臨床免疫學(xué)與檢驗：發(fā)光免疫技術(shù)

1、發(fā)光免疫技術(shù)Luminescence Immunoassay發(fā)光免疫技術(shù)(luminescence immunoassay, LIA)是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。這種方法不僅具有發(fā)光分析的高靈敏度和抗原抗體反應(yīng)的高度特異性,而且還具有分離簡便,可以實現(xiàn)自動化分析特點,使之成為醫(yī)學(xué)、生物學(xué)研究領(lǐng)域中一種新的重要的免疫學(xué)分析手段。根據(jù)發(fā)光方式不同發(fā)光免疫技術(shù)主要分為：發(fā)光酶免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析 發(fā)光與化學(xué)發(fā)光劑一、發(fā)光 一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時，釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射，稱為發(fā)光 (luminescence)。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的激發(fā)能

2、可將發(fā)光分為三種類型: 1.光照發(fā)光 2.生物發(fā)光 3.化學(xué)發(fā)光。1. 光照發(fā)光(photoluminescence)發(fā)光劑經(jīng)短波長入射光照射后進入激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時發(fā)出較長波長的可見光 。電子e光子基態(tài)能級2. 生物發(fā)光(bioluminescence)典型例子為螢火蟲發(fā)光。反應(yīng)底物為螢火蟲熒光素 (firefly luciferin)，在熒光素酶(luciferase)的催化下利用ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化螢火蟲熒光素 (oxyluciferin)，后者在回復(fù)到基態(tài)時多余的能量以光子形式放出。反應(yīng)式如下:3.化學(xué)發(fā)光(Chemiluminescence)化學(xué)發(fā)光是在常溫下經(jīng)化學(xué)反應(yīng)所

3、產(chǎn)生的發(fā)射光?；瘜W(xué)發(fā)光是一個多步驟的過程，其機制為某些化合物(發(fā)光劑或發(fā)光底物)可以利用一個化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能量使其產(chǎn)物分子或反應(yīng)中間態(tài)分子上升至電子激發(fā)態(tài)。當(dāng)此產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子衰退至基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放能量(即發(fā)光)。 二 化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光劑（luminescence reagent）是指在發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物。根據(jù)上述發(fā)光特點可將發(fā)光劑分為熒光素、生物發(fā)光劑和化學(xué)發(fā)光劑三種?；瘜W(xué)發(fā)光免疫技術(shù)中常用的化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物 酶促反應(yīng)的發(fā)光底物 直接化學(xué)發(fā)光劑 電化學(xué)發(fā)光劑 1酶促反應(yīng)的發(fā)光底物酶促反應(yīng)的發(fā)光底物是指經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光

4、底物，目前化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)中常用的酶有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（ALP），相應(yīng)發(fā)光底物為： HRP的發(fā)光底物 HRP的發(fā)光底物 (1) HRP的發(fā)光底物 常用的底物為魯米諾或其衍生物和對-羥基苯乙酸。魯米諾或其衍生物 魯米諾的氧化反應(yīng)在堿性緩沖液中進行，通常以0.1mol/L pH8.6 Tris緩沖液作底物液，發(fā)光反應(yīng)式如下:對-羥基苯乙酸（HPA） 對-羥基苯乙酸（HPA）在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚體（熒光物質(zhì)），在350nm激發(fā)光作用下，發(fā)出450nm波長的熒光，可用熒光光度計測量。反應(yīng)式如下：（2）ALP的發(fā)光底物常用的底物為3-（2-螺旋金剛烷-4-甲氧基-

5、4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）和4-甲基傘形酮磷酸鹽（4-MUP，熒光底物）。AMPPDAMPPD在堿性條件下，被ALP酶解生成相當(dāng)穩(wěn)定的AMP-D陰離子，其有2-30min的分解半衰期，發(fā)出波長為470nm的持續(xù)性光，在15min時其強度達到高峰，15 60min內(nèi)光強度保持相對穩(wěn)定。發(fā)光反應(yīng)式如下：4-MUP4-MUP在ALP催化下生成4-甲基傘形酮，在360nm激發(fā)光的作用下，發(fā)出448nm的熒光，用熒光光度計進行測量。反應(yīng)式如下：2直接化學(xué)發(fā)光劑這類發(fā)光劑不需酶的催化作用，只需改變?nèi)芤旱膒H等條件就能發(fā)光，如吖啶酯（acridinium, AE）在

