實驗５蠶豆根尖細胞微核檢測技術(shù)

1、實驗 蠶豆根尖細胞微核檢測技術(shù)一 原理二 目的 學習蠶豆根尖細胞微核制片與檢測技術(shù)，了解該技術(shù)在誘變作用檢測上的應(yīng)用。 (Micronucleus,MCN)，也叫衛(wèi)星核，是真核生物細胞中的一種異常結(jié)構(gòu)，是染色體畸變在間期細胞中的一種表現(xiàn)形式。微核是各種理化因子，如輻射，化學藥劑對分裂細胞作用產(chǎn)生的。在細胞間期，微核呈圓形或橢圓形，游離于主核之外，大小應(yīng)在主核1/3以下。其折光率及細胞化學反應(yīng)性質(zhì)與主核一樣，也具有合成DNA的能力。 一般認為微核是有絲分裂后期喪失著絲粒的染色體斷片產(chǎn)生的。這些斷片或染色體在分裂過程中行動滯后，在分裂末期不能進入主核，便形成了主核之外的核塊。當子細胞進入下一次分裂

2、間期時，它們便濃縮成主核之外的小核，即形成了微核。微核率的多少與和作用因子的劑量或輻射累積效應(yīng)有正相關(guān)。 微核測試用于輻射損傷、輻射保護、化學誘變劑、新藥試驗、食品添加劑的安全評價，以及染色體遺傳疾病和癌癥前期診斷。1三 材料 蠶豆根尖（新鮮的固定材料）四 步驟 1 蠶豆浸種催芽 2 待測液對根尖的處理 3 根尖細胞的恢復培養(yǎng) 4 根尖的固定25 根尖的酸水解：將固定的幼根放入青霉素瓶中，用dH 2 O 浸洗2次，除去水后加入5N HCL 將幼根泡住，放入30OC水浴中水解28 min 左右（水解時間與水溫有反相關(guān)關(guān)系），待幼根軟化（同時變?yōu)榘胪该鳎┘纯扇〕?，用dH 2 O 浸洗幼根2次，5m

3、in/次。6 制片：將幼根放在擦凈的載片上，用解剖針截下4mm左右的根尖部分，搗碎，加入1-2滴改良苯酚品紅染色液，染色10分鐘左右，然后加蓋片，壓片。7 鏡檢：先在低倍鏡下找出具微核的細胞，再轉(zhuǎn)入高倍鏡進行仔細觀察。五 作業(yè) 繪出一個具微核的蠶豆根尖細胞圖。3附微核識別標準： 1、凡是主核大小的1/3以下，并與主核分離的小核； 2、小核著色與主核相當或稍淺； 3、小核形態(tài)可為圓形，橢圓形，不規(guī)則形等。凡符合以上3條的小核就是微核（micronucleus,MN)45微核形成機制：6附：實驗數(shù)據(jù)的處理和污染程度的劃分將微核觀察記錄于表上71）各測試樣品（包括對照組）微核千分率（MN) 的計算為

4、：MN=某測試樣點（或?qū)φ眨┯^察到的微核數(shù)/某測試樣點（或?qū)φ眨┯^察的細胞數(shù)）MN 在10以下的為基本污染10 - 18 區(qū)間為輕度污染18 - 30 區(qū)間為中度污染30 以上為嚴重污染注：每個處理觀察3個根尖，每個根尖記數(shù)1000個細胞，統(tǒng)計其中含微核的細胞數(shù)然后平均，即為該處理的微核千分率。82）污染指數(shù)（pollution index)污染指數(shù)（PI)=樣品實測MN 平均值/標準水MN 平均值PI在 0- 1.5 區(qū)間為基本無污染 1.5-2.0區(qū)間為輕度污染 2.0-3.5區(qū)間為中度污染 3.5以上為嚴重污染注：1）對嚴重污染的水環(huán)境，監(jiān)查處理時造成根尖死亡，應(yīng)稀釋后再做測試； 2）如

5、RT 35，MN本底會增高，但可經(jīng)污染指數(shù)數(shù)據(jù)處理，不會影響監(jiān)測結(jié)果。91011In an individual heterozygous for a paracentric inversion, the chromosomes form an inversion loop during pairing in prophase I.12后期染色體橋后期染色體橋和染色體斷片二分體時期微核13倒位的細胞學特征：粗線期倒位圈；后期橋和斷片；微核倒位的遺傳效應(yīng)：改變重組率；基因重排14 微核試驗自70 年代初產(chǎn)生以來的近30 年的時間里,在環(huán)境物質(zhì)遺傳毒理檢測方面發(fā)揮了重要的作用。它以經(jīng)濟、簡便、快速

