分離以尿素為氮源的微生物(上課)課件

1、實(shí)驗(yàn)2分離以尿素為氮源的微生物此實(shí)驗(yàn)課題意義何在？第1頁，共45頁。1、尿素 尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、脲酶土壤中的某些細(xì)菌能夠合成脲酶，并且向胞外分泌。CO(NH2)脲酶+ CO2NH3+ H2O第2頁，共45頁。分離以尿素為氮源的微生物怎么分離出能分解尿素的微生物呢？菌種可能在什么環(huán)境中較多？第3頁，共45頁。實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理： 人為提供促進(jìn)目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。選擇性培養(yǎng)基第4頁，共45頁。15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO47

2、H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO4分離能夠分解尿素的選擇性培養(yǎng)基成分：從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？固體培養(yǎng)基在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素第5頁，共45頁。 培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理?第6頁，共45頁。15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO47H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO4分離能夠分解尿素的選擇性培養(yǎng)基成分：氮源真

3、的唯一嗎？第7頁，共45頁。 1、瓊脂作為微生物固體培養(yǎng)基不可缺少的組成 成分，其優(yōu)點(diǎn)是：其主要成分不能被微生物利用；可使培養(yǎng)基固化；不影響培養(yǎng)基中其他營養(yǎng)物質(zhì)被微生物吸收。2、瓊脂的成分 瓊脂是一種未被純化的混合物，主要成分為瓊脂糖和瓊脂果膠，還含有少量的含氮化合物，及其它有機(jī)雜質(zhì)和不溶性雜質(zhì)。第8頁，共45頁。用瓊脂糖代替瓊脂作為微生物培養(yǎng)基的固化劑. 盡可能使培養(yǎng)基中只含尿素一種含氮化合物，以防止瓊脂中的含氮化合物被以尿素為氮源的細(xì)菌利用，有利于對這類細(xì)菌的篩選。第9頁，共45頁。15.0g瓊脂糖1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO47H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2P

4、O4分離能夠分解尿素的選擇性培養(yǎng)基成分：對培養(yǎng)基的滅菌方法？G6玻璃砂漏斗過濾第10頁，共45頁。怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是分離尿素細(xì)菌判斷該培養(yǎng)基有無選擇性實(shí)驗(yàn)組 對照組培養(yǎng)基類型是否接種目的結(jié)果只生長尿素細(xì)菌生長多種微生物是第11頁，共45頁。選擇培養(yǎng)基第12頁，共45頁。分離土壤中分解尿素的微生物并計(jì)數(shù).篩選菌株.分離出單個菌落并統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目.設(shè)置對照平板劃線法 稀釋涂布法第13頁，共45頁。稀釋涂布平板法原理： 將樣品進(jìn)行稀釋，在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上能形成單個菌落。所形成的一個菌落是由一個單細(xì)胞繁殖而成的，即一個菌落代表原

5、先的一個單細(xì)胞。第14頁，共45頁。實(shí)驗(yàn)的具體操作 .土壤取樣 從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先滅菌好的信封中。取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。.制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基。制備基礎(chǔ)培養(yǎng)基。第15頁，共45頁。應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行三樣品的稀釋第16頁，共45頁。第17頁，共45頁。第18頁，共45頁。第19頁，共45頁。移液槍（微量可調(diào)移液管）第20頁，共45頁。注意事項(xiàng)為使結(jié)果接近真實(shí)值將同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。為了保證

6、結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。第21頁，共45頁。分離不同的微生物采用不同的稀釋度稀釋倍數(shù)目的細(xì)菌104、105、106保證獲得菌落數(shù)在30300之間、適于計(jì)數(shù)的平板放線菌103、104、105真菌102、103、104原因：不同微生物在土壤中含量不同第22頁，共45頁。 實(shí)驗(yàn)中提供的選擇培養(yǎng)基的配方中，尿素是培養(yǎng)基中的惟一氮源，因此，原則上只有能夠利用尿素的微生物才

7、能夠生長。但實(shí)際上，微生物的培養(yǎng)是一個非常復(fù)雜的問題，有些微生物可以利用其他微生物的代謝產(chǎn)物生長繁殖，因此能夠在選擇培養(yǎng)基上生長的微生物不一定是所需要的微生物，還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。第23頁，共45頁。 在實(shí)驗(yàn)中，酚紅作為酸堿指示劑被添加到了培養(yǎng)基中，其變色范圍是pH6.48.2，在酸性情況下呈黃色，堿性情況下呈紅色，這種添加了酸堿指示劑的培養(yǎng)既可以鑒別和分離出能夠產(chǎn)生脲酶分解尿素的微生物，稱為鑒別培養(yǎng)基。 尿素在被脲酶催化分解前是中性的，由于尿素在脲酶的催化下分解產(chǎn)生了NH3，溶液會呈堿性。 第24頁，共45頁。15.0g瓊脂糖1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO47H2O2.1gNa