6、含過氧化氫的稀堿溶液中即能發(fā)光,反應(yīng)式如下:3.電化學(xué)發(fā)光劑是指通過在電極表面進行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出光的物質(zhì)。化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+（圖19-1）和電子供體三丙胺（TPA）在陽性電極表面可同時失去一個電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。二價的Ru(bpy)32+被氧化成三價，成為強氧化劑，TPA失去電子后被氧化成陽離子自由基TPA+，它很不穩(wěn)定，可自發(fā)地失去一個質(zhì)子（H+），形成自由基TPA.，成為一種很強的還原劑，可將一個高能量的電子遞給三價的Ru(bpy)33+使其形成激發(fā)態(tài)的Ru(bpy)32+.。3.電化學(xué)發(fā)光劑激發(fā)態(tài)的三聯(lián)吡啶釕不穩(wěn)定，很快發(fā)射出一個波長為620nm的光子，回復(fù)到基態(tài)

7、的三聯(lián)吡啶釕。這一過程可在電極表面周而復(fù)始地進行，產(chǎn)生許多光子，使光信號增強 。圖19-2 電化學(xué)發(fā)光原理圖 圖19-1 三聯(lián)吡啶釕分子結(jié)構(gòu)圖三、化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記物的制備化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記物是將化學(xué)發(fā)光劑與抗體或抗原結(jié)合在一起的復(fù)合物，亦稱發(fā)光標(biāo)記物。其標(biāo)記方法很多，大多是利用交聯(lián)劑使化學(xué)發(fā)光劑與被標(biāo)記物分子結(jié)構(gòu)中的游離的氨基、羧基、硫氫基（-SH）、羥基等基團形成不可逆連接。如吖啶酯類化學(xué)發(fā)光劑常用N-羥基琥珀酰亞胺活化法，使蛋白質(zhì)（抗體或抗原）分子中的羧基，通過N-羥基琥珀酰亞胺活化，再與發(fā)光劑的氨基偶聯(lián)形成酰胺鍵的發(fā)光標(biāo)記物。三聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+ N-羥基琥珀酰胺（NHS）可與蛋白質(zhì)

8、、半抗原激素、核酸等多種化合物結(jié)合成化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記物，故ECLIA檢測的項目較廣泛。發(fā)光酶免疫分析 原 理 技術(shù)要點 方法學(xué)評價一、原 理發(fā)光酶免疫分析（luminescence enzyme immunoasssay， LEIA）實際上屬于酶免疫測 定中一種類型，只是最后一步酶促反應(yīng)所用底物為發(fā)光劑，通過發(fā)光反應(yīng)發(fā)出的光在特定儀器上進行測定。常用的標(biāo)記酶有辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase ,ALP）,根據(jù)酶促反應(yīng)底物不同，可分為熒光酶免疫分析和化學(xué)發(fā)光酶免疫分析。熒光酶免疫分析就是利用理想的酶熒光底

9、物，經(jīng)酶促反應(yīng)生成穩(wěn)定且高效的熒光物質(zhì)，通過測定熒光強度進行定量。圖19-3 熒光酶免疫分析（雙抗體夾心法） 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析就是利用酶對發(fā)光底物催化作用而直接發(fā)光，通過光強度的測定而直接進行定量。圖21-4 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（雙抗體夾心法） 二技術(shù)要點 發(fā)光酶免疫分析的技術(shù)要點：包括抗原抗體反應(yīng)標(biāo)記物游離部分和結(jié)合部分分離酶促發(fā)光反應(yīng)及檢測等三部分。（一）抗原抗體反應(yīng) 抗原抗體反應(yīng)模式主要有以下三類。1雙抗體夾心法2雙抗原夾心法3固相抗原競爭法1雙抗體夾心法用固相抗體和酶標(biāo)抗體與待測標(biāo)本中相應(yīng)抗原反應(yīng)，生成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)B/F分離，加入底物經(jīng)酶促反應(yīng)后發(fā)光，其發(fā)光量與