6、、敏感、特異、準確等特點,已成為檢測染色體損害的致突變劑和環(huán)境污染物的快速初篩試驗,已廣泛用于篩檢具有染色體損傷作用的致突變劑(Mutagens) 和環(huán)境污染物( Environmental Pollutants) 。 微核(micronucleus ,MN) 是指位于生物細胞的細胞質(zhì)中獨立于主核,直徑小于主核1/ 201/ 3 ,完全與主核分開的圓形或橢圓形的微小核。它可以是整條染色體,也可以是染色體斷片,染色性與主核一致,其中部分微核具有DNA 復制能力。微核是由于外界損害因素使染色體發(fā)生斷裂,細胞進入下一次分裂時,染色體不能隨有絲分裂進入子細胞,而導致染色體丟失或斷裂, 從而形成一個或數(shù)

7、個小核.15微核試驗的產(chǎn)生與發(fā)展 微核試驗創(chuàng)建于20 世紀70 年代初,首先由Heddle 和Schmid 利用嚙齒類骨髓細胞建立了微核測定方法 。1970 年Schmid 及Heddle 用中國金黃地鼠觀察了抗腫瘤藥三亞胺醌,觀察骨髓與外周血細胞學的變化。并且提出用本來無核的外周血嗜多染紅細胞中MN 發(fā)生率來作為微核試驗的基本指標,并正式命名為MNT。此后至70 年代中期,該研究小組的工作,全面奠定了MNT 的理論及應(yīng)用基礎(chǔ)。經(jīng)Heddle 等人30 多年的發(fā)展,許多國家和國際組織已將其規(guī)定為新藥、食品添加劑、農(nóng)藥、化妝品、環(huán)境化學物質(zhì)等毒理安全性評價必做的實驗 。16 隨著分子生物學技術(shù)的

8、迅速發(fā)展和不斷滲透到微核研究中,使微核試驗的檢測應(yīng)用范圍不斷擴大,現(xiàn)已發(fā)展成為能同時檢測染色體斷裂、染色體丟失、分裂延遲、不分離、DNA 損傷修復障礙、Hprt 基因突變、細胞凋亡、細胞分裂不平衡等多種遺傳損害終點 。 自20 世紀70 年代Heddle 和Schmid 利用嚙齒類骨髓細胞建立了微核試驗檢測方法以來,各國都在不斷研究探索微核試驗技術(shù)。主要從三個方面來進行:一是探索微核試驗的實驗技術(shù),即研究材料、實驗方法、給藥方式、染毒途徑、制片方法、染色方法等;二是利用微核試驗來檢測各種致突變物質(zhì);三是通過微核試驗來預(yù)測疾病。17微核形成機理化學毒性物質(zhì)染色體斷裂劑可誘發(fā)染色體發(fā)生斷裂的遺傳毒

9、性物質(zhì)。細胞核的主要成分是染色體,在正常的情況下細胞分裂時染色體被紡錘絲牽引平均分向細胞的二極,形成二個正常的核,被平均分配給二個細胞。在染色體斷裂劑如絲裂霉素存在下,染色體發(fā)生斷裂,并不發(fā)生重接或不在原處重接,則形成了無著絲粒的段片,在細胞分裂后期不能向兩極移動,而殘留在細胞中央的赤道板附近,當子細胞形成時則游離于細胞質(zhì)中形成不含著絲粒的微核 。非整倍體劑可以使染色體和紡錘體聯(lián)結(jié)發(fā)生障礙或紡錘體功能受損。在細胞分裂時,染色體不發(fā)生分離而產(chǎn)生非整倍體子細胞,同時在赤道板中央殘留一條或多條染色體,它們在子細胞形成時不能被包在子核中,而游離于細胞質(zhì)中形成含著絲粒的微核。一般的遺傳毒性物質(zhì)兼有染色體

10、斷裂劑和非整倍體劑兩方面的作用。18核體出芽間期的細胞核向外形成瘤狀突起,形成芽體最后脫離開主核而形成微核。 放射線放射線可以引起DNA 損傷,產(chǎn)生錯誤修復的雙鏈斷裂,導致微核出現(xiàn)。19 自發(fā)在正常情況下生物也會自然出現(xiàn)較低頻率的微核,在人類一般隨年齡增大而增加,往往女性高于男性。主要由于自身的免疫力低下和超氧化物、自由基、易氧化物等因素較多有關(guān)。 化學誘變劑即染色體斷裂劑和非整倍體劑。 細胞組成成份VB12 、葉酸缺乏可引起微核。 抗氧化劑谷胱甘肽、VC 、VE、硒等具有降低微核產(chǎn)生的能力,主要是可以清除體內(nèi)的超氧化物等物質(zhì)有關(guān)。 其他因素微核也是細胞凋亡的產(chǎn)物,當程序性死亡基因激活,隨之C

