有機(jī)高分子基質(zhì)填料

1、關(guān)于有機(jī)高分子基質(zhì)的填料第一張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月首先回顧幾個(gè)問(wèn)題HPLC方法的主要特點(diǎn)有那些？HPLC的主要設(shè)備分哪幾部分？第二張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月HPLC方法的主要特點(diǎn)分離效率高，選擇性好，適于各種多元組分復(fù)雜化合物的分離;應(yīng)用范圍廣：無(wú)機(jī)物有機(jī)物，天然物質(zhì)合成產(chǎn)物，小分子-大分子，一般化合物到生物活性物質(zhì);分離機(jī)理各異，色譜柱、淋洗體系和操作參數(shù)選擇廣泛;分離純化+分析檢測(cè);樣品量從痕量到大規(guī)模制備，實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測(cè)和自動(dòng)化操作。第三張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月HPLC的關(guān)鍵設(shè)備專用的高壓輸液系統(tǒng);高靈敏檢測(cè)系統(tǒng);高效分離柱其中分離柱是

2、色譜的中心,是最為關(guān)鍵的部分第四張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月與經(jīng)典色譜的比較第五張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第六張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月HPLC分離填料：有機(jī)基質(zhì)多糖型凝膠高聚物樹脂無(wú)機(jī)基質(zhì)硅膠氧化鋯氧化鋁多孔玻璃羥基磷灰石石墨化碳黑基質(zhì)微球天然多糖或合成單體或交聯(lián)劑負(fù)載樣品的能力強(qiáng)，色譜容量高耐酸堿、具化學(xué)穩(wěn)定性，柱壽命長(zhǎng)，易再生不易產(chǎn)生非特異性吸附作用第七張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、HPLC色譜柱的關(guān)鍵在于填料物理結(jié)構(gòu)色譜動(dòng)力學(xué)（粒度與粒度分布、孔徑與孔徑分布、顆粒強(qiáng)度和表觀形態(tài)柱效率、穿透性）化學(xué)結(jié)構(gòu)色譜熱力學(xué)（連接在基質(zhì)上

3、的官能團(tuán)或鏈段樣品保留值、選擇性）第八張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1、HPLC色譜柱填料在物理結(jié)構(gòu)上的要求:顆粒大小合適，粒度分布較窄;顆粒強(qiáng)度適應(yīng)高速高壓操作;多孔型的填料孔徑大小和孔徑分布適宜,避免復(fù)雜的微孔結(jié)構(gòu);一定的溶脹及收縮水平。第九張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月常見(jiàn)的液相色譜填料類型多孔型非多孔型薄殼型分：小孔（30nm）和超大孔（100nm），應(yīng)用占主導(dǎo)地位整體顆粒無(wú)孔顆粒表面層多孔，內(nèi)部無(wú)孔。以合成樹脂為基質(zhì)的產(chǎn)品，顆粒在10m左右以合成樹脂為基質(zhì)的產(chǎn)品，顆粒20m左右同左第十張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月目前的主要發(fā)展方向(研究熱點(diǎn)):顆

4、粒單分散的填料;貫穿性超大孔結(jié)構(gòu)的填料;小顆粒的非多孔填料。第十一張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、HPLC色譜柱填料在化學(xué)結(jié)構(gòu)上的要求特定的選擇性;良好的化學(xué)穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性;避免不可逆吸附。不同填料的化學(xué)結(jié)構(gòu)是通過(guò)對(duì)基質(zhì)材料的化學(xué)改性而實(shí)現(xiàn)的。第十二張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月離子交換色譜填料 顆粒表面攜帶季銨基、DEAE基、磺酸基、羧基等強(qiáng)弱陰陽(yáng)離子集團(tuán)。反相色譜填料 C18、C8烷基等疏水性集團(tuán)正相色譜填料 羥基、氨基、氰基等弱疏水性集團(tuán)親和色譜填料 蛋白質(zhì)、抗體、激素、抗菌素、酶等具有生物特異性的配基第十三張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、有機(jī)高

