臨床病例分析模板

1、題名頁地震后危重多發(fā)傷伴混合感染病例分析張山，李思，王文武XX大學(xué)，上海200032基金項(xiàng)目：國家高新技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（2009ZZ06）第一作者：張山，詳細(xì)聯(lián)系方式（電話、E-mail）通信作者：王文武，詳細(xì)聯(lián)系方式（電話、E-mail）地震后危重多發(fā)傷伴混合感染病例分析張山，李思，王文武XX大學(xué),上海200032摘要：為證實(shí)乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）3022nt-1787nt缺失突變體編碼蛋白TSX（源于DNA聚合酶讀碼框架，s為部分缺失的spacer區(qū)，X為截短的X蛋白）具有抗a干擾素（IFN-a）作用并確定其功能區(qū)域，首先以聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增獲得TS

2、X全長及片段TS（含TP區(qū)及部分缺失的spacer區(qū)），并克隆于pcDNA3.1/HisC載體。重組載體及空載體pcDNA3.1/HisC給予終濃度為100IU/ml的IFN-a2a刺激，作用24h后裂解細(xì)胞，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測胞內(nèi)氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶（CAT）含量。結(jié)果顯示，與空白載體相比，隨著TSX及TS重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染量的遞增，Huh7胞內(nèi)CAT值逐漸降低（n=6,Pv0.05）,但TSX與TS之間無顯著差異（n=6,P0.05）。本研究證實(shí)HBV3022nt-1787nt缺失突變體編碼的TSX蛋白可抑制Huh7細(xì)胞對(duì)IFN-a的反應(yīng)性，其活性與其N端TP及部分缺失的Spa

3、cer區(qū)有關(guān)。關(guān)鍵詞：海分枝桿菌；轉(zhuǎn)座子突變；斑馬魚；肉芽腫基金項(xiàng)目：國家高新技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（2009ZZ06）通信作者：王文武Correspondingautor.WANGWenwu,E-mail: HYPERLINK mailto: CasesanalysisofseveremultipletraumawithmixedinfectionsamongearthquakevictimsZHANGShan,LISi,WANGWenwuXXUniversity,Shanghai200032,ChinaAbstract：Thepurposeofthecurrentstudyistoinvesti

4、gatetheanti-IFN-aeffectsandtodeterminethefunctionalregionofthenovelproteinTSXencodedbythe3022nt-1787ntdeletionmutantofhepatitisBvirus(HBV).RegionscodingforTSX(inframewiththeopeningreadingframeofDNApolymerase,inwhichTstandsforterminalprotein,Sforpartiallydeletedspacerregion,andXfortruncatedXprotein)a

5、ndTS(N-terminalofTSXcontainingterminalproteinandpartiallydeletedspacerregion)wereamplifiedbymeansofPCRandclonedintothepcDNA3.1/HisCvectorseparately.TherecombinantvectorwastransfectedintoHuh7hepatocytesindividuallybyFuGENE6transfectionreagent,andtheexpressionofthefusionproteinwasverifiedbyWesternblot

6、analysis.Therecombinantoremptyvectorwasco-transfectedtoHuh7hepatocyteswithIFN-aresponsereporterplasmidp6-16CATatthemolarratioof5:1,10:1,15:1and30:1,cellsweretreatedwithIFN-a2a48hourspost-transfection.After24hoursofstimulation,thecellswerelysedandtheintracellularCATvaluewascalculatedbyELISAassay.Ther

7、esultsdemonstratedthat,ascomparedtotheemptyvector,theintracellularCATvaluesweregraduallyreducedasparalleledwithanincreasingamountofTSXorTSrecombinant(n=6,pv0.05),whilenosignificantdifferenceswereobservedbetweenthem(n=6,pv0.05).ItwasconcludedthatthenovelproteinTSXencodedbythe3022nt-1787ntdeletionmuta

