植物細(xì)胞工程教學(xué)課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選

1、細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選第三章細(xì)胞工程電子課件華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院細(xì)胞克隆的概念與意義植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞克隆技術(shù)種子細(xì)胞篩選主要內(nèi)容3.1 細(xì)胞克隆的概念與意義細(xì)胞系細(xì)胞克隆細(xì)胞株 直接從機(jī)體取材的細(xì)胞、組織或器官所做的原代培養(yǎng)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)后形成的一群生物學(xué)特征不均一的細(xì)胞便稱為細(xì)胞系(cell line ) 。有限細(xì)胞系（Finite Cell Line）無限細(xì)胞系（Infinite Cell Line） 一個(gè)克隆的細(xì)胞群體是從一個(gè)單一母細(xì)胞繁殖而來。 分離單一細(xì)胞并使其繁殖為一細(xì)胞群體的方法成為細(xì)胞的克隆化（cloning）。 從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中分離單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，形

2、成均一的細(xì)胞群，這群細(xì)胞具有一定的生物學(xué)特性和遺傳標(biāo)記，并在繼代培養(yǎng)中仍能保持其特性和標(biāo)記，這群細(xì)胞就稱為細(xì)胞株(cell strain)。 3.2植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)愈傷組織誘導(dǎo)平板培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng)微室培養(yǎng)其他改進(jìn)培養(yǎng)技術(shù)3.2.1 愈傷組織誘導(dǎo) 誘導(dǎo)獲得的愈傷組織可以用鑷子或小刀分割得到植物小細(xì)胞團(tuán)，也可以將愈傷組織轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中，加入經(jīng)過殺菌處理的玻璃珠，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，使愈傷組織分散成為小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞，然后用適當(dāng)孔徑的不銹鋼篩網(wǎng)過濾，除去大細(xì)胞團(tuán)和殘?jiān)玫揭欢w積的小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞懸浮液。3.2.2 平板培養(yǎng) 所謂平板培養(yǎng)（plating culture）是指將一定密度的懸浮細(xì)胞接種到一薄

3、層固體體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。 單細(xì)胞的分離：一般采用酶分離法，小細(xì)胞團(tuán)不能超過6個(gè)細(xì)胞，因此過濾時(shí)網(wǎng)篩的網(wǎng)眼要選擇合適。 單細(xì)胞懸浮液的制備：分離的單細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)基洗滌2次以后，調(diào)整密度為5105/ml。 植板：將1份已調(diào)整好密度的但細(xì)胞懸浮液與4份35的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然后均勻的平鋪與培養(yǎng)皿中，其厚度為5mm左右。平板培養(yǎng)的效果一般用植板率來衡量。植板率是能長出細(xì)胞團(tuán)的單細(xì)胞在接種單細(xì)胞中所占的比例。 3.2.3 看護(hù)培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng)（nurse culture）技術(shù)首先是有Muir等（1954）設(shè)計(jì)的，其操作方法是在固體培養(yǎng)基上置入一塊活躍生長的愈傷組織，再在愈傷組織上放一小片濾紙，

4、待濾紙濕潤后將細(xì)胞接種于濾紙上。當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞長出微小細(xì)胞團(tuán)以后，將其直接轉(zhuǎn)至瓊脂培養(yǎng)基上讓其迅速生長。 3.2.4 微室培養(yǎng)微室培養(yǎng)（micro-chamber culture）是為進(jìn)行單細(xì)胞活體連續(xù)觀察而建立的單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，運(yùn)用這種技術(shù)可對單細(xì)胞的生長與分化、細(xì)胞分裂的全過程、胞質(zhì)環(huán)流的規(guī)律等進(jìn)行活體連續(xù)觀察。這一方法同樣也可用于原生質(zhì)體培養(yǎng)，用于觀察細(xì)胞壁的再生與細(xì)胞分裂過程。微室培養(yǎng)是細(xì)胞學(xué)研究的優(yōu)良實(shí)驗(yàn)體系。微室培養(yǎng)首先是由Jones等在1960年設(shè)計(jì)的。 3.2.5 其他改進(jìn)培養(yǎng)技術(shù)Horsch等（1980）將平板培養(yǎng)與飼養(yǎng)層培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，建立了雙層濾紙植板培養(yǎng)方法，該方法是在培養(yǎng)

