臨床檢驗技士-免疫學和免疫2017全1、講義

1、第六章 沉淀反應沉淀反應是指可溶性抗原與相應抗體在特定條件下發(fā)生特異性結合時出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。第一節(jié) 沉淀反應的特點沉淀反應中的抗原多為蛋白質、多糖、沉淀反應分兩個階段，、毒素等可溶性物質。第一階段為抗原抗體發(fā)生特異性結合，幾秒到幾十秒即可完成，出現(xiàn)可溶性小的復合物，肉眼不可見；第二階段為形成可見的免疫復合物，約需幾十分鐘到數小時才能完成，如沉淀線、沉淀環(huán)。第二節(jié) 液體內沉淀試驗一、絮狀沉淀試驗抗原抗體溶液在電解質的存在下結合，形成絮狀沉淀物，這種絮狀沉淀受抗原和抗體比例的直接影響，因此常用來作為測定抗原抗體反應最適比例的方法，常見類型有：（一）抗原稀釋法（二）抗體稀釋法抗原進行一系列稀釋與恒定

2、濃度抗反應?？贵w進行一系列稀釋與恒定濃度抗原反應。方陣滴定法即棋盤滴定法。（陣滴定法二、免疫濁度測定屬于液體內沉淀反應，其特點是將現(xiàn)代光學測量儀器與自動化檢測系統(tǒng)相結合應用于沉淀反應，可進行液體中微量抗原、抗體及小分子半抗原定量檢測。（一）免疫比濁測定的影響1.抗原抗體的比例 是濁度形成的關鍵。當抗原過量時，形成的 IC 分子小，而且會發(fā)生再解離，使?jié)岫确炊陆?，光散射亦減少，這就是高劑量鉤狀效應。當抗體過量時，IC 的形成隨著抗原遞增而增加，至抗原、抗體最適比例處達最經典的海德堡曲線理論。在反應體系中保持抗體適當過量，如形成抗原過量則造成測定的準確性降低。2.抗體的質量 對免疫比濁測定法的抗

3、體要求特異性強效價高，這就是（3）親和力強：則抗體的活性高，不僅可以加快抗原抗體反應的速度，而且形成的 IC 較牢固，不易發(fā)生解離。在速率比濁法中尤為重要。（4）R 型和 H 型抗體：根據抗來源的動物種類不同，分為 R 型抗體和 H 型抗體。R 型抗體是指以家兔為代表的小型動物被注射抗原免疫后強，抗原抗體結合后不易發(fā)生解離。的抗。這類抗的特點是親和力較H 型抗體是指以后極易解離。代表的大型動物注射抗原后的抗，這類抗的親和力弱，抗原抗體結合3.抗原抗體反應的溶液反應液最適為 6.58.5，否則不易形成 IC，甚至可引起 IC 解離。在一定范圍內，離子強度大，IC 形成越快；離子的種類也可影響 I

4、C 的形成。一般常使用磷酸鹽緩沖液作為免疫比濁法的反應液。4.增濁劑某些非離子型親水劑對促進 IC 的形成有顯著的增強作用，如聚乙二醇（PEG）、吐溫-20，其作用是消除蛋白質（抗原或抗體）分子周圍的電子云和水化層，促進抗原、抗體分子靠近，結合形成大分子復合物。（二）免疫比濁法方法分類透射免疫比濁法物。免疫膠乳比濁法的靈敏度。散射免疫比濁法通過檢測光被吸收、衍射、反射和折射后光線減弱的變化，來定量抗原抗體的復合是以膠乳作為載體對小分子免疫復合物進行微量測定，進一步提高了免疫濁度測定通過檢測光折射和衍射而形成的散射光強度來定量抗原抗體的復合物。該法根據抗原抗體反應的時間和反應結合的動力學，又可分

5、為終點散射比濁法、固定時間散射比濁法和速率散射比濁法。（三）免疫比濁法應用血液、體液中蛋白質的測定如免疫球蛋白 IgG、IgA、IgM、補體 C3、補體 C4、血漿蛋白（前白蛋白、-抗胰蛋白酶、-酸性糖蛋白、2-巨球蛋白、血漿銅藍蛋白、結合球蛋白、轉鐵蛋白）。尿微量蛋白系列和半抗原（如激素、毒物和各種治療性藥物）。（四）免疫比濁法優(yōu)點穩(wěn)定性好敏感度高（達 ng/L）精確度高（CV5%）簡便快速，易于自動化無放射性核素污染，適合于大批量標本的檢測第三節(jié) 凝膠內沉淀試驗利用可溶性抗原和相應抗體在凝膠內擴散，形成濃度梯度，在抗原與抗體濃度比例恰當的位置形成肉眼可見的沉淀線或沉淀環(huán)。凝膠支持物的種類有

