細胞的程序化死亡精選課件

1、12.1 Cellular agingHayflick limitation 1961年，Hayflick 首次報道了體外培養(yǎng)的人成纖維細胞(human fibroblast)具有增殖分裂的極限。他利用來自胚胎和成體的成纖維細胞進行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)胚胎的成纖維細胞分裂傳代50次后開始衰退和死亡，而來自成年組織的成纖維細胞只能培養(yǎng)1530代就開始死亡。 體外培養(yǎng)人的成纖維細胞，在體外分裂次數(shù)有限，證明細胞不是不死的將老年的人的成纖維細胞與年輕的人的成纖維細胞同時培養(yǎng)，年輕狀態(tài)的細胞在體外分裂次數(shù)更多，說明衰老與供體細胞的年紀有關(guān)老年的人的成纖維細胞與年輕的人的成纖維細胞進行混合和單獨培養(yǎng)比較實驗，

2、發(fā)現(xiàn)二者的分裂次數(shù)沒有變化，說明與培養(yǎng)的環(huán)境無關(guān)利用細胞雜交的方法確定引起衰老的真正原因。年輕的胞質(zhì)體與年老的完整細胞融合，雜種細胞不能分裂；年老的胞質(zhì)體與年輕的完整細胞融合，雜種細胞分裂能力與年輕相同，證明細胞核是導(dǎo)致衰老的真正原因 Human fibroblast cultured in vitroYONGOLD早老癥兒童與正常兒童的比較12.1.1 衰老細胞的特征 細胞衰老的分子機理（一）差錯學(xué)派 1、代謝廢物積累：如：脂褐質(zhì) 2、自由基攻擊：導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)變異，正常細胞內(nèi)存在清除自由基的防御系統(tǒng)： 酶系統(tǒng)：超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化氫酶(CAT)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-

3、PX)； 非酶系統(tǒng)：維生素E，醌類等電子受體。遺傳論學(xué)派1、細胞有限分裂學(xué)說 “Hayflick”極限，即細胞最大分裂次數(shù)。 L.Hayflick (1961)報道，人的成纖維細胞在體外培養(yǎng)時增殖次數(shù)是有限的（6070代）。 細胞增殖次數(shù)與端粒DNA長度有關(guān)。 2、重復(fù)基因失活學(xué)說：如哺乳動物rRNA基因數(shù)隨年齡而減少。3、衰老基因?qū)W說 子女的壽命與雙親的壽命有關(guān)； 各種動物都有相當恒定的平均壽命和最高壽命； 成人早衰癥：平均39歲時出現(xiàn)衰老，47歲生命結(jié)束； 嬰幼兒早衰癥：1歲時出現(xiàn)明顯的衰老，1218歲生命結(jié)束， 早衰癥患者體內(nèi)解旋酶發(fā)生突變。 Caenrhabditis elegans的

4、平均壽命僅3.5天，該蟲age-1 單基因突變，可提高平均壽命65%，提高最大壽命110%。自由基攻擊細胞的證據(jù)12.2 PCD (program cell death)Death Necrosis:apoptosis12.2.1 Introduction 細胞壞死 是細胞受到急性強力傷害時立即出現(xiàn)的反應(yīng)。 早期表現(xiàn)為細胞膜破壞，線粒體腫脹 繼而溶酶體破裂,細胞內(nèi)容物流出, 引起炎癥。2002年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎英國科學(xué)家悉尼布倫納（SydneyBrenner）英國科學(xué)家約翰蘇爾斯頓（JohnE.Sulston）美國科學(xué)家羅伯特霍維茨（H.RobertHorvitz） 2002年的諾貝爾生理

5、學(xué)和醫(yī)學(xué)獎授予了在器官發(fā)育和程序性細胞死亡研究領(lǐng)域中做出奠基性貢獻的3位科學(xué)家:英國的Brenner、Sulston和美國的Horvitz他們創(chuàng)造性地用線蟲作為實驗?zāi)Ｐ?實現(xiàn)了對器官發(fā)育過程中細胞分裂、分化的原位觀察,完成了細胞圖譜的繪制,在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)并研究了調(diào)控器官發(fā)育程序性細胞死亡的關(guān)鍵基因及其功能并進一步在高等哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了相關(guān)功能基因。Kerr（ 1972）最先提出，與細胞壞死的區(qū)別是： 細胞通過出芽的方式形成許多凋亡小體； 凋亡小體內(nèi)有結(jié)構(gòu)完整的細胞器； 不引起炎癥； 線粒體無明顯形態(tài)變化，溶酶體活性不增加； 內(nèi)切酶活化，DNA有控降解，凝膠電泳圖譜呈梯狀； 凋亡通常是生理性變化