5、皿中倒入瓊脂培養(yǎng)基凝固后，先將飼養(yǎng)細(xì)胞平鋪在培養(yǎng)基上，然后在飼養(yǎng)細(xì)胞層上平展一張濾紙形成看護(hù)層，再將濾紙制成的圓碟置于看護(hù)層上，然后將培養(yǎng)細(xì)胞植于其中。 3.3 動物細(xì)胞克隆技術(shù)原代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)單細(xì)胞克隆3.3.1 原代培養(yǎng)primary culture取材培養(yǎng) 組織解離機(jī)械分離取材解離一般是借助酶和鰲合劑處理組織，使其成為分散的細(xì)胞。常用的酶有胰蛋白酶和膠原酶，鰲合劑主要有EDTA-Na和檸檬酸鈉。一般直接用鑷子、解剖刀解剖組織、器官，然后加以整理用于培養(yǎng)。動物細(xì)胞原代培養(yǎng)過程不同取材方法，原代細(xì)胞培養(yǎng)方式亦不相同.一般來講，分離獲得的材料多采用組織塊培養(yǎng)，而通過解離獲得的細(xì)胞材料多采用單層

6、細(xì)胞培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)方法 組織塊培養(yǎng) 將組織剪切成碎塊 用平衡鹽溶液漂洗 在解剖鏡下切除脂肪、壞死組織等 切成1mm3大小 再漂洗2-3次 轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。 特點(diǎn) 直接切割分離的組織塊，在一定程度上保持了原有的組織結(jié)構(gòu)，對于初期體外培養(yǎng)的環(huán)境適應(yīng)性比直接分離成單細(xì)胞要強(qiáng)，因此，短期組織塊培養(yǎng)成為動物細(xì)胞培養(yǎng)的材料來源之一。 將解離獲得的細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)液配制成需要的細(xì)胞懸液接種到培養(yǎng)瓶內(nèi)水平放置，37下靜止培養(yǎng)每隔1-2天換培養(yǎng)液一次培養(yǎng)一定時(shí)間后，細(xì)胞在培養(yǎng)瓶底即形成一單細(xì)胞層。單層細(xì)胞培養(yǎng) 特點(diǎn) 更換培養(yǎng)基容易便于觀察不同條件對細(xì)胞生長的影響培養(yǎng)后期容易使用灌注技術(shù)改善營養(yǎng)條件細(xì)胞貼

7、附于基底質(zhì)上，更容易表達(dá)產(chǎn)物單層細(xì)胞培養(yǎng)可適用于許多動物細(xì)胞的原代培養(yǎng)。 適用細(xì)胞 具有非貼壁特性的細(xì)胞，如血細(xì)胞、腹水細(xì)胞等，或者通過機(jī)械攪拌和振蕩能夠較好地維持懸浮狀態(tài)的細(xì)胞。 懸浮細(xì)胞培養(yǎng) 在相應(yīng)的培養(yǎng)容器內(nèi)接種一定密度的細(xì)胞懸液。接種密度與細(xì)胞倍增時(shí)間有關(guān)，倍增時(shí)間在24-48h的細(xì)胞類型接種密度以105/ml細(xì)胞為宜，倍增時(shí)間在12-18h的細(xì)胞類型接種密度以2104/ml為宜。單個(gè)培養(yǎng)瓶的接種體積以厚度不超過2cm為好。 基本方法與植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)相似3.3.2 繼代培養(yǎng)subculture單層細(xì)胞培養(yǎng) 貼壁細(xì)胞再培養(yǎng)懸浮培養(yǎng) 非貼壁細(xì)胞培養(yǎng) 從原代培養(yǎng)物中解離細(xì)胞： 震蕩法 在

