疾病產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)教學(xué)課件

1、1 第十一章 疾病產(chǎn)生的分子基礎(chǔ) Chapter11 Molecular Basis of Diseases Development 2遺傳病由一或幾個基因及其編碼產(chǎn)物蛋白質(zhì)的異常導(dǎo)致；常見復(fù)雜疾病如惡性腫瘤、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、心腦血管、高血壓等發(fā)生和發(fā)展都涉及到更多蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)、功能和相互作用異常。疾病的本質(zhì)是蛋白質(zhì)功能紊亂，基本原理是各種原因引起蛋白質(zhì)質(zhì)和量的改變。3 1.基因結(jié)構(gòu)的改變； 2.受細胞內(nèi)調(diào)節(jié)因素或其它因素影響使基因的表達發(fā)生改變； 3.外來的致病基因； 4.蛋白質(zhì)翻譯后加工及蛋白質(zhì)降解發(fā)生變化。蛋白質(zhì)功能紊亂的原因各不相同，具有不同分子機制。4第一節(jié) 基因結(jié)

2、構(gòu)改變與疾病 第二節(jié) 細胞間信號異常與疾病第三節(jié) 細胞內(nèi)因素與疾病第四節(jié) 翻譯后加工運輸障礙與疾病第五節(jié) 蛋白質(zhì)降解異常與疾病第六節(jié) 病原微生物基因引起的疾病第七節(jié) 疾病分子機制的研究策略5第一節(jié) 基因結(jié)構(gòu)改變與疾病一、基因突變二、基因突變的遺傳學(xué)效應(yīng)三、結(jié)構(gòu)基因變異導(dǎo)致的疾病四、調(diào)控序列變異導(dǎo)致基因表達水平變化6自發(fā)性復(fù)制錯誤堿基脫落或部分脫落活性氧簇（ROS）物理因素紫外線電離輻射化學(xué)因素烷化劑堿基類似物修飾劑DNADNA突變的原因病原生物基因的整合7一、基因突變的多種類型點突變是單個堿基的替換：轉(zhuǎn)換和顛換缺失是一個或多個核苷酸的丟失插入是一個或多個核苷酸的增加倒位是一段核苷酸序列染色體位

3、置的改變基因突變還分為配子突變與體細胞突變動態(tài)突變指串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)隨世代的傳遞而改變8例脆性X綜合征 “CCG”重復(fù)發(fā)生在FMR1（脆性X智力低下基因1）的5 非翻譯區(qū)，拷貝數(shù)不穩(wěn)定。 850拷貝 (正常人) 52200拷貝 (攜帶者) 2001000拷貝 (患者)9強直性肌營養(yǎng)不良 3非翻譯區(qū)CTG拷貝數(shù)過度增加；Huntington舞蹈病 編碼區(qū)CAG拷貝數(shù)過度增加；Friedreich共濟失調(diào)癥 內(nèi)含子CAA拷貝數(shù)過度增加。101. 錯義突變（missense mutation）指DNA改變后mRNA中相應(yīng)密碼子發(fā)生改變，編碼另一種氨基酸，使蛋白質(zhì)中的氨基酸發(fā)生改變。二、不同的基因突變引

4、起不同的遺傳效應(yīng) 有些錯義突變不影響蛋白質(zhì)或酶的生物活性，不表現(xiàn)出明顯的表型效應(yīng)。112.無義突變 (nonsense mutation)亮氨酸的密碼子UUA，中間的U變?yōu)锳這樣一個堿基變化就會成為（終止密碼子）UAA。酪氨酸的密碼子是UAC，置換突變使UAC變?yōu)槊艽a子UAG后翻譯便終止。UAG、UGA、UAA終止密碼子123.同義突變(synonymous mutation)：同義密碼子互換性變化, 所編碼的氨基酸不變。例如：CUU CUC CUG 亮氨酸13 4.移碼突變(frame-shift mutation) 1)密碼子缺失或插入 2)整個基因或基因大片段缺失 14a.密碼子缺失或插

5、入CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT Leu Thr Pro Glu Glu Lys SerCTG ACT GAG GAG AAG TCT Leu Thr Glu Glu Lys SerCTG ACT CC G GAG AAG TCT Leu Thr Pro Glu Lys SerC CT CCT GAG GAG AAG TCT Pro Pro Glu Glu Lys Ser15b.閱讀框改變CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser TG ACT CCT GAG GAG AAG TCT TGA CTC C

6、TG AGG AGA AGT CT CT ACT CCT GAG GAG AAG TCTCTA CTC CTG AGG AGA AGT CT Leu Leu Leu Arg Arg Ser 插入或缺失帶來的無義突變CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser165.融合突變(fusion mutation) 細胞減數(shù)分裂時同源染色體不等交換而致基因間錯位配對, 產(chǎn)生兩種含不同等位基因的染色體。171819白血病中部分常見的融合基因206.基因突變影響 hnRNA 的剪接 基因突變發(fā)生在 hnRNA 的一級結(jié)構(gòu)上特定的剪接位點上，

