蛹蟲草培養(yǎng)基中蟲草素分離提取的工藝綜述

1、蛹蟲草培養(yǎng)基中蟲草素分離提取的工藝綜述摘要：查閱了相關(guān)文獻(xiàn)，對蛹蟲草的化學(xué)成分及其藥理作用、蛹蟲草培養(yǎng)基的配制及蛹蟲草的栽培作了簡介。對蟲草素的物化性質(zhì)及生理活性作了詳細(xì)綜述，并對蟲草素分離提純在國內(nèi)外研究動(dòng)態(tài)進(jìn)行了介紹，從而為從蛹蟲草培養(yǎng)基中分離蟲草素的新工藝提供了分析資料。關(guān)鍵詞：蛹蟲草培養(yǎng)基；蟲草素；分離提取一、蛹蟲草（一）蛹蟲草的化學(xué)成分蛹蟲草又名北冬蟲夏草，與我國名貴中藥材冬蟲夏草為同屬異種，屬于真菌界子囊菌門麥角菌科蟲草屬。在我國主要分布于吉林、河北、四川、湖南、湖北及山西等省。北方民間曾把它當(dāng)作冬蟲夏草應(yīng)用，新華本草綱要記載其性平，味甘，有益肺腎，補(bǔ)精髓，止血化痰”用于肺結(jié)核、老

2、人虛弱和貧血等癥狀，為珍貴的中藥材。國內(nèi)外學(xué)者對其化學(xué)成分、生理活性進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，也從中分得了大量單體化合物。姜泓等從其子實(shí)體中分離出7個(gè)化合物，分別鑒定為3匕脫氧腺苷，腺苷、N6-甲基腺苷、05-乙?；x草素、N6-B（乙酰胺甲酰）氧乙基腺苷、蟲草環(huán)肽A和麥角甾醇過氧化物。實(shí)體中還包括蟲草酸（D-甘露醇）、蟲草多糖等多種有效成分，其中Zn/Cu=4.3，為人參的1.4倍，為黃芪等補(bǔ)益藥的2.8倍。核苷類衍生物是蛹蟲草重要的活性成分，蟲草素是蟲草最重要的活性成分之一，是蟲草中的一種腺苷類結(jié)構(gòu)類似物，具有顯著的藥理作用。（二）蛹蟲草的藥理作用蛹蟲草由蟲草屬真菌寄生在鱗翅目、鞘翅目及雙翅目的

3、一些昆蟲的蛹或幼蟲體上，使蟲體僵死，抽生出子座而形成的。對它的藥理作用方面，2006年文庭池進(jìn)行了比較詳細(xì)的概述，認(rèn)為蛹蟲草具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等作用。中醫(yī)認(rèn)為，蟲草入肺腎二經(jīng)，既能補(bǔ)肺陰，又能補(bǔ)腎陽，主治腎虛，陽痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱,勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時(shí)平衡、調(diào)節(jié)陰陽的中藥。蛹蟲草含有8種維生素，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的作用，對植物神經(jīng)系統(tǒng)具有外周抗膽堿作用，能降低副交感神經(jīng)興奮性。蛹蟲草還具有鎮(zhèn)靜作用，并且對心悸、失眠有較好的治療作用。陳桂寶等對蛹蟲草的藥理作用進(jìn)行了研究，觀察到蛹蟲草對人黑色素瘤B16細(xì)胞、人白血病HL-60細(xì)胞、人體紅血病K562細(xì)胞

4、具有較好的抗瘤效果，有些作用優(yōu)于冬蟲夏草。沈均等也認(rèn)為蛹蟲草具有明顯耐缺氧、增強(qiáng)記憶、抗炎、提高免疫力、促進(jìn)能量代謝等獨(dú)特功效。二、蛹蟲草培養(yǎng)基（一）培養(yǎng)基配制以大米、玉米等作主料，另添加10%25%的蠶蛹粉或奶粉提高蛹蟲草子實(shí)體的品質(zhì)。將培養(yǎng)料與營養(yǎng)液以1:1比例拌勻，pH掌握在5.57.0。按常規(guī)裝瓶、滅菌、接種。（二）蛹蟲草栽培1、栽培條件。碳源，是蛹蟲草合成碳水化合物和氨基酸的基礎(chǔ)，也是重要的能量來源。人工栽培時(shí)，蛹蟲草可利用的碳源有葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、果膠等，其中尤以葡萄糖、蔗糖等小分子糖類的利用效果最好。氮元素，是蛹蟲草自身合成的蛋白質(zhì)、核酸等有機(jī)氮以及銨鹽等無機(jī)氮。能利用

