220507 5-RACE試劑盒使用手冊(cè)V1.0

1、天凈沙系列CAT#:220507-10低溫運(yùn)輸，-20保存5 RACE試劑盒5 RACE Kit 使用手冊(cè)V1.0江蘇天凈沙基因診斷技術(shù)有限公司網(wǎng)址： HYPERLINK ；電話：400-6005850；電郵：order產(chǎn)品及特點(diǎn)確定基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)是研究基因結(jié)構(gòu)和功能的最重要工作之一，最通用的方法是Frohman發(fā)明Rapid Amplification of cDNA Ends。其用于確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的方法叫5 RACE法，用于確定轉(zhuǎn)錄終點(diǎn)的方法叫3 RACE法。它們是通過PCR快速克隆cDNA末端，在不建立cDNA文庫的前提下，利用已知cDNA序列設(shè)計(jì)引物，通過向mRNA兩端

2、延伸和擴(kuò)增獲得兩個(gè)末端的序列。本試劑盒就是根據(jù)RACE技術(shù)開發(fā)的確定mRNA 5末端的試劑盒，其原理如下：本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)：即開即用，客戶只需要準(zhǔn)備總RNA（或mRNA）和專一性引物，不需要單獨(dú)準(zhǔn)備其他試劑。反應(yīng)條件經(jīng)過精心優(yōu)化，不需要用戶辛苦摸索條件。本產(chǎn)品足夠10次5RACE實(shí)驗(yàn)。規(guī)格及成分本產(chǎn)品使用10孔盒包裝成分編號(hào)規(guī)格包裝材料MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶-RI混合液220507a20 L0.5mL紅蓋管MMLV Buffer-dNTP混合液220507b60 L0.5mL本色蓋微量核酸沉淀劑220313400 L0.5mL綠蓋管2TdT Buffer（含dATP）220507c200 L0.5

3、mL黃蓋管TdT（末端轉(zhuǎn)移酶）220507d10 L0.5mL紅蓋管2PCR MasterMix9908051mL21.5mL紅蓋管5RACE引物A-引物B混合液Yw220507ab200 L0.5mL白蓋管5RACE引物CYw220507c200 L0.5mL綠蓋管RNase-Free水9804031 mL1.5mL藍(lán)蓋管使用手冊(cè)220507sc1份無自備試劑mRNA（或總RNA）、基因?qū)Ｒ恍砸顰、B、C、75%乙醇。注意：自備的基因?qū)Ｒ恍砸顰，B，C的相對(duì)位置必須跟本手冊(cè)產(chǎn)品介紹中的示意圖一致。運(yùn)輸及保存低溫運(yùn)輸、-20保存、有效期一年。使用方法變性模板RNA：將1 g mRNA或5

4、g 總RNA加入到一個(gè)RNase-free的塑料管中，補(bǔ)RNase-Free水到10L，65保溫5分鐘打開RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)后短暫離心，立即放冰上待用。如果RNA濃度偏低，加RNase-Free水之前體積就已超過10L,則需要使用核酸濃縮劑（需另購(gòu)）濃縮到所需的體積。在塑料管中按順序加入：2L自備的基因?qū)Ｒ恍砸顰（濃度為10 M），6 L MMLV Buffer-dNTP混合液，2 L MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶-RI混合液，總體積為20 L，輕柔吹打混勻。37保溫60分鐘，42保溫30分鐘，50保溫10分鐘，最后75保溫10分鐘使逆轉(zhuǎn)錄酶變性，短暫離心5秒后待用。在塑料管中加入40L微量核酸沉淀劑（含

5、不溶的核酸助沉劑，用前需要充分搖勻再取用），震蕩混勻。室溫12000 rpm離心15分鐘，沉淀即為cDNA。小心吸棄上清。此步沉淀可以去除多余的dNTP，它們會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的TdT加尾反應(yīng)。加入1mL 自備75%乙醇，室溫12000 rpm離心5分鐘，小心吸棄上清。此步洗滌可以洗去逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中殘留的dNTP，它們會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的TdT加尾反應(yīng)。短暫離心數(shù)秒，小心吸棄殘留液體（約50L），晾干2分鐘。加入20 L RNase-free水，充分吹打溶解cDNA沉淀。注意：為保證加尾效率，溶解cDNA的RNase-free水最好不要超過20 L，否則cDNA模板濃度太稀。在兩個(gè)塑料離心管中按下表設(shè)置

6、加尾反應(yīng)：成分加尾樣品管加尾陰性對(duì)照管cDNA溶液（上步所得）9 L9 L2TdT Buffer（含dATP）10 L10 LRNase-Free水不加1 LTdT酶1 L不加37保溫15分鐘進(jìn)行加尾反應(yīng)，然后75保溫3分鐘滅活末端轉(zhuǎn)移酶。在兩個(gè)反應(yīng)管中各加入0.5 mL RNase-free水稀釋樣品，此250倍稀釋液將作為下步PCR的模板。第一輪PCR：按下表分別使用不同體積的樣品稀釋液設(shè)置四個(gè)50uL的PCR反應(yīng)，客戶還需要按下表設(shè)置四個(gè)以陰性對(duì)照稀釋液做模板的PCR反應(yīng)，只是將表中的樣品管稀釋液改成陰性對(duì)照稀釋液。共8個(gè)PCR樣品。成分梯度1梯度2梯度3梯度4PCR MasterMix

7、25uL25uL25uL 25uL自備基因?qū)Ｒ恍砸顱（10 M）2.5uL2.5uL2.5uL2.5uL5 RACE引物A-引物B混合液2.5uL 2.5uL2.5uL2.5uL樣品管稀釋液1uL5uL10uL15uLRNase-free水19uL15uL10uL5uL按下列條件進(jìn)行PCR（注：應(yīng)根據(jù)自備引物的Tm值選擇適當(dāng)?shù)耐嘶饻囟龋旅娴膮?shù)僅僅供參考）。第1次循環(huán)：94 5分，48-52 2分，72 4分第2-30次循環(huán)：94 40秒，52-60 1分，72 3分最后延伸：72 15分直接取20L PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢查PCR結(jié)果(樣品組4個(gè)樣，陰性對(duì)照組4個(gè)樣)。如果樣品有一條清晰的擴(kuò)增條帶，并且陰性對(duì)照在相應(yīng)的位置沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，則可以不做后續(xù)的第二輪PCR，直接進(jìn)行DNA測(cè)序或切膠克隆。如樣品沒有任何一條清晰的擴(kuò)增條帶，則進(jìn)入第二輪PCR。第二輪PCR：從8管PCR產(chǎn)物中各取1L分別加入到20 L RNase-free水中進(jìn)行稀釋20倍，再各取1 L分別作為第二輪PCR的模板，再加入25L PCR MasterMix，2.5 L5 RACE引物C，2.5 L自備基因?qū)Ｒ恍砸顲（10 M），補(bǔ)水到共50 L 。按下列條件進(jìn)行PCR：第1