8、ntofHBVsuppressedtheresponseofHuh7hepatocytestoIFN-a，andtheN-terminalregionwasafunctionaldomainforitsanti-IFN-aeffects.Keywords：Mycobacteriummarinum;Transposon;Zebrafish;Granuloma長久以來，分枝桿菌的細(xì)胞壁被認(rèn)為是其致病性中的重要部分，他不僅可以幫助結(jié)核菌抵抗多種惡劣的理化及宿主體內(nèi)環(huán)境，有利于結(jié)核菌抵抗大多數(shù)常用的抗生素，而且已證實(shí)多種細(xì)胞壁成分與其毒力密切相關(guān)1,2。此外，多種的抗結(jié)核藥物，如異煙肼和乙胺丁醇，作用

9、的靶位點(diǎn)位于細(xì)胞壁的代謝通路3。因此研究分枝桿菌細(xì)胞壁中與毒力相關(guān)的成分有可能為開發(fā)新的抗結(jié)核藥提供新靶點(diǎn)，為發(fā)展新的預(yù)防結(jié)核病的疫苗提供新線索。本研究利用噬菌體MycoMarT7轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)建立了海分枝桿菌的隨機(jī)突變庫，以菌落形態(tài)及索狀結(jié)構(gòu)的改變?yōu)楹Y選標(biāo)志獲得了3個(gè)mas同源基因的插入突變株，并探討了其致病性。流行性乙型腦炎(epidemicencephalitistypeB)是由乙型腦炎病毒引起的以腦實(shí)質(zhì)炎癥為主要病變的中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性傳染病，又稱日本乙型腦炎1。臨床上多以急性起病、高熱、意識(shí)障礙、抽搐、呼吸衰竭、腦膜刺激征為主要表現(xiàn)。為提高臨床醫(yī)師對(duì)該疾病的認(rèn)識(shí)，我們對(duì)本院20052008

10、年收治住院的30例乙型腦炎患者流行病學(xué)及臨床特征進(jìn)行回顧性分析。1臨床材料1.1病例患者，男性，78歲，農(nóng)民。間斷性咳嗽、咳痰4年，加重1個(gè)月，于2008年10月13日入住甘肅省蘭州市肺科醫(yī)院。痰標(biāo)本編號(hào)：866?；颊咦允?年前開始每遇天氣轉(zhuǎn)涼即出現(xiàn)咳嗽，咳白色黏液性痰，并伴氣短，多次于外院就診，診斷為“慢性支氣管炎，肺心病”。給予抗炎利痰對(duì)癥治療后，癥狀緩解。否認(rèn)服用抗結(jié)核藥。入院前1個(gè)月上述癥狀逐漸加重，對(duì)癥治療，療效欠佳。入院時(shí)查體：腋下體溫36C,心率80次/min,血壓155/95mmHg。神志清，精神欠佳，體形正常，扶入病房。咽部無充血，扁桃體無腫大，雙側(cè)呼吸動(dòng)度減弱叩診過清音，雙

11、肺呼吸音粗，肺底可聞及細(xì)濕羅音。腹平軟，無壓痛反跳痛，肝脾不大。血常規(guī)檢查：白細(xì)胞2.9X109/L,淋巴細(xì)胞絕對(duì)值0.8X109/L,紅細(xì)胞6.55x10i2/L,血紅蛋白含量208g/L，平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量31.7pg。生化檢查：谷丙轉(zhuǎn)氨酶57u/L,谷草轉(zhuǎn)氨酶41u/L，谷草轉(zhuǎn)氨酶/谷丙轉(zhuǎn)氨酶0.7，載脂蛋白A0.94g/L,載脂蛋白B1.18g/L,乳酸脫氫酶260u/L,腺苷脫胺酶31u/L,轉(zhuǎn)鐵蛋白6.08g/L,岸微球蛋白3.3mg/L。胸水生化顯示總蛋白52g/L,腺苷脫胺酶64g/L,轉(zhuǎn)鐵蛋白1.26g/L。胸水涂片見大量散在的淋巴細(xì)胞。胸水中甲胎蛋白0.83ng/ml、