7、形成新的剪接位點或使正常剪接位點消失，導(dǎo)致 hnRNA 的剪接錯誤，產(chǎn)生異常的 mRNA，最終產(chǎn)生異常的蛋白表達產(chǎn)物，改變生物性狀。21真核生物基因的剪接位點：由內(nèi)含子的5端“GT”和3端“AG”，及內(nèi)含子和外顯子內(nèi)的其它調(diào)控元件共同決定。EXON1INTRON1EXON2EXON1EXON2EXON1INTRON1EXON2hnRNASplicing ?YesNo22例：家族性孤立性生長激素缺乏型遺傳病 由于GH-1基因的EXON上第5nt由GA，破壞一個ESE，使EXON被跳過，而最終造成編碼蛋白縮短，影響功能。23轉(zhuǎn)入了人缺陷型的GH-1基因利用RNAi使導(dǎo)入基因沉默2019年24三 結(jié)

8、構(gòu)基因改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)變化引起疾病 結(jié)構(gòu)基因發(fā)生改變會改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，進而改變蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。25 1.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化引起的疾?。?） 血紅蛋白病 (hemoglobinopathy)26血紅蛋白結(jié)構(gòu)血紅蛋白是由4條肽鏈（兩個和兩個鏈）組成的。每條肽鏈都類似于肌紅蛋白的肽鏈，都結(jié)合一個血紅素。27血紅蛋白病鐮刀形細胞貧血癥2829基因突變類型異常Hb氨基酸變化臨床特征錯義突變Hb Shuangfeng27GluLys(GAGAAG)不穩(wěn)定Hb病Hb S6GluVal(GAGGUG)鐮刀型細胞貧血Hb Bibba136LeuPro(CUGCCA)不穩(wěn)定Hb病無義突變Hb Mckees Ro

9、cks145Tyr終止(UAUUAA)不穩(wěn)定Hb病終止密碼突變Hb Constant Spring142UAACAA(延長：142Gln173)-地貧血紅蛋白病分子基礎(chǔ)30基因突變類型異常Hb氨基酸變化臨床特征密碼子缺失Hb Gun Hill9195缺失不穩(wěn)定Hb病密碼子插入Hb Grady118與119間插入3個氨基酸無明顯癥狀移碼突變Hb Tak147UAAACUAA延長：Thr158UAA不穩(wěn)定Hb病融合突變Hb Lepore-Boston87(Gln)-116(His)-地貧Hb Kenya81(Leu)-86(Ala)-地貧血紅蛋白病分子基礎(chǔ)31（2） 家族性高膽固醇血癥 LDL 受

10、體基因變異，導(dǎo)致其編碼蛋白結(jié)構(gòu)異常，功能下降或完全喪失。 配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，由LDL受體蛋白N端292個氨基酸殘基組成，富含半胱氨酸。該結(jié)構(gòu)中有7個由40個氨基酸殘基組成的重復(fù)序列(天冬-半胱-X-天冬-甘-絲-天冬-谷)，每個重復(fù)序列中含有6個半胱氨酸殘基，全部42個半胱氨酸。322.蛋白質(zhì)合成量變化引起的疾病33人珠蛋白基因簇及珠蛋白基因結(jié)構(gòu)34 珠蛋白基因的表達在時空上受到遺傳因素的精確調(diào)控，表現(xiàn)為以下特點： 組織特異性 發(fā)育階段特異性 協(xié)同性35-地貧基因缺失類型12正?；菊?輕度貧血 + +輕度貧血0高度貧血 + 0Hb Barts綜合征 0 036珠蛋白結(jié)構(gòu)基因突變抑制珠蛋白合成

11、使珠蛋白量減少甚至完全缺失,引起-地貧第17位賴氨酸密碼子AAG (Lys) TAG, 發(fā)生無義突變,引起0地貧;珠蛋白基因的編碼順序內(nèi)插入或缺失1、或個核苷酸，會使突變點以后的讀碼框遭到破壞，往往造成-珠蛋白肽鏈合成提前終止，而引起0地貧。37四、調(diào)控序列變異導(dǎo)致基因表達水平變化 順式作用元件的基因突變，會降低珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，使珠蛋白合成減少，引起+-地貧。TATA盒：-32（CA)、-30(TC)、-29(AG)、-28(AG)。CAAT盒：-101、-92、-88、-87、-86等位點的點突變。CAATTATACAP PolyA 尾1 30 31 104 105 14653 IVS I

12、VSIS38啟動子和外顯子1之間大于10kb的缺失;另一種是啟動子和外顯子1之間大于6kb的缺失。兩種突變都使LDL受體基因的表達能力完全喪失。LDL受體啟動子變異39 一些內(nèi)含子的變異也會影響蛋白質(zhì)的合成，使體內(nèi)相應(yīng)蛋白質(zhì)含量減少或缺失。 Apo B100 基因內(nèi)含子的第一個堿基會發(fā)生GT突變，突變基因轉(zhuǎn)錄后生產(chǎn)的hnRNA，會影響Apo B100 mRNA的正常剪切。40第二節(jié) 細胞間信號異常導(dǎo)致基因 表達異常引起疾病 細胞間通過激素、神經(jīng)遞質(zhì)、旁分泌信號等保持細胞間的聯(lián)系，協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)彼此的代謝。 基因表達也受到細胞間信號的調(diào)控。41AFP 接受異常細胞增殖信號成為肝癌發(fā)生的重要因素胚胎發(fā)育