6、瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝膠等。不同分子量的物質在凝膠中擴散速度不同，借此可用以識別不同待測物分子量的差別。一、單向擴散試驗在瓊脂內混入抗體，待測抗原從局部向瓊脂內擴散，如抗原和相應抗體結合，則形成沉淀環(huán)。（一）試管法 將一定量的抗體混入 0.7%瓊脂糖溶液中，注入小試管內，上層加抗原溶液使待測抗原在凝膠中擴散，在抗原抗體比例恰當位置形成沉淀環(huán)。較少采用。（二）平板法 是將抗體或抗混入 0.9%瓊脂糖凝膠內，未凝固前傾注成平板，然后在上打孔，將抗原加入，放 37讓其擴散，2448 小時后可見孔周圍出現(xiàn)沉淀環(huán)，測定環(huán)的直徑或面積計算標本中待測抗原的濃度。有兩種計算方法：Mancini 曲

7、線 適用大分子抗原和長時間擴散（48 小時）的結果，沉淀環(huán)直徑的平方（d2）與抗原濃度（c）呈線性關系：c/d2k。Fahey 曲線 適用于小分子抗原和較短時間擴散的結果處理，用半對數紙畫線，濃度對數 logc 與擴散環(huán)直徑（d）呈線性關系：lo（三）影響k（其中 c 為抗原濃度，d 為沉淀環(huán)直徑，k 為常數）。1.抗必須特異性強、效價高、親和力強，在良好條件下保存。2.每次測定都必須作標準曲線。3.每次測定時必須用質控作質控。4.注意雙環(huán)現(xiàn)象（出現(xiàn)了兩種抗原性相同成分）。二、雙向擴散試驗雙向擴散試驗是讓抗原和抗體在瓊脂中各自方擴散，在比例恰當之處形成沉淀線，沉淀線的位置、形狀以及對比關系，可

8、對抗原或抗體進行定性分析。雙向擴散試驗簡單易行，用途廣泛，但該技術靈敏度低，出現(xiàn)結果慢，不能精確定量，這些弱點在相當程度上限制了它的應用。根據試驗形式可分為試管法和平板法兩種。（一）試管法（二）平板法 是鑒定抗原抗體的最基本、最常見的方法之一。根據沉淀線的有無、形態(tài)和位置可作如下分析：1.抗原或抗體的存在與否以及相對含量的估計沉淀線如果靠近抗原孔，則表示抗體含量較大；沉淀線如果靠近抗體孔，則表示抗原含量較大；不出現(xiàn)沉淀線則表明無對應的抗體（抗原）或者抗原過量。2.抗原或抗體相對分子量的分析（1）抗原或抗體在瓊脂內擴散，其速度受分子量的影響。分子量小者擴散快，反之則較慢。（2）由于慢者擴散圈小，

9、局部濃度則較大，形成的沉淀線彎向分子量大的一方；如果兩者分子量大致相等，則形成直線。3.抗原性質的分析兩條沉淀線互相吻合相連，表明抗體與兩個抗原中的相同表位結合而沉淀，兩個抗原相同；沉淀線呈部分相切，說明兩個抗原之間有部分相同；（3）兩條沉淀線交叉而過，說明兩個抗原完全不同。4.抗體效價的滴定雙向擴散試驗是抗皆作不同的稀釋，經過抗體效價滴定的常規(guī)方法。固定抗原的濃度，稀釋抗體；或者抗原和抗體雙方擴散，形成沉淀線，以出現(xiàn)沉淀線最高的抗體稀釋度為該抗體的效價。5.抗原或抗體純度鑒定用混合抗原或抗體鑒定抗體或抗原，出現(xiàn)一條沉淀線說明待測抗原或抗體純，出現(xiàn)多條沉淀線說明不 純。雙向擴散試驗簡單易行，用

10、途廣泛，但該技術靈敏度低，出現(xiàn)結果慢，不能精確定量，這些弱點在相當程度上限制了它的應用。第四節(jié) 免疫電泳技術電泳分析與沉淀反應的結合產物。一、優(yōu)點（一）加快了沉淀反應的速度；（二）電場規(guī)定了抗原抗體的擴散方向，使其集中，提高了靈敏度；（三）可將某些蛋白組分根據其帶電荷的不同而將其分開，再分別與抗體反應。本法既具有抗原抗體反應的高度特異性，又具有電泳技術的高分辨率和快速、微量等特性，因此其應用范圍日益擴大。隨著實驗技術的不斷發(fā)展，免疫電泳技術逐步發(fā)展為對流免疫電泳、火箭免疫電泳、免疫電泳、免疫固定電泳等多項實驗技術，廣泛用于科學研究和臨床實驗分析。二、對流免疫電泳 雙向免疫擴散與電泳相結合的定向

