廣西檸檬疫菌褐腐病病原菌鑒定

1、廣西檸檬疫菌褐腐病病原菌鑒定蔣運(yùn)寧1，陽廷密1，陳傳武1，李紅葉2，王洪凱2，葉泉清3，國立耘4，婁兵海1，付慧敏1（1 廣西特色作物研究院/廣西柑橘生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，桂林，541004；2 浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所，杭州，310029；3 廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，桂林，541004； 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系，北京，100193）基金項(xiàng)目：廣西科技重大專項(xiàng)（桂科AA17204097-8)；桂林市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（20160223-4）；廣西柑橘生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室課題（SYS2015X001，SYS2017X002）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(柑橘)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-27)資助。第一作者

2、：蔣運(yùn)寧（1963），男，助理研究員，主要從事柑橘科研及技術(shù)推廣工作，E-mail:HYPERLINK mailto:摘 要 為了解廣西檸檬疫菌褐腐病的病原菌確切種類，本研究通過多次采樣、病菌分離純化、人工接種等一系列研究，確定分離到了正確的病原菌。根據(jù)病原菌的形態(tài)學(xué)特征，rDNA-ITS序列和致病性，確定引起廣西檸檬疫菌褐腐病的病原菌為柑橘褐腐疫霉菌(Phytophthora citrophthora)。關(guān)鍵詞檸檬；疫菌褐腐??；形態(tài)學(xué)鑒定；分子鑒定；柑橘褐腐疫霉菌檸檬Citrus limon (L) Burmf.屬蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citrus)枸櫞(Citrus medic

3、a L)類的常綠果樹。檸檬全身是寶，是一種鮮食與加工兼用型高檔水果。檸檬栽培主要分布在熱帶和亞熱帶國家和地區(qū)，目前世界上有30多個國家生產(chǎn)檸檬（包括來檬），在世界柑橘四大類（甜橙、寬皮柑橘、檸檬、柚類）中，檸檬栽培面積居第三位，占柑橘栽培面積的11%。中國是檸檬栽培的起源地之一，有1000多年的栽培歷史，我國檸檬產(chǎn)區(qū)主要分布在四川、云南、重慶、廣東、廣西、福建、浙江、臺灣等地1。近年廣西桂林市的部分檸檬果園46月份雨季突發(fā)落葉、落果和枯梢現(xiàn)象，主要危害檸檬果實(shí)和葉片，以樹冠中下部、靠近地面的果實(shí)及葉片受害重，造成大量落果和落葉。受害葉片多從葉緣、葉尖或沿主脈產(chǎn)生水漬狀病斑，似開水燙傷狀，病健部

4、交界不明顯。病斑近圓形或不規(guī)則形，病斑初為淡青至淡黃色，隨后迅速轉(zhuǎn)為淺褐色至深褐色，易誤診為急性炭疽病。陰雨潮濕時，病斑擴(kuò)展極快，可占葉片面積的1/32/3，病葉主脈變黃，造成感病葉片大量脫落。果實(shí)發(fā)病時，先為圓形的淡灰色病斑，后漸變成淡褐色，水漬狀軟腐，病部稍凹陷，病健部分界明顯，后期果實(shí)有腐爛臭味。干燥條件下果實(shí)病斑革質(zhì)，微凹陷，按壓稍有彈性，果實(shí)發(fā)病后容易脫落（見圖1、）。由于該病發(fā)病迅猛，導(dǎo)致葉片及果實(shí)大量脫落，致使樹勢衰退，產(chǎn)量銳減，田間癥狀與疫霉菌引起的疫菌褐腐病相似。據(jù)報(bào)道，全世界為害柑橘的疫霉菌有14種，但在不同國家及地區(qū)，疫霉菌種類有所不同2。為了解廣西檸檬疫菌褐腐病病原菌種