13、過程中, AFP增強子激活,出生后, AFP沉寂子處于活化狀態(tài)。在異常細胞增殖信號的作用下, c-myc、c-fos、c-jun等癌基因表達異常增加,其表達產(chǎn)物與 AFP基因順式作用元件結(jié)合,激活 AFP基因表達。AFP與其膜受體結(jié)合，影響TNF及其受體表達，導(dǎo)致肝癌細胞逃避免疫監(jiān)視，并促進其生長。42粉塵刺激 肺支氣管上皮、肺泡巨噬細胞 分泌TGF-1 成纖維細胞 促細胞分裂和ECM 蛋白基因表達 ECM 蛋白成份合成和分泌增加（各型膠原蛋白、IL-1、TNF等） ECM病理性蓄積，矽肺發(fā)生塵肺：長期吸入大量含游離二氧化硅粉塵引起的以肺纖維化為主要病變的疾病43第三節(jié) 細胞內(nèi)因素導(dǎo)致基因 表

14、達異常引起疾病異常的細胞內(nèi)信號 持續(xù)高血糖引起的糖尿病心肌病 高血糖 DAG PKC ACE Ang 心肌重塑、心肌肥大。44異常的DNA甲基化（不同的DNA甲基化模式形成不同的表觀遺傳特征）hCG5轉(zhuǎn)錄起始區(qū)低甲基化非滋養(yǎng)層細胞hCG 受體結(jié)合 cAMP Tumor 45Proteins complexed with DNA allow for more “open” structure; can be transcribed.Methylation leads to change in chromatin structure; more condensed state is transcr

15、iptionally inactivegenes are “off ” 46人絨毛膜促性腺激素(hCG)在妊娠早期維持黃體功能、促進妊娠進行和胎兒性別分化等；腫瘤細胞中，hCG基因5轉(zhuǎn)錄起始區(qū)發(fā)生去甲基化或低甲基化，形成非滋養(yǎng)層細胞中異位表達，具有類似與生長因子作用，激活cAMP旁路信號途徑，獨立地調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖、分化和生長。47第四節(jié) 翻譯后加工運輸障礙與疾病新合成的蛋白質(zhì)翻譯后加工主要過程：去信號肽、基團修飾、折疊、亞基聚合、運輸（至靶作用部位）等48 白化 Albinism 49酪氨酸酶與型泛素性白化病酪氨酸酶催化結(jié)構(gòu)域點突變可以使酪氨酸酶的活性降低甚至消失,黑色素合成減少或不能合成,

16、導(dǎo)致型泛素性白化病;酪氨酸酶催化結(jié)構(gòu)域以外的點突變也能導(dǎo)致色素缺失,蛋白質(zhì)不能正確折疊.沒有正常折疊的酪氨酸酶不能從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出而滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng),無法完成其成熟及運輸過程。50蛋白轉(zhuǎn)運異常酪氨酸酶P蛋白高爾基體黑色素體P蛋白基因突變黑色素合成障礙引起型泛發(fā)性白化病內(nèi)質(zhì)網(wǎng)酪氨酸酶與型泛素性白化病51第五節(jié) 蛋白質(zhì)降解異常與疾病52蛋白質(zhì)降解途徑 溶酶體：降解細胞吞入的胞外蛋白質(zhì)泛素-蛋白酶體：降解胞內(nèi)泛素化的蛋白質(zhì) 泛素(ubiquitin, Ub) E1(泛素激活酶) E2(泛素結(jié)合酶), E3(泛素連接酶) 26S蛋白酶體(proteasome) 蛋白的降解5354泛素-蛋白酶體系統(tǒng)活性被異常抑

17、制或激活均可導(dǎo)致機體紊亂。2019 年諾貝爾化學(xué)獎阿龍切哈諾沃(AaronCiechanover)阿夫拉姆赫什科(AvramHershko)歐文羅斯(IrwinRose)55高血脂:載脂蛋白的過度降解載脂蛋白（apolipoprotein, apo):與脂質(zhì)結(jié)合的運輸載體泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在維持正常載脂蛋白含量中起到重要的作用，該系統(tǒng)功能障礙，會導(dǎo)致載脂蛋白含量異常。Apo A, Apo B100, Apo E, etc.56阿爾茨海默病:蛋白酶體活性的抑制 阿爾茨海默病（Alzheimers disease, AD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的疾病。臨床上首先表現(xiàn)為近期記憶力降低,繼而表現(xiàn)

18、持續(xù)性智能衰退、失語、判斷推理能力喪失,以及運動障礙等。AD最顯著的神經(jīng)病理組織學(xué)特征是老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn),-淀粉樣蛋白在老年斑的形成過程中起十分重要的作用 。57第六節(jié) 病原微生物基因引起的疾病感染引起機械或生物學(xué)損傷；爭奪營養(yǎng)造成營養(yǎng)缺乏；毒素引起細胞代謝功能異常；基因整合到宿主基因組，造成基因結(jié)構(gòu)改 變和表達異常。58第七節(jié) 基因結(jié)構(gòu)和表達與疾病的研究策略1.通過基因結(jié)構(gòu)分析確定基因變異 3.通過功能學(xué)研究確定致病基因 轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因敲除、 反義技術(shù)、基因誘導(dǎo)超表達2.基因表達水平分析 差異顯示、抑制消減雜交、基因表達系列分析59測序：雙脫氧自動化序列分析SSCP：單鏈構(gòu)

