噬菌體效價(jià)的測(cè)定在菌苔上逐步形成的噬菌體群體由于其

1、2.噬菌體效價(jià)的測(cè)定 在菌苔上逐步形成的噬菌體群體，由于其侵蝕宿主細(xì)胞的結(jié)果， 會(huì)使菌苔上出現(xiàn)一個(gè)個(gè)噬菌斑。因每種噬菌體的噬菌斑有一定的形狀、大小、邊緣和透明度， 故可用作鑒定的指標(biāo)，也可利用噬菌斑進(jìn)行純種分離和計(jì)數(shù)。這種情況甚像利用菌落可進(jìn)行有關(guān)微生物的分離、計(jì)數(shù)和鑒定那樣。所不同的是噬菌體只形成“負(fù)菌落”。據(jù)測(cè)定，一個(gè)直徑僅為2mm的噬菌斑，其中噬菌體粒子的數(shù)目即高達(dá)107109個(gè)。. 效價(jià)(titre，titer)這一名詞在不同的場(chǎng)合有其不同的含義。在這里，(pfu，plaque-forming unit)數(shù)或感染中心(infective centre)數(shù)。 1 由于試祥中一般噬菌體粒子

2、含量較高，故應(yīng)先對(duì)試樣進(jìn)行梯級(jí)稀釋，然后再選用合適的方法（見以下表解)測(cè)定其效價(jià)。2（1）雙層平板法 是一種被普遍采用并能精確測(cè)定效價(jià)的方法。預(yù)先分別配制含2%和1%瓊脂的底層培養(yǎng)基和上層培養(yǎng)基。先用前者在培養(yǎng)皿上澆一層平板，再在后者(須先融化并冷卻到45以下)中加入較濃的對(duì)數(shù)期敏感菌和一定體積的待測(cè)噬菌體樣品，于試管中充分混勻后，立即倒在底層平板上鋪平待凝，然后保溫。一般經(jīng)十余小時(shí)后即可進(jìn)行噬菌斑計(jì)數(shù)?，F(xiàn)把雙層平板法簡括如下: 34 雙層平板法主要有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)；加了底層培養(yǎng)基后，可使原來底面不平的玻璃皿的缺陷得到了彌補(bǔ)；所形成全部噬菌體斑都接近處于同一平面上，因此不僅每一噬菌斑的大小接近、

3、邊緣清晰，而且不致發(fā)生上下噬菌斑的重疊現(xiàn)象(下圖)；因上層培養(yǎng)基中瓊脂較稀，故形成的噬菌斑較大，更有利于計(jì)數(shù)。 5（2）單層平板法 在上述雙層平板中省略底層，但所用培養(yǎng)基的濃度和所加的量均比雙層平板法的上層為高和多。此法雖較簡便，但其實(shí)驗(yàn)效果較差。（3）玻片快速法 將噬菌體和敏感的宿主細(xì)胞與適量的瓊脂培養(yǎng)基(0.50.8%瓊脂，事前融化)充分混合。涂布在無菌載玻片上，經(jīng)短期培養(yǎng)后，即可在低倍顯微鏡或放大鏡下計(jì)數(shù)。例如，用于金黃色葡萄球菌噬菌體的效價(jià)測(cè)定，僅需2.54.0小時(shí)即可，唯精確度較差。 6(4)斑點(diǎn)試驗(yàn)法 這是一種半定量的預(yù)試驗(yàn)方法。先將敏感的宿主菌濃懸液涂布于合適的培養(yǎng)基平板上，然后

4、使平板表面朝下，在45左右的溫箱中使平板表面不留水膜。再把不同稀釋度待測(cè)試樣依次用接種環(huán)點(diǎn)種在上述平板上。保溫?cái)?shù)小時(shí)后，根據(jù)點(diǎn)樣處是否產(chǎn)生噬菌斑即可初步判斷該試樣的效價(jià)。(5)液體稀釋管法 與用于細(xì)菌活菌計(jì)數(shù)中的系列稀釋法相似。不同處是：各試管中均加有培養(yǎng)液；各管中均須接入處于對(duì)數(shù)期的宿主細(xì)胞；以不長菌的最高稀釋管來計(jì)算效價(jià)。 成斑率7 3.一步生長曲線 一步生長曲線：定量描述烈性噬菌體生長規(guī)律的實(shí)驗(yàn)曲線稱為一步生長曲線。潛伏期，裂解期，平穩(wěn)期。效價(jià)8(1)潛伏期 指噬菌體的核酸侵入宿主細(xì)胞后至第一個(gè)噬菌體粒子裝配前的一段時(shí)間，故整段潛伏期中沒有一個(gè)成熟的噬菌體粒子從細(xì)胞中釋放出來。潛伏期又可

5、分兩段：隱晦期(eclipse phase），指在潛伏期前期人為地(用氯仿)裂解細(xì)胞，裂解液仍無侵染性的一段時(shí)間。胞內(nèi)累積期(intracellular accumulation phase)，又稱潛伏后期。指在隱晦期后，如人為地裂解細(xì)胞，其裂解液已出現(xiàn)侵染性的一段時(shí)間。這是菌體開始裝配的時(shí)期，在電鏡下可觀察到己初步裝配好的噬菌體粒子。9(2)裂解期 緊接在潛伏期后的一段宿主細(xì)胞迅速裂解、溶液中噬菌體粒子急劇增多的一段時(shí)間。噬菌體或其他病毒因沒有個(gè)體生長，只有個(gè)體裝配再加上其宿主細(xì)胞裂解的突發(fā)性，因此，從理論上來分析，裂解期應(yīng)是瞬時(shí)的。但事實(shí)上因?yàn)榧?xì)菌群體中各個(gè)細(xì)胞的裂解不可能是同步的，故實(shí)際