11、加速的免疫擴散技術。在8.6 緩沖液中，大多蛋白質帶強負電荷，在電場中向正極移動；而 IgG 等電點偏高（ 67），在 8.6 時帶負電荷較少，且分子量較大，移動速度慢，故向正極移動緩慢甚至不移動。在凝膠的電滲作用下，隨水流向負極，電滲引向負極移動的液流速度超過了 IgG 向正極的移動速度，因此抗體移向負極，在抗原抗體最適比處形成沉淀線。三、火箭免疫電泳單向免疫擴散與電泳相結合的一項定量檢測技術，實質上是加速的單向擴散試驗。實驗時，將抗體混合于瓊脂中，樣品的抗原置于負，電泳時抗體不移動，抗原向正極泳動，隨著抗原量的逐漸減少，抗原泳動的基底區(qū)越來越窄，抗原抗體分子復合物形成的沉淀線逐漸變窄，形成

12、一個形狀如火箭的不溶性復合物沉淀峰。當瓊脂中抗體濃度固定時，峰的高度與抗原量呈正相關，因此用已知標準抗原作對照，抗原濃度為橫坐標，峰的高度為縱坐標，繪制標準曲線，待測樣品濃度就可根據沉淀峰的高度在標準曲線中計算獲得。四、免疫電泳區(qū)帶電泳與免疫雙擴散相結合的一種免疫分析技術，為定性試驗。先用區(qū)帶電泳技術將抗原在凝膠中電泳，分成肉眼不可見的若干區(qū)帶，電泳停止后，沿電泳方向挖一與之平行的抗體槽，加入相應抗，置室溫 37作雙向擴散，經 1824 小時后，已分離成區(qū)帶的各種抗原成分與抗體槽中相應抗體在兩者比例適合處形成弧形沉淀線。免疫電泳所需擴散時間長，沉淀線的數目和分辨率又受許多影響，且結果較難分析，

13、必須積累經驗，才能作出恰當的結論。免疫電泳為定性試驗，目前主要應用于純化抗原和抗體成分的分析及正常和異常免疫球蛋白的識別與鑒定方面，例如多發(fā)性骨髓瘤患者在免疫電泳后，可觀察到異常的 M 蛋白沉淀弧。五、免疫固定電泳可用于各種蛋白質的鑒定。該方法原理是先將待檢樣品在凝膠板上作區(qū)帶電泳，將蛋白質分離成不同區(qū)帶，然后在其上覆蓋抗，當抗與某區(qū)帶中的單克隆免疫球蛋白結合，便形成抗原抗體復合物而沉淀。最后通過漂洗和染色，并與蛋白質參考泳道對照分析，可對各類免疫球蛋白及其輕鏈進行分型。本法可用于遷移率近似的蛋白和 M 蛋白的鑒定與分型，免疫球蛋白輕鏈，尿液中的本-周蛋白檢測及、 分型，腦脊液中寡克隆蛋白的檢

14、測及分型，鑒定游離輕鏈，補體裂解產物等。免疫固定電泳最大的優(yōu)勢是分辨率強，敏感度高，操作周期短，僅需數小時，結果易于分析。六、交叉免疫電泳將區(qū)帶電泳和火箭免疫電泳相結合的免疫電泳分析技術。是一種有效的抗原蛋白定量技術，可一次同時對多種抗原定量。分辨率較高，有利于各種蛋白組分的比較，對于蛋白質遺傳多態(tài)性、微小異質性、蛋白質裂解產物和不正常片段等進行定性分析。（14 題共用A.帶現(xiàn)象 B.前帶 C.后帶 D.等價帶E.拖尾現(xiàn)象）1.沉淀反應中抗原過量的現(xiàn)象稱為正確C沉淀反應中抗原過量的現(xiàn)象稱為后帶。2.沉淀反應中抗體過量的現(xiàn)象稱為正確B沉淀反應中抗體過量的現(xiàn)象稱為前帶。3.沉淀反應的反應曲線中，抗