8、培養(yǎng)瓶中加入平衡鹽溶液，輕輕震動培養(yǎng)瓶，可以使貼壁疏松的細(xì)胞進(jìn)入到溶液內(nèi)，然后收集洗滌用于培養(yǎng)。 蛋白酶消化 用PBS配制0.01-0.5%的胰蛋白酶消化液，37處理5-15min.，然后洗滌用于培養(yǎng)。 EDTA溶液洗滌 用PBS配制1mmoll-1d EDTA，棄去原代培養(yǎng)的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入EDTA洗滌細(xì)胞，然后再用0.25%的胰蛋白酶消化，次法用于貼壁性極強(qiáng)的細(xì)胞獲取。 機(jī)械剝離 用細(xì)胞刮、細(xì)胞鏟或其它工具直接剝離原代培養(yǎng)物。 切取擬培養(yǎng)的動物器官或大組織塊 洗去血污 剔除多余成分切成約1mm3大小的組織塊 將所有組織剪碎用于組織培養(yǎng) 蛋白酶溶液消化 機(jī)械方法吹打組織塊 離心、培養(yǎng)液懸浮 計(jì)數(shù)

9、、調(diào)節(jié)細(xì)胞密度 用于分離細(xì)胞培養(yǎng) 動物細(xì)胞的培養(yǎng)步驟例1 乳鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng) 準(zhǔn)備工作A 培養(yǎng)用品消毒后，安放在超凈工作臺內(nèi)，紫外線消毒，做好洗手等準(zhǔn)備工作。 B 點(diǎn)燃酒精燈，用品按布局放置，安裝吸管等。乳鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng) a. 采用頸椎脫臼法，將一只新生乳鼠處死b. 將小鼠放入盛有酒精的燒杯中數(shù)秒c. 置超凈工作臺內(nèi) d. 打開消毒器械包 用鑷子掀起乳鼠腹部皮膚,用解剖剪剪開腹腔,充分暴露腹腔e. 用另一鑷子輕輕夾起腸管,翻置一側(cè),充分暴露位于腹腔背壁脊柱 f. 取下雙側(cè)腎臟,放入消毒培養(yǎng)皿中 g. 用吸管吸取PBS加入培養(yǎng)皿中,清洗腎臟3次,盡量去掉血污. h. 將腎組織用解剖剪剪成幾塊，

10、再用PBS漂洗，去凈血液. 1.將洗凈的組織塊移入消毒小瓶中,用眼科剪剪切至0.5mm大小的組織塊。2.加入5-8倍體積的0.25%胰蛋白酶，蓋好放入37水浴中消化20-30分鐘,注意應(yīng)每隔5分鐘振搖一次。3.當(dāng)組織塊變得疏松,顏色略白時(shí)，取出置于超凈工作臺內(nèi).胰蛋白酶消化4.用吸管反復(fù)吹打組織塊,使大部分組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)。5.加入1-2ml培養(yǎng)液終止消化，凈置片刻，讓未消化完的組織塊自然下沉,將上部的組織懸液移入無菌離心管中。1.800-1000rpm離心8-10min, 取上清加入適量培養(yǎng)液,細(xì)胞計(jì)數(shù)后分裝；2.在細(xì)胞瓶(板)上標(biāo)明細(xì)胞名稱，代數(shù)，日期；3.倒置顯微鏡下觀察

11、細(xì)胞分散情況后置37孵箱中培養(yǎng)。離心及計(jì)數(shù) 培養(yǎng)細(xì)胞每天觀察，檢查： A.污染與否? B.細(xì)胞生長狀態(tài)。細(xì)胞觀察如見培養(yǎng)液變?yōu)辄S色且又混濁，為污染;如培養(yǎng)液為桔紅色，表明細(xì)胞狀況良好。在無污染時(shí)，24h內(nèi)有細(xì)胞貼壁，圓形懸浮狀的細(xì)胞延展成短梭狀。 培養(yǎng)3-4天，細(xì)胞生長繁殖，可見細(xì)胞島形成。細(xì)胞透明，顆粒少，界線清。 由于細(xì)胞生長旺盛，代謝產(chǎn)物堆積，CO2增多，培養(yǎng)液逐漸變酸呈黃色，但液體澄清，此時(shí)應(yīng)換液。例二 魚類細(xì)胞培養(yǎng) 魚類原代細(xì)胞的培養(yǎng) A 斷尾（或剪腮）放血 B 用0.01高錳酸鉀溶液或70的乙醇浸泡消毒30分鐘。 C 70酒精棉球擦洗解剖部位 D 剖開腹腔，取出組織，清除粘膜和血液