5、分子類型的HPLC填料基質(zhì)樹脂 基質(zhì)材料決定填料物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)結(jié)構(gòu): 顆粒大小與分布,顆粒強(qiáng)度,孔徑大小,孔結(jié)構(gòu)形態(tài),顆粒內(nèi)部的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性, 直接影響對(duì)顆粒的表面(包括內(nèi)孔表面)的化學(xué)修飾。 可分為:多糖型聚合物型第十四張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（一）多糖型基質(zhì)材料1.葡聚糖系:高交聯(lián)的羥丙基化葡聚糖,其顆粒剛性好,粒度小而且分布范圍窄（1023m）; Sephasorb HP Uitrafine 用于中低壓色譜和高效色譜烯丙基葡聚糖與N,N-亞甲基雙丙烯酰胺交聯(lián)共聚而成的凝膠。 Sephacryl系列(S-100HR,S-200HR,S-300HR)屬于高效凝膠，較高

6、流速下使用第十五張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2.瓊脂糖系:Sepharose與2,3-二溴丙醇反應(yīng)生成瓊脂糖凝膠 Sepharose CL(CL-2B,CL-4B,CL-6B)高度偶聯(lián)瓊脂糖凝膠Sepharose Fast Flow (Sepharose 6FF, Sepharose 4FF)高效瓊脂糖凝膠Sepharose high PerformanceSuperdax(葡聚糖與交聯(lián)瓊脂糖的結(jié)合)：快流速Superose(珠狀瓊脂糖經(jīng)兩次交聯(lián))：高效凝膠第十六張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）聚合物型基質(zhì)材料交聯(lián)聚苯乙烯樹脂: 苯乙烯與二乙烯苯的交聯(lián)共聚物(PS

7、-DVB)，是應(yīng)用最為廣泛的一類基質(zhì)樹脂。交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯類樹脂: 以甲基丙烯酸的甲脂、丁酯、羥基乙酯、環(huán)氧丙酯等化合物為單體制備的交聯(lián)高聚物。第十七張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、填料性能評(píng)價(jià)填料的物化性質(zhì)指標(biāo)填料的色譜性能表征第十八張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1、物化性質(zhì)指標(biāo):a.顆粒大小及其分布(dp);b.比表面積S(m2/g)；c .骨架密度g(g/ml)、溶劑吸收量Sr(ml/g)、溶脹因子f;d.比孔體積Vp(ml/g);e.孔度；f.孔徑大小及分布；g.化學(xué)結(jié)構(gòu)與化學(xué)性質(zhì)。第十九張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、色譜性能表征: 保留值：

8、保留時(shí)間(TR),保留體積(VR),容量因子(K)選擇性：相鄰二物質(zhì)保留時(shí)間之比,與固定相、流動(dòng)相及溫度有關(guān)。柱效率：理論塔板數(shù)(N)，或理論塔板高度(H)表示。填充柱的總空隙度和穿透性：分離度(R)：相鄰兩色譜峰的保留值之差與各自峰底寬度一半之和的比值。第二十張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四、反相HPLC高分子填料Reversed Phase Chromatography,RPC 反相色譜（原理參照P237） ：非極性固定相，極性流動(dòng)相，強(qiáng)極性組分先洗脫出來(lái)。1.目前RPC分離柱以硅膠基質(zhì)的鍵合相填料為主，特別是鍵合C18，C8烷基以及苯基填料。特點(diǎn)：傳質(zhì)快，剛性好，柱效高，選擇

9、性好。不足：pH28，容易使蛋白質(zhì)失活（殘留的硅羥基）第二十一張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月廣泛使用的是微球形交聯(lián)聚苯乙烯樹脂，另有帶C18烷基側(cè)鏈的聚丙酰胺、聚甲基丙烯酸的烷基酯化物、聚乙烯醇的酯化物，C18烷基鍵合的聚乙烯醇。 優(yōu)點(diǎn)：pH范圍較廣，表面有較強(qiáng)的疏水性第二十二張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月主要廠家日本：東洋-曹達(dá)Tosoh-TSK瑞士：Hamilton,漢密爾頓,英國(guó)：高聚物實(shí)驗(yàn)室Polymer Lab美國(guó)：Bio-Rad伯樂(lè)瑞典：安捷倫Agilent詳見(jiàn)：P194表101第二十三張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月被分離樣品的分子量大小與填料的

10、孔徑選擇 如PLRPS填料：孔徑10nm，適于分離1520個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽類；孔徑30nm，適于分離中等分子量的球形蛋白質(zhì)；孔徑100nm，適于分離較大的球形蛋白質(zhì)或纖維狀結(jié)構(gòu)的化合物；孔徑400nm，適于分離很大分子量的蛋白質(zhì)。第二十四張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三氟乙酸(TFA )第二十五張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十六張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十七張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月在IEC中,高分子類型填料表現(xiàn)更大的優(yōu)越性。 大致有3類：多糖基質(zhì)的離子交換層析介質(zhì)聚合物基質(zhì)的高效離子交換色譜填料高聚物型離子交換色譜填料五、離子交