5、屬分類地位，筆者于2017年4月2017年6月期間，多次到發(fā)病果園調(diào)研和采樣，分離培養(yǎng)病原菌，再從病原菌形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)等方面對該病的病原菌進(jìn)行了系統(tǒng)研究，然后利用形態(tài)學(xué)及rDNA-ITS序列分析方法進(jìn)行鑒定，以期為有效防治檸檬疫菌褐腐病提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1病原菌的分離與純化1.1.1病原菌分離 從廣西桂林市臨桂區(qū)8年生檸檬植株上采集具有典型癥狀的病枝、病葉和病果，裝入干凈的塑料采集袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離培養(yǎng)。分離方法為：將采集到的樣品表面洗凈，用吸水紙吸干表面水分，用脫脂棉球蘸取75%的酒精將表面擦拭后，再在要取樣的部位滴上少量酒精，用火機(jī)點(diǎn)燃，火滅后再重復(fù)一次。用滅菌的解剖

6、刀將燒過的病部表面組織（約2 mm厚）去除，然后切取組織小塊（3 mm3 mm）,轉(zhuǎn)移到1/5PDA平板上（含有5 mg/L氯霉素和60 mg/L的鏈霉素），培養(yǎng)3-5天，待從組織塊邊緣長出菌絲，轉(zhuǎn)移到新的PDA平板上培養(yǎng)。1.1.2病原菌純化從1.1.1的PDA平板上挑取生長旺盛的菌落邊緣的小菌絲塊轉(zhuǎn)移到含有抗生素（5 mg/L氯霉素和60 mg/L的鏈霉素）的水瓊脂平板上，培養(yǎng)兩天。用滅菌的解剖刀在解剖鏡下，切取含有單菌絲的小瓊脂塊，轉(zhuǎn)移到新的PDA平板上，待菌落長滿平板后保存。1.2病原孢子誘導(dǎo)將1.1.2獲得的純化病原菌轉(zhuǎn)接在CA培養(yǎng)基（新鮮胡蘿200 g榨汁、瓊脂20 g/L）上，觀

7、察其菌落形態(tài)，氣生菌絲生長狀況。將1.1.2獲得的純化病原菌轉(zhuǎn)接在V汁培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并用皮氏液誘導(dǎo)產(chǎn)生孢子囊，觀察其形態(tài)特征。1.3致病性測定將1.2獲得的病原菌接種到掛有幼果的無病盆栽檸檬植株上，分別對葉片和果實(shí)進(jìn)行接種。葉片接種：從無病盆栽檸檬植株上采集葉片，用75%的酒精擦拭35次，晾干后放入墊有吸水紙的培養(yǎng)皿中，用游動孢子液進(jìn)行接種。果實(shí)接種：用75%的酒精擦拭35次無病盆栽檸檬植株上的幼果，用針刺傷檸檬果實(shí)，再將菌絲塊接種到被刺傷的檸檬果實(shí)上，然后套透明塑料袋密封保濕。同時用無菌水接種作對照。1.4病原菌形態(tài)學(xué)觀察 在光學(xué)顯微鏡下，觀察分離培養(yǎng)獲得的病原菌的菌絲、孢子囊和孢囊梗的形態(tài)

8、、大小及色澤特征，并測量其大小。根據(jù)病原菌菌落形態(tài)、孢囊梗及孢子囊形態(tài)特征等性狀進(jìn)行鑒定。1.5 病原菌分子鑒定基因組DNA的提?。簩⒐┰嚲關(guān)GL接種到在9 cm的PDA平板上生長7天，用滅菌的接種針刮取菌落表面的菌絲，轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中，加入700 L的CTAB提取液及少量石英砂，在DNA提取儀上破碎后，按照常規(guī)方法提取DNA，并置于-20冰箱中保存待用。DNA片段PCR擴(kuò)增：采用通用引物ITS1(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)和ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)進(jìn)行擴(kuò)增核糖體DNA的ITS區(qū)域，采用引物Fm84 (5-TTT AAT

9、TTT TAG TGC TTT TGC-3)和Fm83(5-CTCCAA TAA AAA ATA ACCAAA AAT G-3)擴(kuò)增cox1基因片段，采用Btub F1(5-GCCAAGTTCTGGGAGGTCATC-3)和Btub R1(5-CCTGGTACTGCTGGTACTCAG-3)擴(kuò)增微管蛋白-tubulin基因片段。PCR反應(yīng)體系：2 PCR buffer 12.5 L(包含 0.1 U Taq DNA聚合酶，500 mM dNTP mixture，20 mM Tris-HCl，100 mM KCl，3 mM MgCl2)，10 M ITS1和ITS4 引物各0.5 L，模板DNA