10、待測標(biāo)本中抗原含量呈正比。2雙抗原夾心法該法常用于抗體的檢測，用固相抗原和酶標(biāo)記抗原與待測標(biāo)本中相應(yīng)抗體反應(yīng)，生成固相抗原-待測抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，經(jīng)B/F分離，在免疫復(fù)合物中加入底物進行酶促發(fā)光，其發(fā)光量與待測標(biāo)本中抗體含量呈正比。3固相抗原競爭法該法常用于多肽類小分子抗原的測定，用已知固相抗原和待測標(biāo)本的相應(yīng)抗原與一定量的酶標(biāo)記抗體發(fā)生競爭性結(jié)合反應(yīng)，反應(yīng)平衡后經(jīng)B/F分離，固相抗原與酶標(biāo)抗體形成復(fù)合物被留下來，通過加入底物進行酶促發(fā)光反應(yīng)，其發(fā)光量與待測標(biāo)本中抗原含量呈反比。（二）游離和結(jié)合部分分離 是將游離酶標(biāo)記物和酶標(biāo)記物免疫復(fù)合物進行分離過程，常用分離技術(shù)有：1磁顆粒分離法2微粒

11、子捕獲法3包被珠分離法 1磁顆粒分離法用抗原或抗體包被的磁顆粒與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體和酶標(biāo)的抗體或抗原通過一定模式的免疫學(xué)反應(yīng)后,最終通過磁場將結(jié)合酶標(biāo)記物免疫復(fù)合物和游離酶標(biāo)記物進行分離的技術(shù)。2微粒子捕獲法與磁顆粒分離法所不同是所用顆粒是無磁性的微粒子作為抗體或抗原的包被載體, 然后用纖維膜柱子進行酶標(biāo)記物的結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的分離。3包被珠分離法將用聚苯乙稀等實驗材料制成小珠, 在小珠上包被抗原或抗體,經(jīng)抗原抗體反應(yīng)后,將結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的酶標(biāo)記物進行分離。（三）酶促發(fā)光反應(yīng)和結(jié)果計算以熒光酶免疫分析為例，加入底物4-MUP，酶標(biāo)抗體上ALP將4-MUP分解，脫磷酸根基團后形成4-甲基

12、傘形酮（4-MU），它在360nm激發(fā)光的照射下，發(fā)出448nm的熒光，經(jīng)熒光讀數(shù)儀記錄，放大，最后根據(jù)標(biāo)準曲線由電腦計算出所測物質(zhì)的含量。三、方法學(xué)評價1.靈敏度高 經(jīng)過酶和發(fā)光兩級放大，并加入發(fā)光增強劑以提高敏感度和發(fā)光穩(wěn)定性，故方法學(xué)靈敏度較高。2.非特異性本底的問題 酶標(biāo)抗體或酶標(biāo)抗原因非特異性吸附而易造成較高本底，實驗評價時應(yīng)引起注意。3.非特異性酶的影響 血清中其他來源的過氧化物酶類物質(zhì)由于洗滌不夠徹底，易產(chǎn)生非特異性酶化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，影響測定結(jié)果。化學(xué)發(fā)光免疫分析 原 理 技術(shù)要點 方法學(xué)評價一、原 理化學(xué)發(fā)光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，C