19、象多態(tài)性分析RFLP：限制性酶切長度多態(tài)性DNA芯片AS-PCR:等位特異性PCRASO雜交：寡核苷酸斑點雜交MS-PCR：甲基化PCRDGGE etc.一、基因結(jié)構(gòu)分析60 基本原理: 在一定條件下，異源雙鏈核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中錯配堿基可被核糖核酸酶RNase識別并切割，通過凝膠電泳分析酶切片段的大小，即可確定錯配的位置。1.核糖核酸酶切分析（RNase cleavage）61GCATACGTAT野生型5335突變型GCTTACGAAT3355異源雜合雙鏈酶切GCAUACGTAT35353535GCAUACGAAT？體外合成RNA探針GCAUA53野生型探針162GCAT

20、ACGTAT野生型5335突變型GCTTACGAAT3355異源雜合雙鏈酶切TATGCATACG35353535TATGCATTCG體外合成RNA探針TATGC53野生型探針263未發(fā)生酶切發(fā)生酶切電泳分離64缺點：當(dāng)RNA探針上錯配的堿基為嘌呤時，核糖核酸酶切割效率低甚至不切割；分析DNA的一條鏈，突變檢出率為 30%；同時分析DNA的兩條鏈，突變檢出率為 70%；需要制備特異性的RNA探針65 2.雜合雙鏈分析法（heteroduplex analysis, HA） 直接在非變性凝膠上分離雜交的突變型-野生型DNA雙鏈。由于突變型和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯配處會形成單鏈環(huán)

21、形突起，在非變性凝膠中電泳時，會產(chǎn)生與相應(yīng)同源雙鏈DNA不同的遷移率。66雜合雙鏈分析（ heteroduplexes analysis）非變性膠電泳55 GC TACG AT缺失突變型 GCATA CGTAT野生型533533 野生型DNA探針與 野生型DNA雜交GCATACGTATTATGCATACG55335533形成異源雜合雙鏈野生型DNA探針與缺失型DNA雜交TATGCAT CGCG ATGCATA5335533567缺點：只適合200300bp的片段; 不能確定突變的具體位置; 檢出率一般只有80%左右。68 3. 化學(xué)切割錯配法（Chemical cleavage of mism

22、atch, CCM） 基本原理： 將待測含DNA片段與相應(yīng)的野生型DNA片段或RNA片段混合后，變性處理，進行雜交。 在異源雜合的雙鏈核酸分子中： 錯配的C能被羥胺和哌啶切割， 錯配的T能被四氧化鋨切割， 變性凝膠電泳可確定是否存在突變。 69特點：突變檢出率高；如使用熒光檢測系統(tǒng)，靈敏度較高；可檢測長度達 2Kb的核酸片段；步驟多、費時、有毒；704.酶促切割錯配 (enzyme mismatch cleavage)酶：T4內(nèi)切核酸酶 VII識別的序列：DNA:DNA異源雜合分子優(yōu)點：最長檢測片段可達1.5kb，省去體外合成RNA探針的步驟缺點：會產(chǎn)生非特異性切割，對錯配位點的識別也不是10

23、0%71二、基因表達水平分析Northern雜交定量RT-PCR基因表達芯片差異顯示技術(shù)抑制性消減雜交基因表達系列分析721.差異顯示技術(shù)(mRNA differential display reverse transcription chain reaction, DDRT-PCR) 在不同的生長時期、在個體發(fā)育與分化不同階段、在生物體對疾病的反應(yīng)以及不同環(huán)境下調(diào)控基因的表達是不同的，這就是基因的差異表達（differential expression）。原理：利用兩組特殊引物對差別表達的基因進行擴增。733端引物：利用mRNA的poly A尾巴設(shè)計。根據(jù)mRNA結(jié)構(gòu)分析知道，poly A尾

24、巴之前的兩個堿基只有12種可能的排列組合： 5-AGAAAAAAA- 3 5-CGAAAAAAA- 3 5-GGAAAAAAA- 3 5-TGAAAAAAA- 3 5-ATAAAAAAA- 3 5-CTAAAAAAA- 3 5-GTAAAAAAA- 3 5-TTAAAAAAA- 3 5-ACAAAAAAA- 3 5-CCAAAAAAA- 3 5-GCAAAAAAA- 3 5-TCAAAAAAA- 374 這些引物由1112個T及兩個其它的堿基組成，用通式5-T11MN或5-T12MN表示，M為A、G、C的任一種，N為A、G、C、T的任一種。 這種引物稱錨定引物。75 為10個堿基隨機排列組成的