5、的有機(jī)氮很多，如，氨基酸、蛋白胨、豆餅粉、蠶蛹粉等；無機(jī)氮主要有氯化銨、硝酸鈉、磷酸氫二銨等。有機(jī)氮的利用效果最好。礦質(zhì)元素，以磷、鉀、鈣、鎂等為主要元素。一般通過添加無機(jī)鹽類來滿足蛹蟲草對礦質(zhì)元素的需求。維生素，蟲草菌絲不能合成必要的維生素，適當(dāng)加入VB1有利于菌絲的生長發(fā)育。溫度，在蟲草的不同生長發(fā)育階段都有最適溫度、最低溫度和最高溫度的界限。菌絲生長溫度630C，低于6C極少生長，高于30C停止生長，甚至死亡。最適生長溫度為1822C;子實(shí)體生長溫度為1025C,最適生產(chǎn)溫度為2023C。原基分化時(shí)需較大溫差刺激，一般應(yīng)保持510C溫差。水分，是蛹蟲草菌體細(xì)胞的重要組成部分。菌絲生長階段

6、，培養(yǎng)基含水量保持在60%65%,空氣相對濕度保持在60%70%;子實(shí)體生長階段，培養(yǎng)基含水量要達(dá)到65%70%,空氣相對濕度保持在80%90%。要注意培養(yǎng)基適時(shí)補(bǔ)水和補(bǔ)充營養(yǎng)液?？諝?，蛹蟲草需要少量空氣。但在子實(shí)體發(fā)生期要適當(dāng)通風(fēng)，增加新鮮空氣。否則，二氧化碳積累過多，子座不能正常分化，影響生長發(fā)育。光照，孢子萌發(fā)和菌絲生長階段不需要光照，應(yīng)保持黑暗環(huán)境。但轉(zhuǎn)化到生殖生長階段需要明亮的散射光，光照度為100240IX。光照強(qiáng)，菌絲色澤深，質(zhì)量好，產(chǎn)量高。酸堿度，蛹蟲草為偏酸性真菌，其菌絲生長發(fā)育最適pH為5.26.8。但在滅菌和培養(yǎng)過程中pH要下降。所以，在配制培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)調(diào)高pH11.5,

7、在配制培養(yǎng)基時(shí)可加0.1%0.2%的磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀等緩沖物質(zhì)。2、栽培要點(diǎn)。育種，長期采用無性繁殖及多次轉(zhuǎn)管的蛹蟲草菌種，其母本基因容易變異，表現(xiàn)為出草畸形，產(chǎn)質(zhì)量下降。因此，在生產(chǎn)中應(yīng)定期對蛹蟲草菌種進(jìn)行一次有性繁殖。菌絲體培養(yǎng)，接種后的料瓶，應(yīng)置于清潔、避光的環(huán)境中培養(yǎng)，保護(hù)空氣濕度60%。初始階段，為減少雜菌污染，室內(nèi)溫室宜保持在1518C之間，待料面布滿蟲草菌絲后，將溫度提到2023C,持續(xù)15d左右，菌絲即可吃透培養(yǎng)料，完成營養(yǎng)生長。子實(shí)體培養(yǎng)，菌絲體成熟后，由白色逐漸轉(zhuǎn)為桔黃色，此時(shí)，室內(nèi)應(yīng)增加光照，白天利用自然散射光，保持200IX,晚間可利用日光燈作光源，每天應(yīng)不少于1

8、0h光照，以促使菌絲體轉(zhuǎn)色和刺激原基形成。待料面突起，并形成小米粒狀原基時(shí)，要適當(dāng)通風(fēng)，補(bǔ)充新鮮空氣，保護(hù)室內(nèi)溫度1822C,并提高空氣相對溫度至80%85%。如濕度太大，易使培養(yǎng)基提早失水而影響產(chǎn)量。蛹蟲草有較強(qiáng)的趨光性，因此，在子實(shí)體形成后，應(yīng)根據(jù)情況適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)瓶與光源的相對方向，或調(diào)整室內(nèi)光源方向，以保證子實(shí)體的正常生長形態(tài)，從而提高產(chǎn)量。三、蟲草素的研究概況（一）蟲草素的研究價(jià)值1、蟲草素的物化性質(zhì)。1951年Cuningham等觀察到被蛹蟲草寄生的昆蟲組織不易腐爛，隨后從中分離到一種腺苷類活性物質(zhì)，命名為蟲草素，又稱蟲草菌素，確定其結(jié)構(gòu)式為3-脫氧腺苷。蟲草素是第一個(gè)從真菌中分離出

