、溫度不夠高的情況，這時(shí)可以適當(dāng)延長(zhǎng)滅菌時(shí)間。 生產(chǎn)上甚至有

29、100蒸煮而達(dá)到徹底滅菌的實(shí)例。如要做固體曲而沒有高溫蒸汽時(shí)，可將原料用100蒸汽蒸30min，殺死其中的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，但孢子與細(xì)菌的芽孢沒有被殺死。將蒸過的原料置于室溫下過夜，未被殺死的孢子便發(fā)芽生長(zhǎng)，芽孢發(fā)育成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，再30min便可殺死。如此連續(xù)反復(fù)進(jìn)行2-3次，亦可達(dá)到徹底滅菌的目的。 從以上分析可知，滅菌過程中加熱和保溫階段的滅菌作用是主要的，而冷卻階段的滅菌作用是次要的，一般很小。此外，還應(yīng)指出的是，應(yīng)當(dāng)避免長(zhǎng)時(shí)間的加熱階段，因?yàn)榧訜釙r(shí)間過長(zhǎng)，不僅破壞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且也有可能引起培養(yǎng)液中某些有害物質(zhì)的生成，從而影響培養(yǎng)過程的順利進(jìn)行。 第53頁，共76頁。53問題 在實(shí)際生產(chǎn)中，如果遇

30、到所供蒸汽不足，如何有用100蒸煮而達(dá)到徹底滅菌？家用土蒸鍋對(duì)食用菌三級(jí)種進(jìn)行滅菌？第54頁，共76頁。54(二)、培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌將配置好的培養(yǎng)基在向發(fā)酵罐等培養(yǎng)裝置輸送的同時(shí)進(jìn)行加熱、保溫、和冷卻而進(jìn)行滅菌。連續(xù)滅菌可在短時(shí)間內(nèi)加熱到保溫的溫度，并且能很快地冷卻，因此可在比間歇滅菌更高的溫度下進(jìn)行滅菌，有利于減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失。培養(yǎng)基連續(xù)滅菌過程中的溫度的變化第55頁，共76頁。55配料罐將培養(yǎng)基預(yù)熱60-70，防止培養(yǎng)基在殺菌時(shí)料液與蒸汽溫度相差過大而產(chǎn)生水汽撞擊聲。連消塔（加熱塔）使培養(yǎng)基迅速（20 s)升溫（126-132 ）。維持罐：使培養(yǎng)基溫度保持在滅菌溫度下一段時(shí)間。2-7mi

31、n.冷卻管：將培養(yǎng)基迅速冷卻到40-50 ，輸送到滅菌后的發(fā)酵罐內(nèi)1、連消塔式滅菌流程第56頁，共76頁。56、預(yù)熱可在專門的預(yù)熱罐，也可用配料罐兼作溫 度：一般預(yù)熱至70左右預(yù)熱的物料用泵泵入連消裝置輸料泵： 常用 旋渦泵、往復(fù)泵、螺桿泵第57頁，共76頁。57旋渦泵往復(fù)泵螺桿泵第58頁，共76頁。58、加熱物料泵入加熱器，培養(yǎng)基與蒸汽混合，溫度迅速上升至130140常用連消裝置有三類： 套管式連消器汽液混合式連消器噴射式加熱器第59頁，共76頁。59套管式連消塔上疏下密，45小孔，孔徑6毫米左右培養(yǎng)液流動(dòng)線速度小于0.1m/s ; 在管內(nèi)逗留時(shí)間為1520秒第60頁，共76頁。60 汽液混

32、合式連消器第61頁，共76頁。611 噴嘴 2 吸入口 3 吸入室 4混合噴嘴 5 混合段 6擴(kuò)大管噴射加熱器第62頁，共76頁。62、保溫保溫設(shè)備 （維持設(shè)備） 保溫材料包裹兩種形式：罐式；管式 第63頁，共76頁。63維持罐第64頁，共76頁。64培養(yǎng)基的平均停留時(shí)間 = V / FM-平均停留時(shí)間 （s）V- 維持罐的體積 （ m3）FM - 培養(yǎng)基的流量 （m3/s）第65頁，共76頁。65Note: 培養(yǎng)基在維持罐的流動(dòng)不可能非常均勻，可能產(chǎn)生溝流，造成一部分培養(yǎng)基在罐內(nèi)的停留時(shí)間少于平均值。為保證滅菌徹底，在設(shè)計(jì)罐式維持器時(shí)，通常取平均停留時(shí)間的35倍。經(jīng)驗(yàn)： 在滅菌溫度為130時(shí)，實(shí)際平均時(shí)間可取10分鐘；在140時(shí)則可取34分鐘。第66頁，共76頁。66、冷卻噴淋冷卻器板式冷卻器真空冷卻器第67頁，共76頁。67噴淋冷卻器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單；廣泛使用第68頁，共76頁。68流程中采用了蒸汽噴射器，它使培養(yǎng)液與高溫蒸汽直接接觸，從而在短時(shí)間內(nèi)可將培養(yǎng)液急速升溫至預(yù)定的滅菌溫度然后在該溫度下維持一段時(shí)間滅菌，滅菌后的培養(yǎng)基通過一膨脹閥進(jìn)入真空冷卻器急速冷卻，從圖中可以看出，由于該流程中培養(yǎng)基受熱時(shí)間短，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失也就不很嚴(yán)重，同時(shí)該流程保證