6、，而細胞壞死是病理性變化。 12. 2.2 Necrosis and apoptosis PCDPCD NecrosisapoptosisDNA LADDER 180200bp轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 tTG （tissue Transglutaminase） increase Biology and chemical character 細胞凋亡和細胞壞死的區(qū)別區(qū)別點細胞凋亡細胞壞死起因生理或病理性病理性變化或劇烈損傷范圍單個散在細胞大片組織或成群細胞細胞膜保持完整，一直到形成凋亡小體破損染色質(zhì)凝聚在核膜下呈半月狀呈絮狀細胞器無明顯變化腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)崩解細胞體積固縮變小腫脹變大凋亡小體有，被鄰近細胞或巨噬

7、細胞吞噬無，細胞自溶，殘余碎片被巨噬細胞吞噬基因組DNA有控降解，電泳圖譜呈梯狀隨機降解，電泳圖譜呈涂抹狀蛋白質(zhì)合成有無調(diào)節(jié)過程受基因調(diào)控被動進行炎癥反應(yīng)無，不釋放細胞內(nèi)容物有，釋放內(nèi)容物。PCD regulate nerve cell number 1:形態(tài)學(xué)2:電泳方法彗星電泳3:DNA TUNEL4: Caspase activity Western blot5: Flow cytometric analysis 12.2.4 Unravel mechanism of apoptosis12. 2.4.1 CED3/CASPASESCaspases: (cysteine asparic

8、acic specific protease)Caspases 高度選擇切割蛋白質(zhì)，發(fā)生在少數(shù)結(jié)構(gòu)域區(qū)域，活化或者失活但不降解蛋白質(zhì)Caspases Caspases2，8，9，10；take part in start PCD Caspases3，6，7；take part in perform PCD Caspases1，4，12； indirect function Caspases regulate in mammalPCD gene in C.elegans C.elegans : Ced3 Ced4 Ced9Human ：ICE,apopain(死亡酶）, Apaf1 Bcl2A

9、受體介導(dǎo)的程序性細胞死亡途徑NATURE REVIEWS | CANCER VOLUME 2 | APRIL 2002 | 277Death inducing signaling complex Fas與配體（如TNF）結(jié)合發(fā)生三聚化， 使胞內(nèi)的DD 區(qū)（ Death domain）與接頭蛋白FADD的DD區(qū)結(jié)合。FADD N 端通過DED 區(qū)（ death effector domain）與Caspase-8前體結(jié)合，Caspase-8通過自剪接激活。Caspase-8引起caspase級聯(lián)反應(yīng)，激活Caspase-3、6、7。Caspase可降解結(jié)構(gòu)蛋白、信號蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白、周期蛋白等

10、等。胞外信號分子誘導(dǎo)的細胞凋亡途徑小結(jié)凋亡信號通路 當細胞接受凋亡信號分子(Fas,TNF等)后，凋亡細胞表面信號分子受體相互聚集并與細胞內(nèi)的銜接蛋白(Adaptor protein)結(jié)合，這些銜接蛋白又募集Procaspases聚集在受體部位，Procaspase相互活化并產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，下游Caspases活化后使細胞凋亡。 裂解核纖層蛋白，導(dǎo)致細胞核形成凋亡小體； 裂解DNase結(jié)合蛋白，使DNase釋放，降解DNA形成DNA Ladder; 裂解參與細胞連接或附著的骨架和其他蛋白，使凋亡細胞皺縮、 脫落，便于細胞吞噬；致膜脂PS重排，便于吞噬細胞識別并吞噬。 12.2.4.2 CED4/

11、Apaf1Apoptosis protease activating factorsApaf2就是細胞酶色素CB 細胞內(nèi)源信號激發(fā)細胞程序性死亡Apoptosis protease activating factors Apaf2 C. elegans 12. 2.4.3 Bcl-2家族與細胞凋亡Bcl-2是一種原癌基因，是ced-9在哺乳類中的同源物，能抑制細胞凋亡；與線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相結(jié)合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的結(jié)構(gòu)域；Bcl-2家族成員的基因中，常常含有三個保守的Bcl-2同源區(qū)，即BH1，BH2和BH3 Bcl-2基因蛋白表達可抑制多種組織細胞的凋亡，Bcl-2蛋白是線粒體膜關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定蛋白，它主要位于線粒體外膜、核被膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。高濃度Bcl-2蛋白抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子的釋放哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)的Apaf2即是CytC Bcl-2、線粒體與細胞凋亡 Bcl-2對線粒體功能的調(diào)控抑制凋亡蛋白：Bcl-2、Bcl-XL、Mc12、Bfe1、A1。促凋亡蛋白：Bax、Bcl-XS、Bad、Bak、Bik等，分布在線粒體外膜、核膜