11、a + + 依賴性內(nèi)切酶激活,切割DNA ,形成細胞核碎片,形態(tài)學表現(xiàn)為核深染,染色質(zhì)邊緣分布的帽形核,最后導致微核形成 。影響微核產(chǎn)生的因素20常規(guī)微核試驗是利用細胞生物學方法經(jīng)顯微制片后在顯微鏡下直接計數(shù)待測材料微核率的方法。這是普遍采用的基本方法,可以分為兩類:將微核試驗材料,在加入待測物質(zhì)的環(huán)境中培養(yǎng)一段時間,染色制片,顯微觀察計算微核率。直接將受遺傳毒理損害生物的相應(yīng)材料制片,顯微觀察計算微核率。細胞分裂阻滯微核分析法1985 年Fenech 等人建立的方法,用胞質(zhì)分裂阻滯劑阻斷胞質(zhì)分裂,但不影響細胞核分裂,有絲分裂細胞呈特殊形態(tài)的雙核細胞,未發(fā)生核分裂的細胞則維持單核細胞形態(tài)。檢測

12、致突變因素作用后的雙核細胞率和雙核細胞微核率,可同時獲得致突變因素對細胞的遺傳毒性損害和對細胞周期影響的信息 。微核試驗技術(shù)的種類21熒光原位雜交試驗與DNA 探針熒光原位雜交( Fluorescence in situ hybridization ,FISH) 技術(shù)是近年來開展起來的分子生物學新技術(shù)。它是使用生物熒光素標記的各類DNA和RNA 探針與細胞或組織在玻片上進行原位雜交,被觀察的特定DNA 片段(或序列) 在熒光顯微鏡下固定在細胞核或染色體的原有部位顯示熒光。利用熒光原位雜交試驗可以檢測是染色體斷裂還是染色體丟失,以及可以判斷是哪一條染色體,那一段所產(chǎn)生的微核。目前已成功用于MN

13、實驗的DNA 探針主要有兩類:第一類:是含DNA 重復序列的探針,主要用于檢測染色體著絲粒的DNA。第二類:是含染色體端粒DNA 序列的探針,它主要顯示染色體臂的存在。22抗著絲粒抗體染色(CREST 染色) 抗著絲?？贵w(Anti - kinetochore antibodies) 是美國學者Moroi 及其同事于1980年在硬皮病病人血清中發(fā)現(xiàn)的一種自動抗體,這些自動抗體可以通過免疫熒光技術(shù)檢測到。他們與染色體著絲粒蛋白(抗原) 成份相結(jié)合。具有較強的特異性。但并不所有硬皮病病人的血清中都含有該自動抗體,含該抗體的病人皮膚損害往往并不嚴重和廣泛。但卻有顯著的CREST 征。所以將用該種病人

14、的血清對染色體著絲粒的染色直接稱為CREST 染色(CREST staining) 。CREST 染色用來區(qū)分MN來源(染色體段片還是整條染色體) ,了解誘導MN 的化合物性質(zhì)(斷裂劑還是整倍體劑) 。23自動化檢測法流式細胞儀檢測方法流式細胞儀(Flow cytometry) 檢測方法是20 世紀70 年代發(fā)展起來的定量測定細胞和亞細胞成份的方法。流式細胞儀是利用激光束為光源,將待測樣品進行熒光染色,然后在液體載體里以單個細胞通過激光束,產(chǎn)生熒光信號并轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柾ㄟ^儀表顯示來達到定量測定的目的。流式細胞儀檢測MN 有很多優(yōu)點:檢測速度至少比人工讀片快40100 倍。減少了人為的主觀因素。新型流式細胞儀具有分選功能,對判定為含MN 的細胞,可以分類檢出并收集在玻片上或試管里,在顯微鏡下檢查驗證,以證實其真實性并計算其可置信度。24計算機圖像分析系統(tǒng)檢測計算機圖像分析系統(tǒng)是將高分辨力攝像機和計算機結(jié)合起來將圖像分解為若干點,再將每個點的圖像色差轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號,儲存在計算機里進行各定量參數(shù)的計算。從80 年代中期開始利用計算機圖像分析技術(shù),其檢測速度也至少比人工計算快10 倍以上,但容易受條件因素影響,還需進一步完善。25微核試驗的應(yīng)用 微核試驗廣泛應(yīng)用于藥品、食品添加劑、農(nóng)藥、化妝品、工業(yè)化學品、環(huán)境污染物等遺傳毒性的