25、隨機引物。 為了能對更多的基因進行分析，應(yīng)使用全部的12種錨定引物以及盡可能多的5隨機引物。5端引物765 MNAAAAAAAAAAAA(A)n 3 Poly(A) RNA5 T12MN 3 錨定引物逆轉(zhuǎn)錄5 MNAAAAAAAAAAAA(A)n 3 3M N TTTTTTTTTTTT 5 變性5 MNAAAAAAAAAAAA(A)n 33M N TTTTTTTTTTTT 5 退火5 T12MN 3錨定引物寡核苷酸隨機引物3M N TTTTTTTTTTTT 5 延長dNTP、Taq聚合酶3M N TTTTTTTTTTTT 5 5 MNAAAAAAAAAAA 3變性、退火、延伸電泳顯示T12MN

26、(M為A、G、C，N為A、T、G、C) 啟動cDNA第一鏈合成不同長度的PCR產(chǎn)物回收差異條帶，再擴增，克隆測序，同源比對隨機結(jié)合到cDNA鏈上77差異顯示技術(shù)特點 簡單易行 快速 實驗樣品需要量低 多能性 對低豐度mRNA的富集效率低、假陽性782. 抑制性差減雜交 (SSH) Diatchenko L, et al. PNAS 2019; 93:6025-6030Suppression subtractive hybridization: a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA pro

27、bes and libraries79原理 a. SSH是差減雜交與PCR結(jié)合的快速分離差異基因的方法。運用雜交動力學(xué)原理，豐度高的單鏈DNA退火時產(chǎn)生同源雜交速度快于豐度低的單鏈DNA，使不同豐度的單鏈DNA得到均衡； b.抑制PCR利用鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火的優(yōu)點，使非目的基因片段兩端反向重復(fù)序列在退火時產(chǎn)生類似發(fā)卡的互補結(jié)構(gòu), 無法作為模板與引物配對，選擇性地抑制了非目的基因片段的擴增，從而使目的基因得到富集、分離。80方法提取實驗組和對照組mRNA合成雙鏈cDNA，經(jīng)識別 4 堿基的限制性內(nèi)切酶Rsa切割實驗組cDNA平均分為2份，分別連接2個接頭進行2輪差減雜交和PCR獲得富集的目的基

28、因81檢測組 (Tester) 含目的基因cDNA，加接頭驅(qū)逐組 (Driver) 不含目的基因cDNA，不加接頭 * 接頭含PCR 引物正向SSH: 易感者(Tester) + 不易感者(Driver) 易感者特異表達或高表達基因 反向SSH: 不易感者(Tester) + 易感者(Driver) 不易感者特異表達或高表達基因 82 抑制性 差減雜交 (SSH) 流程圖83優(yōu)點 采用兩次差減雜交和PCR，保證了高特異性 (假陽性率可降至6); 在雜交過程中可使不同豐度基因均衡化，獲得低豐度差異表達基因;操作相對簡便，是目前分離新基因的主要方法。缺點 起始材料需要 g 級量mRNA; SSH差

29、減克隆片段較小，獲取cDNA全長序列有一定難度。84Elkeles A, et al. Mol Cell Biol ，2019; 19: 2594-2600 The c-fos proto-oncogene is a target for transactivation by the p53 tumor suppressor 采用SSH法證實, 在p53介導(dǎo)的細胞凋亡過程中，c-fos是p53轉(zhuǎn)錄刺激的靶基因,從而提供了這兩種重要調(diào)控蛋白相互作用的直接依據(jù)。抑制性差減雜交(SSH)85Kostic C and Shaw PH. Oncogene ，2000; 19:3978-3987 Isol

30、ation and characterization of sixteen novel p53 response genes 通過SSH比較了p53缺失和含p53的結(jié)腸癌細胞株間基因差異表達，發(fā)現(xiàn)16個p53依賴的下游靶基因。抑制性差減雜交(SSH)863. 基因表達系列分析(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE) 是一種用于定量、高通量基因表達分析的實驗方法(Velculescu et al., 2019)。SAGE原理: 分離每個轉(zhuǎn)錄本特定位置的較短單一的序列標簽（約9-11個堿基對），這些短的序列被連接、克隆和測序，特定的序列標簽的出現(xiàn)次數(shù)就反

31、應(yīng)了對應(yīng)基因的表達豐度。87Serial analysis of gene expression (SAGE) 技術(shù)流程反轉(zhuǎn)錄酶切連接測序單條測序?qū)?040條EST測序分析由于采樣量大大提高，可對低表達基因進行分析：基因表達量分析、尋找新基因等等實驗步驟較長要求較高88三、基因功能的研究轉(zhuǎn)基因技術(shù)基因打靶反義寡核苷酸技術(shù)反義RNA技術(shù)核酶技術(shù)RNA干擾技術(shù)基因誘導(dǎo)超表達技術(shù)反義技術(shù)891. 轉(zhuǎn)基因技術(shù) 指在生物基因組中帶有插入或整合的外源基因，生物個體能將它傳給后代，并表達出該基因的生物活性物質(zhì)，從而使受體生物獲得新的性狀。90 采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精卵細胞或胚胎干細胞，然后將細