12、癌胚抗原0.58ng/m1、腫瘤相關(guān)因子18.78u/ml。入院后常規(guī)痰檢示痰涂片抗酸桿菌陰性。胸部計(jì)算機(jī)斷層掃描(computedtomography，CT)顯示：雙肺間質(zhì)紋理增重，肺內(nèi)散布片絮狀高密度灶,伴雙側(cè)胸腔積液,縱隔可見鈣化的淋巴結(jié),左心室增大。入院診斷為肺心病。肺部有炎癥，給予左氧氟沙星0.4g/d,靜脈點(diǎn)滴1周；頭抱他啶2g/d,靜脈點(diǎn)滴1d；診斷性抗癆治療(對(duì)氨基水楊酸異煙肼片0.3g,每天1次；利福平0.45g,每天1次；乙胺丁醇0.75g,每天1次)和對(duì)癥支持治療，15d后癥狀好轉(zhuǎn)出院。1.2材料和方法1.2.1主要試劑Middlebrook7H9(8X07131)、Mi

13、ddlebrookMGIT-960液體培養(yǎng)基購于美國BD公司，小牛血清組分v(A8020)和過氧化氫酶(C8070)購于瑞士羅氏制藥公司，基因組提取試劑盒(N9021)購于東盛生物有限公司，DNASTAR聚合酶和膠回收試劑盒購于TaKaRa,TaqDNA聚合酶為美國Fermentas公司產(chǎn)品，雞蛋為正大鮮雞蛋。1.2.2顯微鏡鏡檢取患者晨起漱口后咳出深部的痰做檢查?？顾崛旧簩⑻低科?加熱固定,堿性石炭酸復(fù)紅初染,3%鹽酸酒精脫色,亞甲基藍(lán)復(fù)染,干燥后光學(xué)顯微鏡下鏡檢。革蘭染色：將痰涂片，自然干燥，結(jié)晶紫初染，碘液媒染，95%乙醇脫色,稀釋復(fù)紅復(fù)染,干燥后光學(xué)顯微鏡下鏡檢8。1.2.3痰標(biāo)本的

14、細(xì)菌培養(yǎng)取患者晨起漱口后咳出深部的痰做標(biāo)本，經(jīng)消化、離心、棄上清液后加入適量磷酸緩沖液(phosphate-bufferedsaline,PBS)，重懸、沉淀，取300“分別接種于MiddlebrookMGIT7H9液體、含蔗糖的7H9(7H9-L)半固體、不含蔗糖的Middlebrook7H9(7H9-B)半固體、含氯化鈉的92-3TB(92-3TB-L)液體和不含氯化鈉的92-3TB(92-3TB-B)液體培養(yǎng)基9及羅氏(Lownstein-Jenson,L-J)培養(yǎng)基中，37C靜置培養(yǎng)。1.2.4細(xì)菌回復(fù)實(shí)驗(yàn)將該菌株培養(yǎng)至呈煎蛋樣生長的L型細(xì)菌，接種于羅氏培養(yǎng)基或7H9-B半固體培養(yǎng)基，

15、觀察細(xì)菌生長狀況及形態(tài)改變。1.2.5掃描電鏡觀察刮取培養(yǎng)的菌落置于1.5ml的Eppendorf管中，加入3%磷酸戊二醛固定過夜，在蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心電鏡室處理并掃描電鏡觀察。2結(jié)果痰標(biāo)本經(jīng)培養(yǎng)，在92-3TB-L液體培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，表明有細(xì)菌生長。在7H9-L半固體含蔗糖培養(yǎng)基中有油煎蛋樣的菌落出現(xiàn)?？顾崛旧梢娍顾崛旧幮?、大小不等、圓形或短桿狀的細(xì)菌。在羅氏培養(yǎng)基和7H9-B中傳代培養(yǎng)2代后，可見有少量細(xì)菌回復(fù)為抗酸染色弱陽性桿狀菌（圖1）。革蘭染色可見紫紅色桿狀菌（圖2D）。掃描電子顯微鏡下可見傳代培養(yǎng)后菌落呈團(tuán)塊狀生長，菌體呈桿狀。PCR產(chǎn)物擴(kuò)增16SrRNADNA的測序結(jié)果與支