11、換HPLC填料Ion exchange chromatography IEC第二十八張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.多糖基質(zhì)的離子交換層析介質(zhì)傳統(tǒng)的多糖類軟質(zhì)凝膠制得強(qiáng)弱陰陽(yáng)離子交換介質(zhì)：具有很好親水性和生物相容性；高交聯(lián)度多糖類凝膠填料：還適于較高壓力和流速下操作。第二十九張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2.聚合物基質(zhì)的高效離子交換色譜填料交聯(lián)共聚的苯乙烯-二乙烯苯聚甲基丙烯酸酯;4-乙烯吡啶共聚物特點(diǎn)：高交聯(lián)大孔結(jié)構(gòu),良好的剛性 和小而均勻的粒度第三十一張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月a.多孔樹脂的IEC填料

12、:柱效、穿透性、分離度、負(fù)載量、回收率的性能優(yōu)異Mono Beads 系列：包括Mono Q, Mono S, Mono PSOURCE系列:15Q,15S,30Q,30S貫流色譜填料POROS系列羥基化聚醚凝膠：如TSK gel DEAE-5PW,SP-5PW,CM-5PW等交聯(lián)聚甲基丙烯酸羥基乙酯:親水,大孔第三十二張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月b.非多孔樹脂的IEC填料:羥基化聚醚,交聯(lián)聚苯乙烯,交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯,交聯(lián)瓊脂糖等。優(yōu)點(diǎn):顆粒小,均勻,剛性好,色譜穿透性強(qiáng),流速適應(yīng)范圍寬。避免了固相內(nèi)的吸附與擴(kuò)散，因此具有高柱效,高分離度和高樣品回收率的特點(diǎn)。第三十三張，PPT

13、共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月c.薄殼型樹脂的IEC填料:優(yōu)點(diǎn):柱效高,選擇性好,分離度高,穿透性好,回收高,流速快等第三十四張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月六、有機(jī)高分子類型的疏水HPLC填料Hydrophobic interaction chromatography,HICHIC:填料表面具有弱疏水性,蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)與填料表面之間產(chǎn)生弱的疏水性相互作用。高濃度鹽條件下,蛋白質(zhì)與疏水固定相的吸附能力高,隨著鹽濃度的下降,吸附能力下降。當(dāng)淋洗液離子強(qiáng)度逐漸降低時(shí),蛋白質(zhì)樣品按其疏水性的不同依次被洗脫。第三十五張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月常見(jiàn)淋洗液有(NH4)2SO4

14、, NH4Ac, NaCl,磷酸鹽等,其中(NH4)2SO4是最廣泛應(yīng)用的。 第三十六張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 疏水色譜HPLC填料一般是親水性基質(zhì),或在合成的非親水性基質(zhì)上連接一定的親水基團(tuán)，然后引入疏水性基團(tuán),主要有丁基、辛基、苯基等以及聚乙二醇。其基質(zhì)可以是多糖類,也可以是各類高分子多聚物,包括交聯(lián)聚苯乙烯樹脂、硅膠、羥基化聚醚樹脂、交聯(lián)甲基丙烯酸酯類。HIC填料絕大多數(shù)是多孔結(jié)構(gòu),主要是超大孔結(jié)構(gòu)，也可以是非多孔結(jié)構(gòu)的。P206表10-4第三十七張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月七、有機(jī)高分子類型的空間排阻HPLC填料Size exclusion chromatography, SECSEC填料特征：填料的性質(zhì)必須與溶質(zhì)和淋洗體系相匹配,可以被淋洗劑所浸潤(rùn)；填料和試樣盡可能不發(fā)生任何基團(tuán)之間的相互作用,即盡可能避免非空間排阻效應(yīng)；填料的多孔結(jié)構(gòu)是SEC建立的基礎(chǔ)；第三十八張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 SEC填料的色譜特征： 除了柱效,選擇性,分離度,穿透性等一般色譜表征外,尚需要滿足以下指標(biāo)：排阻極限;分離范圍;固流相比第三十九張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月凝膠填料主要類型多糖類傳統(tǒng)的軟質(zhì)凝膠:葡聚糖,瓊脂糖,聚丙烯酰胺型凝膠高交聯(lián)的多糖類凝膠:Superdex,Superose, Sephacryl