8、H2PO41.4gKH2PO4分離能夠分解尿素的選擇性培養(yǎng)基成分：鑒別培養(yǎng)基 酚紅第25頁，共45頁。選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基第26頁，共45頁。 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，培養(yǎng)基中將出現(xiàn)紅色環(huán)帶的菌落，說明該細(xì)菌能夠分解尿素。測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細(xì)菌過濾器過濾后，將濾膜放到 伊紅美藍(lán) 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。第27頁，共45頁。大腸桿菌呈 黑色中心 ,有或無金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)上典型特征 第28頁，共45頁。顯微鏡直接計(jì)數(shù)： 利用血球計(jì)數(shù)板，在

9、顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。第29頁，共45頁。第30頁，共45頁。第31頁，共45頁。第32頁，共45頁。第33頁，共45頁。顯微鏡直接計(jì)數(shù)： 不能區(qū)分死菌與活菌； 不適于對運(yùn)動細(xì)菌的計(jì)數(shù)； 需要相對高的細(xì)菌濃度； 個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；缺點(diǎn)第34頁，共45頁。設(shè)置對照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測試因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。設(shè)置對照：第35頁，共45頁。實(shí)例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計(jì)菌 落數(shù)目的實(shí)驗(yàn)時，A同學(xué)從對應(yīng)的106 倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌 落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下 只選擇出大約50個菌落。分析其原因。原因：土樣不同

10、， 培養(yǎng)基污染或操作失誤 (或者是混入了其他的含氮物質(zhì))第36頁，共45頁。小結(jié)：通過這個事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。第37頁，共45頁。結(jié)果分析與評價1.通過對照實(shí)驗(yàn)，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。2.提示：選擇每個平板上長有30300個菌

11、落的稀釋倍計(jì)算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實(shí)驗(yàn)不精確。第38頁，共45頁。六、例題解析 例1對細(xì)菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是A在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行 B至少接種一種細(xì)菌 C接種一個細(xì)菌 D及時補(bǔ)充消耗的營養(yǎng)物質(zhì) 解析：細(xì)菌群體生長規(guī)律的測定是人們在一定條件下進(jìn)行的。這些條件是：一種細(xì)菌、恒定容積的培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基、定時測定細(xì)菌總數(shù)。在這些條件下，才能測定出細(xì)菌的生長規(guī)律。測定時只能用一種細(xì)菌的子細(xì)胞群體的變化規(guī)律表達(dá)微生物的生長；恒定容積是給微生物提供一定的生存環(huán)境；液體培養(yǎng)基才能通過樣品推測細(xì)菌總數(shù)。若接種多種細(xì)菌，則會發(fā)生種間斗爭而不

12、能測定一種微生物的生長規(guī)律。在接種時，要保證一定的接種量。答案：A第39頁，共45頁。例2在微生物群體生長規(guī)律的測定中，種內(nèi)斗爭最顯著最激烈的時期是A調(diào)整期 B對數(shù)期 C穩(wěn)定期 D衰亡期解析：種內(nèi)斗爭是一種生態(tài)因素。種內(nèi)斗爭反應(yīng)了種內(nèi)生物對生存空間和生活資源的爭奪。在生活空間充裕，營養(yǎng)充足的時候，種內(nèi)斗爭的程度是比較低的。隨著微生物個體數(shù)目的增加，每個個體的生存空間越來越少，營養(yǎng)物質(zhì)也越來越少，每個個體對生存空間和資源的爭奪也越來越激烈，種內(nèi)斗爭就越來越激烈。由此可知，在穩(wěn)定期的種內(nèi)斗爭最激烈。在衰亡期，微生物的數(shù)目已經(jīng)開始減少，pH已經(jīng)極度不適于微生物的生存，次級代謝產(chǎn)物積累到很高的程度，這

13、時的微生物的生存斗爭主要是與無機(jī)環(huán)境的斗爭。答案：C第40頁，共45頁。1.對細(xì)菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是（ ） A.在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行 B.至少接種一種細(xì)菌 C.接種一個細(xì)菌 D.及時補(bǔ)充消耗的營養(yǎng)物質(zhì) 2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ） A.培養(yǎng)細(xì)菌 B.培養(yǎng)真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素實(shí)踐訓(xùn)練A CD第41頁，共45頁。4.下列說法不正確的是（ ） A.科學(xué)家從7080度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶 B.統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的5個平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計(jì)值 C.設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測試因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度 D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。5.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（） A.較多的氮源物質(zhì) B.較多的碳源物質(zhì) C.青霉素類藥物 D.高濃度食鹽BC第42頁，共45頁。例3（2005年江蘇）抗生素作為治療細(xì)菌感染的藥物，其高效性和巨大的經(jīng)濟(jì)價值使抗生素工業(yè)經(jīng)久不衰。其中青霉素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用具有劃時代的意義。青霉素發(fā)酵產(chǎn)生青霉素。青霉菌的