16、氣管戈登菌DSM43247相似性100%（圖2）,可見從該患者痰液中分離培養(yǎng)出支氣管戈登菌的L型細(xì)菌。藥敏實(shí)驗(yàn)顯示，該細(xì)菌對(duì)利福平、利福噴丁、阿莫西林、左氧氟沙星和克拉霉素敏感，對(duì)異煙肼、吡嗪酰胺乙胺丁醇、對(duì)氨基水楊酸、甲硝唑和呋喃唑酮耐藥（圖3、表1）。3討論在結(jié)核分枝桿菌中，pps位點(diǎn)（包括fadD26至fadD28的全部基因，見圖3）45kb的大片段與PDIM的合成密切相關(guān)。3.1流行病學(xué)特征目前全世界乙型腦炎每年發(fā)病約50000例，其中約1/3死亡，存活者20%30%有神經(jīng)麻痹和心理改變等嚴(yán)重后遺癥。乙型腦炎主要經(jīng)蚊蟲叮咬及吸血傳播，傳播媒介是生活在水稻田、沼澤地里的雌性蚊蟲（國內(nèi)的主

17、要傳播媒介為三帶喙庫蚊），故乙型腦炎一般夏、秋季多發(fā)，集中在79月份，占全年病例的90%以上3。臨床特點(diǎn)乙型腦炎臨床表現(xiàn)主要有急性起病，中高熱，頭痛，嘔吐，意識(shí)障礙，肌力、肌張力異常，腦膜刺激征、病理征陽性。重型或極重型可并發(fā)肺炎、呼吸循環(huán)衰竭、上消化道出血而死亡。治療和預(yù)防對(duì)于乙型腦炎目前尚無特效抗病毒藥物，對(duì)癥及營養(yǎng)支持治療是決定搶救成功的關(guān)鍵。高熱可予以物理降溫，如溫水或酒精擦浴。驚厥或抽搐時(shí)應(yīng)及時(shí)吸痰，保持呼吸道通暢；并進(jìn)行脫水，降低顱內(nèi)壓力。一旦發(fā)生呼吸衰竭，應(yīng)及時(shí)給予呼吸興奮劑，必要時(shí)應(yīng)用呼吸機(jī)進(jìn)行人工輔助呼吸。本研究中10例患者未進(jìn)行過預(yù)防接種，15例既往是否接種乙型腦炎疫苗情況

18、不詳，提示人群對(duì)接種乙型腦炎疫苗意識(shí)不強(qiáng)，故疾病控制部門應(yīng)在流行季節(jié)來臨前加強(qiáng)宣傳教育，提高預(yù)防接種率。參考文獻(xiàn)DaffeM,EtienneG.ThecapsuleofMycobacteriumtuberculosisanditsimplicationsforpathogenicityJ.TuberLungDis,1999,79(3):153-169.StammLM,BrownEJ.Mycobacteriummarinum:thegeneralizationandspecializationofapathogenicmycobacteriumJ.MicrobesInfect,2004,6(15

19、):1418-1428.羅云.安全科學(xué)理論體系的發(fā)展及趨勢探討M.見：白春華，何學(xué)秋，吳宗之.21世紀(jì)安全科學(xué)與技術(shù)的發(fā)展趨勢北京：科學(xué)出版社，2000：1-5.GlickmanMS,CoxJS,JacobsWRJr.Anovelmycolicacidcyclopropanesynthetaseisrequiredforcording,persistence,andvirulenceofMycobacteriumtuberculosisJ.MolCell,2000,5(4):717-727.JacobsWRJr,BarlettaRG,UdaniR,ChanJ,KalkutG,SosneG,Ki

20、eserT,SarkisGJ,HatfullGF,BloomBR.RapidassessmentofdrugsusceptibilitiesofMycobacteriumtuberculosisbymeansofluciferasereporterphagesJ.Science,1993,260(5109):819-822.Colonialmorphologyofthewild2typestrain,whileBisthecolonialmorphologyofthetransposoninsertingmutant02C10(ImagetakenwithaCanonEOF100).圖1海分枝桿菌在固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1ThecolonialmorphologyofM.marinumonsolidmediumA:fliGmutant;B:Wlidtypestrain.圖2空腸彎曲菌fliG突變株小鼠空腸定植能力改變Fig.2ChangeofcolonizationabilityonmousejejunuminC.jejunifliGmutantGrowthofM.marinuminJ774A.1cellcultures1.3+061.3+051.3+041.3+031.3+021.3+011.3+000day2day4d