15、原抗體分子比例合適的范圍稱為正確D沉淀反應的反應曲線中，抗原抗體分子比例合適的范圍稱為等價帶。4.沉淀反應的反應曲線中，抗原或抗體極度過剩而引起無沉淀物形成的現(xiàn)象稱為正確A沉淀反應的反應曲線中，抗原或抗體極度過剩而引起無沉淀物形成的現(xiàn)象稱為帶現(xiàn)象。沉淀反應的抗原是A.顆粒性抗原 B.可溶性抗原 C.半抗原D.超抗原E.致敏抗原正確B沉淀反應是指可溶性抗原與相應抗體在特定條件下發(fā)生特異性結合時出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。關于免疫濁度法測定錯誤的是A.反應液中抗體過量 B.反應液中抗原過量C.反應液中抗原、抗體比例合適 D.常用聚乙二醇等增濁劑E.通常用磷酸鹽反應液正確B當抗原過量時，形成的 IC 分子小，而

16、且會發(fā)生再解離，使?jié)岫确炊陆担馍⑸湟鄿p少這就是高劑量鉤狀效應。下列有關沉淀反應第一階段的說法，錯誤的是A.抗原抗體的特異性結合 B.幾秒鐘至幾分鐘內即完成C.可用散射比濁測定反應結果D.出現(xiàn)肉眼可見的沉淀線或沉淀環(huán) E.肉眼見不到免疫復合物正確D沉淀反應分兩個階段，第一階段為抗原抗體發(fā)生特異性結合，幾秒到幾十秒即可完成，出現(xiàn)可溶性小的復合物，肉眼不可見；第二階段為形成可見的免疫復合物，約需幾十分鐘到數小時才能完成，如沉淀線、沉淀環(huán)。免疫沉淀反應常用于顆粒性抗原檢測抗原抗體的結合瞬間肉眼可見 C.用于可溶性抗原的檢測D.不能用于定量檢測E.可不考慮抗原抗體的比例正確C免疫沉淀反應用于可溶性抗

17、原的檢測。關于單向擴散實驗錯誤的是 A.需先將抗原混入瓊脂內 B.有試管法和平板法C.需先將抗體混入瓊脂內 D.可用于定量檢測E.抗原抗體的比例合適處形成沉淀環(huán)正確A單向擴散試驗是在瓊脂內混入抗體，待測抗原從局部向瓊脂內擴散，如抗原和相應抗體結合，則形成沉淀環(huán)。有試管法和平板法。通過觀察雙向瓊脂擴散試驗的結果，不能解決A.是否存在相應的抗原或抗體 B.抗原和抗體相對含量的估計 C.抗原和抗體相對分子量的分析 D.判斷兩種抗原的性質是否相同E.抗體濃度的確定是正確E雙向擴散試驗是讓抗原和抗體雙方都在瓊脂中各自方擴散，在比例恰當之處形成抗原抗體沉淀線，觀察這種沉淀線的位置、形狀以及對比關系，可對抗

18、原或抗體進行定性分析。根據試驗形式也可分為試管法和平板法兩種。（一）試管法（二）平板法 是鑒定抗原抗體的最基本、最常見的方法之一。根據沉淀線的有無、形態(tài)和位置可作如下分析：抗原或抗體的存在與否以及相對含量的估計。抗原或抗體相對分子量的分析?？乖再|的分析?？贵w效價的滴定。抗原或抗體純度鑒定。免疫電泳的影響A.電場強度 B.溶液C.離子強度 D.抗體純度E.電滲不包括正確D免疫電泳的影響不包括抗體純度。單向擴散試驗時錯誤的是A.將一定量的抗體混入瓊脂中 B.每次測定必須做標準曲線 C.不必每次測定都做標準曲線 D.將抗原加入所打的E.2448 小時看結果正確C單向擴散試驗時錯誤的是：不必每次測定都做標準曲線。雙向瓊脂擴散試驗中，若抗原的含量比抗體多且分子量比抗體小，則沉淀線應為A.靠近抗原孔，且弧線彎向抗原側 B.靠近抗原孔，且弧線彎向抗體側 C.靠近抗體孔，且弧線彎向抗原側 D.靠近抗體孔，且弧線彎向抗體側E.居于抗原抗體間，且弧線彎向抗原側正確D沉淀線的形成是根據抗原抗體兩者比例所致，沉淀線如果靠近抗原孔，則表示抗體含量較大；沉淀線如果靠近抗體孔，則表示抗原含量較大；不出現(xiàn)沉淀線則表明無對應的抗體或抗原或者抗原過量?？乖蚩贵w相對分子量的分析 抗原或抗體在瓊脂內擴散，其速度受分子量的影響。分子量小者擴散快，反之則較慢。由于慢者擴散圈小，局部濃度