10、 1 L，補(bǔ)足ddH2O至25 L。PCR反應(yīng)條件：94預(yù)變性3 min；94變性l min，54退火40 S, 72延伸40 S，35個循環(huán)；最后72延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測定委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行。將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進(jìn)行BLASTn比對，從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載相似的序列（見表1），通過Bioedit對三種序列分別進(jìn)行裁剪后，將其并為一個序列,采用PAUP4.0b10軟件的非加權(quán)簡約法進(jìn)行系統(tǒng)樹的構(gòu)建。通過1000次的bootstrap評估系統(tǒng)樹分支的穩(wěn)定性。表1 用于本次分析的從GeneBank中下載的基因片段種名菌株號GeneB

11、ank登錄號文獻(xiàn)ITS-tubulincoxIP arecaeCBS 305.62HQ643146DQ988241HQ708218Rahman等（2014）3P. botryosaP6945HQ643151EU079935HQ708222P. colocasiaeP6317HQ261539EU079907HQ261286P. gregataCPHST-BL 37 MG865503MH493945MH477746P. meadiiCBS 219.88HQ643268AY564077HQ708324P. pseudosyringaeP10443HQ261653EU080023HQ261400P.

12、quinineaCBS 407.48HQ643338AY564085HQ708386P. richardiae45F5 MH620154KX251924MH620078P. heveaeCBS296.29 MG865505AY564067HQ708301P. citricolaCH97TUL2AB367377AB974435AB688187P. citrophthoraSTE-U 7435JN606025JN605861JN605937Christoffel等（2014）4STE-U 7420JN606000JN605846JN605922STE-U 7444JN606018JN605870J

13、N605946STE-U 7456JN606024JN605882JN605958P0318JN606020JN605840JN605916P3078JN606036JN605842JN605918Vi-11JN605990JN605906JN6059822結(jié)果與分析2.1致病性測定結(jié)果接種試驗(yàn)表明，離體葉片用游動孢子液接種，幼果用菌絲塊接種，7天后兩者均出現(xiàn)癥狀，12天后病斑擴(kuò)展至葉、果大部分，其癥狀特點(diǎn)與田間自然條件下發(fā)病的癥狀一致（見圖1 A、B）。從接種發(fā)病的部位進(jìn)行菌株的分離，均能獲得與來自田間發(fā)病組織分離得到的菌株相同的病原菌。而接種無菌水的對照則不表現(xiàn)任何癥狀，也未分離出病原真菌

14、。根據(jù)柯赫氏法則,證明該病原菌為廣西檸檬疫菌褐腐病的致病菌。我們將一個分離物記為PGL。2.2病原菌鑒定2.2.1病原菌的培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征病原菌菌株P(guān)GL在CA培養(yǎng)基，菌落呈棉絮狀，氣生菌絲較少；在PDA、MEA和燕麥培養(yǎng)基上，形成白色菌落，菌落呈花瓣放射狀，菌絲發(fā)達(dá)，但是菌絲生長比常見的寄生疫霉的生長速度慢很多，菌落邊緣不整齊（圖2A）。在顯微鏡下，1周之內(nèi)只見菌絲，菌絲粗壯，粗細(xì)均勻，無隔膜，內(nèi)部油球多，未見菌絲膨大體和厚垣孢子，無產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)出現(xiàn)（圖2B）。3周后出現(xiàn)孢子囊。孢囊梗簡單合軸分枝，分枝不規(guī)則，粗2.34.7 m，平均3.4 m。孢子囊形態(tài)變異極大，有長橢圓形、卵形、近圓形、橢