12、，剪碎，維持液(Hanks液)或緩沖液(PBS)洗。E 用0.25胰酶消化(20，30或4， 過夜)F 離心(1000rpm, 10), 棄去消化液G 用培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)，分裝培養(yǎng)(應(yīng)在2x104個(gè)細(xì)胞/ml 以上)。A 長成單層的細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，加胰酶EDTA，消化后棄去消化液B 加培養(yǎng)基，吹打分散C 分裝培養(yǎng) 傳代細(xì)胞的培養(yǎng)培養(yǎng)的魚類傳代細(xì)胞及顯微觀察結(jié)晶紫染色熒光染料染色活體細(xì)胞3.3.3 單細(xì)胞克隆細(xì)胞克隆化的技術(shù)大致可歸納為三類。 稀釋鋪板 用足夠體積的培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液，使鋪板后呈單個(gè)細(xì)胞分布。 基質(zhì)附著 將稀釋的細(xì)胞懸液接種到適當(dāng)?shù)幕|(zhì)上，使單個(gè)細(xì)胞在基質(zhì)上固著、繁殖生長，形成細(xì)

13、胞群落，然后再取單個(gè)細(xì)胞群落進(jìn)行再培養(yǎng)。 瓊脂克隆 有些細(xì)胞如病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞，可以懸浮狀態(tài)克隆化，因此可以采用植物細(xì)胞克隆的方式，用瓊脂或瓊脂糖包埋。 3.4種子細(xì)胞篩選種子細(xì)胞的概念及意義選擇壓篩選細(xì)胞誘變3.4.1 種子細(xì)胞的概念及意義適用于工業(yè)化生產(chǎn)的種子細(xì)胞，必須滿足以下幾個(gè)基本條件：分散性好；均一性好；生長迅速；細(xì)胞中次生產(chǎn)物含量高；細(xì)胞生長和次生產(chǎn)物合成能力穩(wěn)定。植物細(xì)胞經(jīng)過多次培養(yǎng)以后，往往會發(fā)生變異，需要從中選育出優(yōu)良的植物細(xì)胞，使其特性得以保持或改良。植物細(xì)胞選良和改良方法篩選誘變小細(xì)胞團(tuán)篩選法選擇壓力篩選法3.4.2 選擇壓篩選選擇壓力篩選法是通過添加某些對不同的細(xì)胞有不同作

14、用效果的物質(zhì)，淘汰部分敏感細(xì)胞，而選擇得到所需的細(xì)胞的選育方法。一般可以分為正選擇和負(fù)選擇兩種。正選擇就是把受選擇的細(xì)胞群體置于一定的選擇壓力下，部分細(xì)胞在選擇壓力的作用下受到淘汰，而有一些耐受抗選擇壓力的細(xì)胞可以生長，從而選擇得到所需的細(xì)胞。正選擇適用于對抗性突變體的選擇。 如以NaCl為選擇劑選擇耐鹽突變體，以除草劑為選擇劑選擇抗除草劑突變體等。正選擇可一步完成，也可分多步完成。 一步選擇法有利于篩選單基因突變的細(xì)胞，而對于遺傳背景不詳且可能是多基因的突變或是細(xì)胞質(zhì)基因突變，采用多步法為好。負(fù)選擇法也叫富集選擇法。在植物細(xì)胞篩選中，常用致死富集法。在負(fù)選擇實(shí)驗(yàn)中，選擇的對象是在一定選擇壓的