13、LIA）是用化學(xué)發(fā)光劑（吖啶酯）直接標(biāo)記的抗原或抗體與待測標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原、磁顆粒性的抗原或抗體反應(yīng)，通過磁場把結(jié)合狀態(tài)（B）和游離狀態(tài)（F）的化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記物分離開來，然后在結(jié)合狀態(tài)（B）部分中加入發(fā)光促進劑進行發(fā)光反應(yīng)，通過對結(jié)合狀態(tài)（B）發(fā)光強度的檢測進行定量或定性檢測。圖21-5 化學(xué)發(fā)光免疫分析反應(yīng)原理（雙抗體夾心法） 二、技術(shù)要點化學(xué)發(fā)光免疫分析的技術(shù)要點包括抗原抗體反應(yīng)、標(biāo)記物游離部分和結(jié)合部分分離、直接發(fā)光反應(yīng)及檢測等三部分。1抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)類型同酶發(fā)光免疫測定技術(shù)，主要也有雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和固相抗原競爭法等三種主要模式?，F(xiàn)以雙抗體夾心法為例，將包被單克

14、隆抗體的磁顆粒和待測標(biāo)本加入到反應(yīng)管中，標(biāo)本中待測抗原與磁顆粒上抗體結(jié)合，再加上吖啶酯標(biāo)記抗體，經(jīng)過溫育，形成磁顆粒抗體-抗原-吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物。2游離和結(jié)合部分的分離常用磁顆粒分離技術(shù)，在電磁場中進行2-3次洗滌后，很快地將未結(jié)合的多余抗原和吖啶酯標(biāo)記抗體洗去，而磁顆?？贵w-抗原-吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物和磁顆?？贵w留下。3化學(xué)發(fā)光反應(yīng)經(jīng)過洗滌的磁性顆粒中，加入pH糾正液（NaOH）使其呈堿性，然后加入氧化劑（H2O2），這時吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解并發(fā)光，由集光器進行接收，經(jīng)光電倍增管放大作用，記錄1秒鐘內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與被測抗原含量成正比，根據(jù)標(biāo)準曲線，儀器可以自

15、動計算出其抗原含量。三、方法學(xué)評價吖啶酯作為標(biāo)記物的優(yōu)點是其低背景噪音、化學(xué)反應(yīng)簡單、快速而無催化劑。吖啶酯用作標(biāo)記物時，其與大分子的結(jié)合并無減少所產(chǎn)生的光量，從而增加靈敏度，靈敏度可達10-15g/ml。吖啶酯標(biāo)記試劑有效期長，可達一年。固相分離劑為極為幼細的磁粉，除增大包被面積，加快反應(yīng)外，亦同時使清洗及分離更簡易、快捷。電化學(xué)發(fā)光免疫分析 原 理 技術(shù)要點 方法學(xué)評價一. 原 理電化學(xué)發(fā)光免疫分析(electrochemiluminescence immunoassay, ECLI)是電化學(xué)發(fā)光（ECL）和免疫測定相結(jié)合的產(chǎn)物。 它的標(biāo)記物的發(fā)光原理與一般化學(xué)發(fā)光（CL）不同，是一種在電

16、極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，實際上包括了電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個過程。ECL與CL的差異在于ECL是電啟動發(fā)光反應(yīng)，而CL是通過化合物混合啟動發(fā)光反應(yīng)。用化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+標(biāo)記抗體，通過抗原抗體反應(yīng)和磁顆粒分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強度的大小對帶測的抗原或抗體進行定量或定性。圖21-6 電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)反應(yīng)原理(雙抗體夾心法)二技術(shù)要點電化學(xué)發(fā)光免疫分析的技術(shù)要點也包括抗原抗體反應(yīng)、標(biāo)記物游離部分和結(jié)合部分分離、電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)及檢測等三部分。1抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)類型同酶發(fā)光免疫測定技術(shù)，主要也有雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和固相抗原競爭法等