32、胞導(dǎo)入動物子宮，使之發(fā)育成個體。 轉(zhuǎn)基因 被導(dǎo)入的目的基因轉(zhuǎn)基因動物(transgenic animal) 目的基因的受體動物91基本方法顯微注射法胚胎干細胞法(embryonic stem cells,ES細胞)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法精子載體法轉(zhuǎn)基因動物中外源基因的檢測染色體及基因水平：斑點雜交、Southern雜交、PCR轉(zhuǎn)錄水平：Northern雜交蛋白質(zhì)水平：Western印跡92轉(zhuǎn)基因動物操作技術(shù)流程 獲取外源目的基因 含有外源目的基因的重組載體導(dǎo)入生殖細胞或胚胎干細胞 選擇攜帶目的基因的細胞，選擇體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動物 轉(zhuǎn)基因胚胎的發(fā)育及鑒定 篩選所得的轉(zhuǎn)基因動物簡明操作步驟93 轉(zhuǎn)基因

33、動物實例一超級奶牛普通奶牛的三倍大 （英國）94轉(zhuǎn)基因動物實例二東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國內(nèi)首例綠色熒光蛋白“轉(zhuǎn)基因”克隆豬 綠色熒光蛋白豬胎兒成纖維細胞克隆 95轉(zhuǎn)基因動物實例三轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白的兔96轉(zhuǎn)基因動物實例四正在進行轉(zhuǎn)基因山羊的實驗 乳汁中分泌人凝血因子IX的轉(zhuǎn)基因山羊 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳研究所972. 基因打靶(gene targeting)通過DNA定點同源重組，改變基因組中的某一特定基因，在生物活體內(nèi)研究該基因的功能?；蚯贸?gene knockout)：定向敲除基因敲入(gene knockin)：定向替代98Marrio Capecchi于八十年代末在Utah大學(xué)發(fā)展起來。實驗動物

34、通常是小鼠，被敲除了功能基因的小鼠就稱為敲除小鼠(knockout mice)?；蚯贸夹g(shù)是研究基因功能的一項非常有用的技術(shù)(遺傳病研究、研究特定基因的細胞生物學(xué)活性以及研究發(fā)育調(diào)控的基因作用）?；蚯贸且惶捉M合技術(shù)，包括基因重組、細胞分離培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因等。 99基因打靶的必備條件胚胎干細胞(ES細胞)能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性打靶載體Neo（新霉素）陽性篩選標志HSV-tk陰性篩選標志：單純皰疹病毒(herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase)100基因敲除的基本程序打靶載體的構(gòu)建打靶載體導(dǎo)入ES細胞：重組置換基因敲除ES細胞注射入胚泡胚

35、泡植入假孕小鼠的子宮中嵌合體的雜交育種101102美國猶他大學(xué)Mario R. Capecchi 美國北卡羅來納州大學(xué)Oliver Smithies 英國卡迪夫大學(xué) Martin J. Evans 2019年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎:基因打靶 1033. 反義技術(shù)104 核酶技術(shù)確定基因在疾病中的作用（1） RNA分子，催化核糖體RNA中內(nèi)含子的自我拼接；除了催化RNA的剪切，還可催化DNA的剪切、RNA的聚合、RNA鏈的復(fù)制等。（2）優(yōu)點:其底物的堿基配對特異性。核酶與底物結(jié)合常形成“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)或“錘頭”結(jié)構(gòu)。（3）設(shè)計核酶特異性地結(jié)合于靶點，以其本身酶活性進行剪切。105核酶的作用機制 106

36、 與一般的反義RNA相比，核酶具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到RNA酶的攻擊。更重要的是，核酶在切斷mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結(jié)合和切割其它的mRNA分子。 107 反義RNA技術(shù) antisense RNA 自身沒有編碼功能，但能與目標RNA特別是mRNA的特定區(qū)域互補結(jié)合的一類RNA; 自然存在，或人工生物合成。108 反義寡核苷酸技術(shù)(antisense oligonucleotide, ASON) 人工合成的能與目的DNA或RNA互補的寡核苷酸（15-20nt）。肽核酸 (peptide nucleic acid, PNA) 核酸分子中的磷酸二酯鍵骨架被酰胺鍵骨架取代，具有

37、更強的穩(wěn)定性。1094. RNA干擾（RNA interference，RNAi）內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA介導(dǎo)的細胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致靶基因的表達沉默，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型的缺失現(xiàn)象。110共抑制現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn) 研究的早期線索早在20年前,來自于美國和荷蘭的兩個轉(zhuǎn)基因植物實驗組Rich Jorgensen和同事,在對矮牽牛(petunias)進行的研究中有個奇怪的發(fā)現(xiàn):將一個能產(chǎn)生色素的基因置于一個強啟動子后,導(dǎo)入矮腳牽牛中,試圖加深花朵的紫顏色,結(jié)果沒看到期待中的深紫色花朵,多數(shù)花成了花斑的甚至白的。Jorgensen將這種現(xiàn)象命名為共抑制(cosuppression),因為導(dǎo)入的基因