9、來的核苷類抗菌素，其分子式為C10H13N5O3,分子量為251D，堿性，熔點(diǎn)230231C，溶于水、熱乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，紫外光最大吸收波長為259nm。蟲草素的結(jié)構(gòu)式見圖1。2、蟲草素的生物活性。蟲草素是一種抗菌素，具有抗菌、抗病毒、干擾人體RNA及DNA合成、明顯抑制多種腫瘤細(xì)胞生長等作用。Yo-shikawa等將小鼠接種B16黑色素瘤細(xì)胞2周后，給小鼠每天口服5mg/kg和15mg/kg劑量的蟲草素，2周后發(fā)現(xiàn)15mg/kg蟲草素可以明顯抑制小鼠體內(nèi)B16黑色素瘤細(xì)胞的增殖和生長，表明蟲草素對腫瘤細(xì)胞的生長與增殖具有抑制作用。研究表明，蟲草素的抗腫瘤作用可能與其選擇性的抑

10、制mRNA而影響蛋白質(zhì)合成有關(guān)。Koc等研究表明蟲草素對TdT-po-sitive白血病細(xì)胞有特異的細(xì)胞毒作用。而Yamkaguchi等曾用蟲草素同時(shí)處理癌細(xì)胞和正常細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞分裂抑制率達(dá)到55%,正常細(xì)胞分裂抑制率為1.5%。在免疫調(diào)節(jié)方面，Zhou等報(bào)道蟲草素通過誘導(dǎo)產(chǎn)生白介素-10,同時(shí)抑制白介素-2的生成，表明其具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)免疫功能。蟲草素還可以促進(jìn)細(xì)胞分化、抑制細(xì)胞分裂，改變細(xì)胞膜上物質(zhì)結(jié)構(gòu)分布等作用。（二）蟲草素分離提純工藝國內(nèi)外研究狀況對蛹蟲草中蟲草素含量的測定，國內(nèi)外主要采用薄層色譜掃描法、HPLC-DAD、RP-HPLC法、雙波長薄層掃描法、色譜技術(shù)和薄層色譜掃描

11、法聯(lián)用法及其兩者的聯(lián)用法和毛細(xì)管電泳法（CE）。而提取方法主要有浸提法、超聲法、索氏提取法以及回流法等四種方法。蟲草素分離純化的研究有離子交換樹脂法、反相高效液相色譜法，超臨界萃取法、活性炭吸附法、硅膠柱層析法。陳星采用反吸附不交換的方法得到了蟲草素晶體。他以蛹蟲草真菌固體干燥培養(yǎng)物為原料，通過粉碎、熱浸、低度醇液提取、過濾四步得到提取液。當(dāng)提取液在pH8.09.0時(shí)，有效成分蟲草素既不被717陰離子（Cl-）交換樹脂吸附，也不被732陽離子（“）樹脂吸附，這樣無關(guān)的有機(jī)或無機(jī)陰、陽離子均被離子交換柱吸附。而經(jīng)上述處理過的蟲草素處于近中性狀態(tài)，這時(shí)重調(diào)pH至11.0,使蟲草素帶負(fù)電荷被吸附在7

12、17陰離子（CI-）樹脂上，然后用純凈水或蒸餾水洗脫、濃縮、結(jié)晶而得到蟲草素晶體。陳順志等采用超臨界萃、Cuningh-am等將蛹蟲草培養(yǎng)液經(jīng)過過濾后用活性炭吸附再經(jīng)過洗脫液洗脫和濃縮都得到了蟲草素晶體；此外，也有人采用了氧化鋁柱層析和硅膠柱層析的方法對蟲草素進(jìn)行分離純化。目前，國內(nèi)外對蟲草素分離純化工藝進(jìn)行了積極的研究，并取得了一定的進(jìn)展。但是，現(xiàn)有的方法都不同程度存在著提取率低、分離純化選擇性差，以及工業(yè)化生產(chǎn)成本高的缺點(diǎn)。所以，如何提高分離提純得率和降低生產(chǎn)成本是以后蟲草素分離純化研究的方向。大孔樹脂具有良好的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和很高的比表面積，選擇性好、易解離、機(jī)械強(qiáng)度大、可反復(fù)使用、流體阻力小