17、三種主要模式。現(xiàn)以雙抗體夾心法為例，三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體和生物素標(biāo)記抗體與待測標(biāo)本同時加入一個反應(yīng)杯中孵育反應(yīng)，然后加入鏈霉親和素包被磁珠，再次孵育，使生物素通過與親和素的結(jié)合將磁珠、抗體連接為一體，形成雙抗體夾心物即Ru(bpy)32+-抗體-抗原-抗體-生物素-鏈霉親和素-磁珠復(fù)合體。2游離和結(jié)合部分的分離常用磁顆粒分離技術(shù)，蠕動泵將形成的雙抗體夾心物吸入流動測量室，此時，磁珠被工作電極下面的磁鐵吸附于電極表面。同時，游離的抗體（與生物素結(jié)合的和與Ru(bpy)32+結(jié)合的抗體）也被吸出測量室。3.電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)蠕動泵加入含三丙胺（TPA）的緩沖液，同時電極加電壓，啟動ECL反應(yīng)過程。該過程

18、在電極表面周而復(fù)始地進行，產(chǎn)生許多光子，光電倍增管檢測光強度，光強度與Ru(bpy)32+的濃度呈線性關(guān)系,根據(jù)標(biāo)準曲線算出待測抗原的含量。最后，終止電壓，移開磁珠，加入清洗液沖洗流動測量室，準備下一個樣品測定。三方法學(xué)評價標(biāo)記物的再循環(huán)利用，使發(fā)光強度更高、時間更長、易于測定具有靈敏度高，可達pg/ml水平線性范圍寬反應(yīng)時間短試劑穩(wěn)定好等特點化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是免疫測定技術(shù)繼酶免技術(shù)（EIA）、放免技術(shù)（RIA）、熒光免疫技術(shù)（FIA）和時間分辨熒光免疫技術(shù)（TRFIA）之后發(fā)展的一項新興測定技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是一種高度敏感的微量測定技術(shù)，凡具有抗原性的物質(zhì)（包括半抗原）都可以用化學(xué)發(fā)光免

19、疫技術(shù)測定。其起步于80年代初，快速發(fā)展于90年代，在國外化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的應(yīng)用處于蓬勃發(fā)展的階段。 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)具備以下特點 ：高度敏感，極限達10-1710-19M/L，遠高于RIA、EIA，與TRFIA相當(dāng)?shù)萒RFIA便宜。特異性強，重復(fù)性好C.V.5。測定范圍寬，可達7個數(shù)量級。試劑穩(wěn)定性好，無污染有效期612月。操作簡單，易于自動化。 在對環(huán)保很重視的國家，CLIA成了取代RIA的首選方法。BECKMANCoulter ACCESS，ACCESS 2 化學(xué)發(fā)光免疫分析儀 ALP標(biāo)記抗原或抗體 ，磁性微粒作為固相載體，抗體直接包被磁珠 AMPPD發(fā)光劑美國強生公司： Vitros

20、 Eci化學(xué)發(fā)光免疫分析儀 Luminol發(fā)光劑，3氯4羥基乙酰苯胺作增強劑 ， 塑料小孔管作為固相載體， 鏈霉親和素包被磁珠， HPR標(biāo)記抗原或抗體美國DPC公司 IMMULITE 2000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀 ALP標(biāo)記抗原或抗體， AMPPD發(fā)光底物， 塑料珠為固相 抗體直接包被塑料珠 ，離心分離固相及液相Bayer公司 ACS180，180plus，180SE 化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng) 吖啶酯為發(fā)光標(biāo)記物，用于標(biāo)記抗體， 磁珠作為固相載體， 抗體直接包被磁珠ROCHE公司: 1010,2010,E170, 電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀 采用：電化學(xué)發(fā)光技術(shù)，生物素-鏈霉親和素技術(shù)， 磁性微粒為固相載體 三聯(lián)吡啶釕作為發(fā)光劑,三丙胺作電子供體. 發(fā)光免疫技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗中應(yīng)用化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)在靈敏度、特異度方面不僅可與RIA法相媲美,而且化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的準確性和試劑盒的有效期等均優(yōu)于RIA 法。由于化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是以化學(xué)發(fā)光劑作為標(biāo)記物進行定量檢測,所以其試劑具有穩(wěn)定和無毒的優(yōu)點。本試驗使用的全自動電化學(xué)發(fā)光儀