6、上的裂解期還是較長的（見圖）。 (3)平穩(wěn)期(plateau) 指感染后的宿主已全部裂解，溶液中噬菌體效價(jià)達(dá)到最高點(diǎn)后的時(shí)期。10 一步生長曲線實(shí)驗(yàn)最早由Ellis和Delbruck(1939)所設(shè)計(jì)。其基本步驟是：用噬菌體的稀懸液去感染高濃度的宿主細(xì)胞，以保證每個(gè)細(xì)胞至多不超過一個(gè)噬菌體吸附。經(jīng)數(shù)分鐘吸附后，混合液中加入一定量的該噬菌體的抗血清，借以中和尚未吸附的噬菌體。然后用保溫的培養(yǎng)液稀釋此混合液，同時(shí)可中止抗血清的作用。隨即置于該細(xì)菌最適生長溫度下培養(yǎng)。在一定的時(shí)間內(nèi)，每隔數(shù)分鐘從混合懸液中取出一份試樣，并作效價(jià)測(cè)定。114 .溶源性（1）溫和噬菌體 吸附并侵入宿主細(xì)胞后，噬菌體的DN

7、A只整合在宿主的基因組上，并可長期隨宿主DNA的復(fù)制而進(jìn)行同步復(fù)制，因而在一般情況下不進(jìn)行增殖和引起宿主細(xì)胞裂解的噬菌體，稱溫和噬菌體(temperate phage)或溶源噬菌體（lysogenic phage)。這種溫和噬菌體侵入宿主細(xì)胞而不引起宿主細(xì)胞裂解，即稱溶源性或溶源現(xiàn)象。其宿主細(xì)胞稱為溶原菌。12概括地說，溫和噬菌體的特點(diǎn)為：具有整合能力，當(dāng)溫和噬菌體侵入其敏感宿主的細(xì)胞后，前者的核酸可整合到后者的核基因組(genome，即核染色體)上，這種處于整合態(tài)的噬菌體核酸，稱作前噬菌體(prophage）；具有同步復(fù)制能力，前噬菌體在一般情況下不進(jìn)行復(fù)制和增殖， 而是隨宿主細(xì)胞的核基因組

8、的復(fù)制而同步復(fù)制，并平均分布到兩個(gè)子代細(xì)胞中去，如此代代相傳。13由此可見，溫和噬菌體的存在形式有三種：游離態(tài)：指已成熟釋放并有侵染性的游離噬菌體粒子；整合態(tài)：指整合在宿主核染色體上處于前噬菌體的狀態(tài)（一種潛伏的形式）營養(yǎng)態(tài)：指前噬菌體經(jīng)外界理化因子誘導(dǎo)后，脫離宿主核基因組而處于積極復(fù)制和裝配的狀態(tài)。 溫和噬菌體的種類很多，常見的有E.coli的 Mu-1、P-1和P-2噬菌體等。其中， 噬菌體是研究最為透徹的一種溫和噬菌體。14E.coli K12(): 表示一株帶有前噬菌體的大腸桿菌的K12溶源菌株。15（2）溶源菌(1ysogen或lysogenic bacteria)溶源菌有以下幾個(gè)特

9、性：自發(fā)裂解，在溶源菌的分裂過程中，會(huì)有10-210-5個(gè)細(xì)胞發(fā)生自發(fā)裂解(spontaneous lysis），其原因是由于少數(shù)細(xì)胞中原來處于整合態(tài)的前噬菌體轉(zhuǎn)變成營養(yǎng)態(tài)的裂解性噬菌體(lytic phage)之故；復(fù)愈，在溶源性細(xì)菌群體的增殖過程中，一般有10-5的個(gè)體喪失其前噬菌體，并成為非溶源性的細(xì)菌，這一過程稱為復(fù)愈或非溶源化，復(fù)愈后的細(xì)胞其免疫性也隨之喪失； 還有其他特征，以后的章節(jié)將有陸續(xù)介紹。在自然界中各種細(xì)菌、放線菌等都有溶源菌存在。16檢驗(yàn)溶源菌的方法是將少量溶源菌與大量的敏感性指示菌（遇溶源菌裂解后所釋放的溫和噬菌體會(huì)發(fā)生裂解性生活周期者）相混合，然后與瓊脂培養(yǎng)基混勻后倒

10、一平板。過一段時(shí)間后溶源菌就長成菌落。由于在溶源菌分裂過程中有極少數(shù)個(gè)體會(huì)發(fā)生自發(fā)裂解，其釋放的噬菌體可不斷侵染溶源菌菌落周圍的指示菌菌苔，所以會(huì)產(chǎn)生一個(gè)個(gè)中央有溶源菌小菌落、四周有透明圈的特殊噬菌斑。17（二）植物病毒1、大多為ssRNA病毒。2、基本形態(tài)為桿狀、絲狀、球狀。3、對(duì)宿主的專一性較差，如TMV等。4、引起植物病害癥狀：破壞植物的葉綠體或葉綠素，是植 物葉片發(fā)生黃化、紅化或發(fā)生花葉；使植物發(fā)生矮化、叢枝或畸形；形成枯斑或壞死。5、增值中的侵入是被動(dòng)方式。6、已知植物病毒有700多種（1989）。18（三）人類和脊椎動(dòng)物病毒1、核酸類型很多，dsDNA，ssDNA，dsRNA，ssRNA。2、一般呈球狀。3、種類：300+9004、常見的人病毒 引起的疾?。焊忻?、肝炎、皰疹、流行性乙型腦炎、狂犬病以及艾滋病等。動(dòng)物疾?。贺i瘟、