13、和使用溶劑安全等優(yōu)點(diǎn)。到目前為止還未見用大孔樹脂來分離純化蟲草素的報(bào)道，如果能將其應(yīng)用在蟲草素提取純化中，將為分離純化蟲草素提供一條新的途徑。筆者應(yīng)用大孔樹脂對蛹蟲草培養(yǎng)基中蟲草素進(jìn)行了分離純化研究，使用高效液相色譜對蟲草素進(jìn)行了定量測定，以尋找到最適的大孔樹脂吸附條件。（三）蟲草素分離純化工藝研究的目的及意義早在20世紀(jì)七十年代蟲草素就被發(fā)現(xiàn)有抑制腫瘤、抗瘧原蟲和抑制mRNA翻譯的作用。九十年代研究發(fā)現(xiàn)，添加腺苷脫氨酶抑制劑對其抗腫瘤活性的表達(dá)起著重要作用，蟲草素的研究從而獲得突破性進(jìn)展，美國1997年開始將蟲草素用于一期臨床實(shí)驗(yàn)，治療急性前B和前T淋巴細(xì)胞白血病患者。同時(shí)，蟲草素還表現(xiàn)出極

14、強(qiáng)的抗真菌、抗HIV-I型病毒和選擇性抑制梭菌屬細(xì)菌活性特點(diǎn)。蟲草素能干擾細(xì)胞RNA和DNA的合成，抑制不正常細(xì)胞（癌細(xì)胞）的分裂并能作為區(qū)別細(xì)胞中不同的RNA聚合酶的工具，并具有修復(fù)基因、保護(hù)生命體遺傳密碼的特殊功效?，F(xiàn)在蟲草素在美國作為抗癌、抗病毒新藥，已經(jīng)進(jìn)入三期臨床。目前，已有不少以蟲草素為主的保健品、保健食品、化妝品、藥品投放市場。1998年，陳順志等利用生物技術(shù)和超臨界萃取技術(shù)成功獲得了蛹蟲草中的蟲草素，經(jīng)加工處理制成了蟲草活性素軟膠囊。據(jù)報(bào)道，在我國也已將由蟲草素合成的治療白血病的新藥進(jìn)入臨床試用期。從人工蛹蟲草子實(shí)體中提取蟲草素的工藝研究文獻(xiàn)報(bào)道很多，且生產(chǎn)企業(yè)一般也只收割人工

15、蛹蟲草的子實(shí)體，培養(yǎng)基殘基只用于喂養(yǎng)家畜。此外，國內(nèi)外報(bào)道蟲草素能夠人工合成，也可以從冬蟲夏草中提取，但產(chǎn)量低，且價(jià)格昂貴。然而，筆者在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)蛹蟲草培養(yǎng)基殘基也有一定含量的蟲草素。據(jù)郭宇森等研究，蟲草素在人工蛹蟲草培養(yǎng)基殘基中也能檢測到含量值，其含量在0.072%1.250%,平均0.447%。為充分、合理地利用蛹蟲草培養(yǎng)基殘基，筆者通過對大孔樹脂分離提取蛹蟲草培養(yǎng)基殘基中蟲草素的工藝研究，尋找分離和提取的最適條件，從而為蛹蟲草培養(yǎng)基殘基中蟲草素的工業(yè)化生產(chǎn)提供試驗(yàn)依據(jù)，開辟新的低成本、高生產(chǎn)效率的工業(yè)生產(chǎn)路線。其意義在于蟲草素是抗腫瘤的天然成分，還有抗病毒、抗真菌、抗結(jié)核菌的作用，有廣闊開發(fā)前景和巨大的商業(yè)價(jià)值；其次，從工業(yè)生產(chǎn)上考慮，利用大孔樹脂進(jìn)行分離從而降低生產(chǎn)成本，使蟲草素得以更為廣泛的應(yīng)用；再次，從資源上考慮，可充分實(shí)現(xiàn)資源的再利用，避免造成資源的浪費(fèi)；最后，本課題利用大孔樹脂進(jìn)行分離全過程溶劑只采用乙醇和水，這對工業(yè)化生產(chǎn)提供安全性操作，同時(shí)對提取出的蟲草素產(chǎn)品提供高安全食用性；目前未見用大孔樹脂來分離純化蟲草素的報(bào)道及專利。參