38、和其相似的內(nèi)源基因同時都被抑制。開始這被認為是矮牽牛特有的怪現(xiàn)象,后來發(fā)現(xiàn)在其他許多植物中,甚至在真菌中也有類似的現(xiàn)象。111112RNAi 現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)線蟲（C. elegans)2019年康乃爾大學(xué)的研究人員Guo和Kemphues+Par-1 Gene DisruptionExpressionDownDouble Strand RNA線 蟲， 果 蠅微生物， 植 物 113 2019年被解開華盛頓卡耐基研究院的Andrew Fire和馬薩諸塞大學(xué)癌癥中心的Craig Mello首次使用雙鏈dsRNA高效地特異性阻斷同源基因的表達。 實驗表明在線蟲中注入雙鏈不單可以阻斷整個線蟲的同源基因表達

39、,還會導(dǎo)致其第一代子代的同源基因沉默。他們將這種現(xiàn)象稱為干擾。114dsRNADicer cleavage of dsRNAsiRNARNAi 抑制基因表達的機理siRNA associatedWith RISC complexCell Membrane5POH3Target mRNA1155. 基因誘導(dǎo)超表達技術(shù) 將目的基因全長序列與高活性啟動子或組織特異性啟動子融合，經(jīng)過轉(zhuǎn)化后，在誘導(dǎo)劑的作用下或在特定的組織細胞中，目的基因超表達，相應(yīng)的基因表達產(chǎn)物大量積累。比較加入誘導(dǎo)劑前后的表型變化，從而確定目的基因在疾病發(fā)生中的作用。116Thank you117附1、疾病相關(guān)基因的功能克隆和定位克

40、隆1 疾病相關(guān)基因2 功能克隆3 定位克隆1181、疾病相關(guān)基因與疾病單基因病 (一個基因位點上的缺陷)多基因病 (涉及兩個以上的基因位點)染色體病 (染色體結(jié)構(gòu)與數(shù)目的改變)獲得性基因病 (遺傳易感性或病原微生物)119、功能克隆(Functional cloning) 以獲得的蛋白質(zhì)表達及功能信息為線索，分離鑒定出相應(yīng)的基因，叫未知基因的功能克隆。120 功能克?。?functional cloning） 根據(jù)特異蛋白質(zhì)分離目的基因的策略表型克?。?phenotype cloning ） 根據(jù)特異mRNA 分離目的基因的策略121 氨基酸序列核苷酸序列PCR特異蛋白質(zhì) 目的基因 抗體 基因

41、文庫篩選評價優(yōu)點 - 在單基因性狀的基因分離方面仍為常用策略缺點 - 特異蛋白質(zhì)確定、鑒定及其純化困難* - 難以分離微量表達基因 - 無法研究無蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因 - 難以進行多基因控制性狀的基因分離122通過蛋白質(zhì)的抗原抗體反應(yīng)分離鑒定未知基因 基因轉(zhuǎn)錄后在核糖體上翻譯合成蛋白質(zhì)，形成核糖體-mRNA-蛋白質(zhì)產(chǎn)物部分氨基酸序列的復(fù)合體，運用抗體與蛋白質(zhì)產(chǎn)物的免疫共沉淀反應(yīng)，可以分離此復(fù)合體，進而分離到mRNA，最終克隆到未知基因。123西紅柿女孩一女孩患苯丙酮尿癥，不食“人間煙火”，僅能吃西紅柿。智力發(fā)育不全、嚴重的嘔吐，皮膚、毛發(fā)顏色變淺，虹膜顏色減退、尿、汗有特殊腐臭。目前以低苯丙氨酸飲

42、食治療。124、定位克隆又稱為“逆向遺傳學(xué)”，始于20世紀80年代后期利用遺傳連鎖或細胞學(xué)定位技術(shù)將致病基因定位于染色體的特定區(qū)帶。定位：通過連鎖分析找出與目的基因緊密連鎖的遺傳標記在染色體上的位置?？寺。簭亩ㄎ坏娜旧w區(qū)段內(nèi)分離克隆所要的基因，并進一步研究其功能。疾病遺傳標記，染色體定位基因序列mRNAcDNA蛋白質(zhì)產(chǎn)物生物學(xué)功能 疾病 基因功能125定位克?。和ㄟ^遺傳標記 ，先獲得某一表型基因在染色體上的定位 ，再在候選區(qū)域內(nèi)選擇已知基因，進行致病突變的篩選 ，并獲得cDNA及全基因。 基本思路是通過連鎖分析原理進行基因定位。 若多態(tài)標記與待定基因距離較遠 ，則它們在向子代傳遞時會發(fā)生自由

43、分離 ，呈“連鎖平衡”；反之 ，則不發(fā)生自由分離 ，而呈現(xiàn)“共分離”現(xiàn)象 ，即“連鎖不平衡”。據(jù)此可在染色體上定位與某一DNA標記相連鎖的基因。126將基因定位于染色體 特定區(qū)段2. 候選基因篩選鑒定127 定位克隆的主要步驟之一是將目標基因定位于特定染色體上。 主要方法： 家系遺傳調(diào)查分析法、染色體斷裂點分析（家系選擇、分離分析、連鎖分析） 體細胞雜交法 核酸雜交技術(shù) 突變分析技術(shù)128家系遺傳分析法選擇一個含有40多個能提供信息的減數(shù)分裂事件的三代以上 的家系，要排除家系的異質(zhì)性；除了對照基本遺傳表型的各種表現(xiàn)型的幾率外，還要考慮外顯不全；以數(shù)學(xué)計算機模型模擬分析；選擇一定的遺傳標記，進行