15、作用下不能生長的那些細(xì)胞，而能夠生長的細(xì)胞受到淘汰。負(fù)選擇適用于對營養(yǎng)缺陷型突變體的選擇。影響細(xì)胞篩選效果的因素親本材料對篩選效果的影響培養(yǎng)方式對細(xì)胞篩選效果的影響細(xì)胞生長速度對細(xì)胞篩選效果的影響選擇壓力的施加方式對細(xì)胞篩選效果的影響親本材料對篩選效果的影響親本材料的選用是否得當(dāng)，對于細(xì)胞篩選的成敗有重要影響，首先應(yīng)該選用優(yōu)良的、僅存在個(gè)別缺點(diǎn)需要改進(jìn)的基因型。還必須注意染色體的倍數(shù)性水平和培養(yǎng)細(xì)胞再生植株的能力。培養(yǎng)方式對細(xì)胞篩選效果的影響用來進(jìn)行篩選的細(xì)胞，基培養(yǎng)方式主要可分為四種：愈傷組織培養(yǎng)、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、細(xì)胞固體培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)。細(xì)胞生長速度對細(xì)胞篩選效果的影響某些抗代謝產(chǎn)物在培養(yǎng)

16、基中只有很短的半衰期。如果有關(guān)的細(xì)胞系生長很慢，那么抗代謝產(chǎn)物可能在敏感細(xì)胞死亡前降解。因此，敏感的變異體可能在不允許其生長的條件下存活下來。生長緩慢的細(xì)胞也容易發(fā)生染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的變化，這些變化可能使植株再生困難或不可能再生，尤其是當(dāng)在培養(yǎng)體中累積了非整倍體時(shí)更是如此。選擇壓力施加方式對細(xì)胞篩選效果的影響選擇壓力可一次性施加，也可逐步施加。在有些離體選擇實(shí)驗(yàn)中，選擇壓力的施加方式對最終的選擇效果可能沒有什么影響。但在另一些情況下，選擇壓力的施加方式直接影響到選擇的成敗。3.4.3 細(xì)胞誘變誘變是指通過各種誘變劑的作用，使細(xì)胞發(fā)生變異的過程。是獲得優(yōu)良植物細(xì)胞的有效方法之一。常用的誘變劑有物

17、理誘變劑和化學(xué)誘變劑兩種。 物理誘變劑：包括X射線、射線、中子、粒子、粒子、紫外線等。紫外線的能量較低，不能引起被照射物質(zhì)離子化，因而叫做非電離誘變因子，其余物理誘變劑均稱為電離誘變因子。 物理誘變劑處理方法：外照射；內(nèi)照射。物理誘變劑外照射，即射線由被照射物質(zhì)的外部透入內(nèi)部誘發(fā)突變。又分為急照射和慢照射。內(nèi)照射，即放射源引入到植物組織或細(xì)胞內(nèi)使其放出射線誘發(fā)突變。常用的方法有浸泡法、注射法和飼入法?；瘜W(xué)誘變劑：根據(jù)對DNA的作用特點(diǎn)，主要分三類，包括堿基類似物、烷化劑、疊氮化合物。此外一些抗菌素也可作為誘變劑。在DNA復(fù)制時(shí)，誘發(fā)配對錯(cuò)誤。如5-溴尿嘧啶。誘發(fā)染色體斷裂。如馬來酰阱、重氮比氨

18、酸、絲裂霉素C、鏈霉素C等。改變DNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)：甲基磺酸乙酯、疊氮化鈉、亞硝基胍等?；瘜W(xué)誘變劑誘變的基本過程單細(xì)胞制備預(yù)培養(yǎng)誘發(fā)突變篩選突變株材料的選擇預(yù)處理細(xì)胞材料的制備制備細(xì)胞懸浮液（一）制備單細(xì)胞用于突變體篩選的最理想的材料是單細(xì)胞或原生質(zhì)體，也可用莖尖、腋芽等。目前用得最多的材料是愈傷組織。材料的選擇采用誘變劑進(jìn)行化學(xué)誘變處理。 根據(jù)植物種類需對誘變劑的含量、時(shí)間進(jìn)行篩選，選用最適含量、最適處理時(shí)間才能收到良好的效果。預(yù)處理分離植物器官、誘導(dǎo)形成愈傷組織、液體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，獲得小細(xì)胞團(tuán)和單細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)物?；驈钠鞴倩蚣?xì)胞培養(yǎng)物游離出單個(gè)原生質(zhì)體。細(xì)胞材料的制備經(jīng)預(yù)處理的材料用糖液洗凈備用。經(jīng)