15、圓形、倒梨形等，基部鈍圓，大小為（21.484.3）m（17.641.2）m，平均55.7 m33.8 m，長寬比平均為1.6，孢子囊頂部凸起明顯，具有淺色半球形乳突，一般1個，少數(shù)2個，高度3.47.6 m，平均5.2m，排孢孔寬度4.97.6 m，平均6.0 m，后期顏色鮮黃色，孢子囊在水中不脫落（圖3）。異宗配合，配對培養(yǎng)未見有性器官產(chǎn)生。根據(jù)上述病原菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)特征，參照真菌分類相關(guān)文獻(xiàn)5-7的描述，初步鑒定該病原菌為柑橘褐腐疫霉菌(P. citrophthora)。圖1離體檸檬葉片及果實(shí)接種12天后病斑擴(kuò)展至葉、果大部分(A、B）；田間果實(shí)、葉片發(fā)病癥狀（C、D）圖2在固體培

16、養(yǎng)基上，菌落呈放射狀，氣生菌絲較少(A)；菌絲粗壯，管狀，無隔膜，有油球狀內(nèi)含物(B)圖3孢子囊梗和孢子囊形態(tài)2.2.2病原菌rDNA-ITS序列分析將本研究中測序得到的rDNAITS、cox1和-tubulin三個DNA片段和從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的相關(guān)序列經(jīng)過合并后，形成了2091個特征符的數(shù)據(jù)陣。聚類分析后得到了5個同等聚類樹，圖4顯示了其中的1個。我們根據(jù)Christoffel等（2014）4的研究，將Phytophthora heveae作為外群，結(jié)果表明，本研究中分離到的菌株P(guān)GL與P. citrophthora聚類在一起，boostrap分析得到99%的支持。根據(jù)該病原菌的

17、形態(tài)特征，結(jié)合分子鑒定分析以及致病性測試的結(jié)果，將引起廣西檸檬疫菌褐腐病病原菌鑒定為柑橘褐腐疫霉菌(P. citrophthora)。圖4根據(jù)rDNAITS、cox1和-tubulin三個DNA片段序列分析得到的系統(tǒng)發(fā)育樹3結(jié)論與討論本研究通過對廣西檸檬疫菌褐腐病的病原菌進(jìn)行致病性測定、形態(tài)學(xué)特征分析以及核苷酸序列分析，明確了其病原菌為柑橘褐腐疫霉菌。柑橘疫菌褐腐病，又稱為柑橘疫腐病、褐腐病等8，引起該病的病原可為多種疫霉屬(Phytophthora)真菌，甜橙、寬皮柑橘、柚類及檸檬均可被疫霉菌感染。該病原菌主要為害成熟期果實(shí)和葉片，在田間和貯運(yùn)期均能發(fā)生，可導(dǎo)致果實(shí)大量脫落。柑橘疫菌褐腐病在

18、世界各柑橘產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，我國以川、渝等西南地區(qū)發(fā)生嚴(yán)重9。近年報(bào)道湖南江永夏橙10、江西贛州臍橙11、廣東梅州金柚12、湖北宜都溫州蜜柑13、廣西平樂沙田柚14，均遭受到疫霉病嚴(yán)重危害，給柑橘生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損失。本研究明確了廣西檸檬疫菌褐腐病的病原及分類地位，為制定廣西檸檬疫菌褐腐病的防治策略提供理論依據(jù)。參考文獻(xiàn)1 王自然，郭 俊，等.檸檬苗期一種新病害的病原鑒定及防治藥劑的室內(nèi)篩選J.植物保護(hù)，2012，38（4）：166-1702 廖 芳，朱林慧，牛春敬，羅加鳳，任學(xué)毅，黃國明，李關(guān)榮.柑橘屬植物疫霉病菌檢測與鑒定的研究進(jìn)展J.植物檢疫，2015，29（1）：7-113 RAHMAN MZ，UEMATSU S，COFFEY MDAVID，UZUHASHI S，SUGA H，KAGEYAMA K. Re-evaluation of Japanese Phytophthora isolates based on molecular phylogenetic analysesJ. Mycoscience, 2014, 55(4): 314-3274 CHRISTOFFEL F.J. SPIES，JULIA C. MEITZ-HOPKINS，SHAUN