44、基因分型，確定疾病基因在染色體上的位置。129基因連鎖分析連鎖分析主要是應(yīng)用限制酶片段長度多態(tài)性（ RFLP ）為遺傳標志進行家系分析在人類基因組中，平均約 200 bp可發(fā)生一對變異 （稱為中心突變 ）中心突變造成了序列上的多態(tài)性，不少序列多態(tài)性發(fā)生在限制酶識別位點上，產(chǎn)生了限制酶酶切位點的多態(tài)性用該限制酶水解 DNA就會產(chǎn)生長度不同的片段，稱RFLP。130 cDNA篩選染色體定位只是定位克隆的其中一步。由于DNA篩選、確認的困難 ，是定位克隆策略的“瓶頸”。目前獲得基因序列的方法大致有:(1)對 500kb 的關(guān)鍵部位進行直接測序；(2)比較基因組作圖和測序； (3)基因結(jié)構(gòu)特征分析；

45、(4)cDNA捕獲，主要有pG島捕捉層析法、 外顯子捕捉法、直接篩選PCR法等方法131cDNA篩選直接法：用基因組DNA直接從cDNA文庫中篩選位于該基因組片段內(nèi)的cDNA。選擇法：將基因組DNA固定在膜上，與總cDNA或cDNA文庫的PCR產(chǎn)物雜交，找到能雜交到膜上的cDNA片段，再用PCR擴增這些cDNA片段。132通過EST拼接如：已知小鼠某基因在人當(dāng)中有高度同源序列用該小鼠cDNA比對人的EST數(shù)據(jù)庫得到一簇EST后，將相鄰的EST通過相互重疊部分進行拼接。得到人對應(yīng)的完整cDNA的序列后，兩端設(shè)計引物在cDNA文庫中進行PCR，得到該cDNA的克隆。至此，與小鼠對應(yīng)的人的該基因得以

46、克隆出來。133基因芯片技術(shù)的應(yīng)用使用傳統(tǒng)方法尋找新基因，不僅需要投入大量的資金，而且針對性不強，效率低下，大部分工作繁瑣重復(fù)。通過基因芯片分析正常組織和疾病組織基因表達情況的差異，往往能夠從那些表達異常的基因中發(fā)現(xiàn)新的致病基因。134附2、HGP與疾病相關(guān)基因的研究135隨著人類基因組草圖測定的完成，宣告了“ 后基因組時代 ”的到來。功能基因組學(xué)成為研究的重心，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究受到了空前的關(guān)注，也為疾病相關(guān)基因的克隆創(chuàng)造了條件。136同一種細胞或組織，處于不同的狀態(tài)（生理與病理等），發(fā)育的不同階段，受到外界的不同影響時，都可能使細胞中蛋白質(zhì)的情況產(chǎn)生相應(yīng)的變化，從而產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)組。蛋白質(zhì)

47、組學(xué)關(guān)注和研究的就是這些變化。137研究蛋白質(zhì)與疾病相互關(guān)系的方法ELISA免疫印跡免疫沉淀蛋白質(zhì)親和層析毛細管電泳138139140噬菌體展示技術(shù)141絲狀噬菌體基因基因編碼產(chǎn)物功能gIpI噬菌體裝配gIIpII噬菌體基因組復(fù)制gIIpIII尾端外殼蛋白，與F因子結(jié)合gIVpIV噬菌體裝配gVpV噬菌體基因組復(fù)制gVIpVI外殼蛋白，末端“塞子”gVIIpVII外殼蛋白，高度疏水，組裝起始信號gVIIIpVIII主要外殼蛋白gIXpIX外殼蛋白，高度疏水，末端“塞子”gXpXgIII啟動子激活蛋白142143144建 庫145篩選146147核糖體展示 (ribosome display)

48、核心是利用體外核糖體表達載體構(gòu)建 sc Fv抗體庫 ,并于體外轉(zhuǎn)錄為 m RNA, 體外翻譯表達 , 隨后以固相化的抗原分子親和篩選出核糖體 -m RNA-sc Fv復(fù)合物中的高親和力 sc Fv。這種技術(shù)在實驗中不用任何細胞 ,是第一個完全在體外篩選有功能蛋白的方法。 148特點 不需轉(zhuǎn)化細菌或真核細胞 避免了宿主隨細胞基因組復(fù)制過程中可能丟失而產(chǎn)生的庫 容下降 , 亦解決了因抗體篩選條件不利于宿主細胞生存而導(dǎo)致抗體丟失這一難題。由于核糖體展示技術(shù)的體外翻譯、體外篩選的特點 , 大大縮短了實驗周期 , 具有省時省力、方便快速的特點。149蛋白質(zhì)組分離技術(shù)雙向凝膠電泳技術(shù)雙向凝膠電泳技術(shù)(2DE)：又稱二維電泳，其原理是在相互垂直的兩個方向上，分