WB原理、步驟與總結(jié)

1、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)印跡是把電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固定基質(zhì)上， 然后利用抗原抗體反 應(yīng)來檢測特異性的蛋白分子的技術(shù)，包括三個部分： SDS一聚丙烯酰胺凝膠電 泳，蛋白質(zhì)的電泳轉(zhuǎn)移，免疫印跡分析。SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳主要用于測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量，SDS是陰離子去污劑，能斷裂蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的氫鍵， 使分子去折疊，破壞其高級 結(jié)構(gòu)。SDS與大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比為1.4:1 ,由于SDS帶有大量的負(fù)電荷， 與蛋白質(zhì)結(jié)合時掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，使各種蛋白質(zhì)帶有相同密度的負(fù)電荷，形似長橢圓棒，蛋白遷移率與蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的對數(shù)呈線 性關(guān)系。因此，利用相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白所作的標(biāo)準(zhǔn)

2、曲線， 可以求得未知蛋白 的相對分子質(zhì)量。電泳后蛋白質(zhì)分子嵌在凝膠介質(zhì)中，探針分子很難通過凝膠孔，將蛋白質(zhì)從 凝膠轉(zhuǎn)移到固定基質(zhì)上可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫檢測分析。方法有兩種：水平半干式轉(zhuǎn)移即將凝膠和固定基質(zhì)似三明治樣夾在緩沖液浸濕的濾紙中間，通電 1030min 可完成垂直濕式轉(zhuǎn)移即將凝膠和固定基質(zhì)夾在濾紙中間，浸在轉(zhuǎn) 移裝置的緩沖液中，通電24h或過夜可完成。固定基質(zhì)通常有硝酸纖維素膜、 聚偏二氟乙烯膜和尼龍膜。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固定化膜上之后，通過蛋白質(zhì)染料如麗春紅S檢測膜上的總蛋 白，或用考馬斯亮藍(lán)檢測凝膠上的蛋白剩余量，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)移是否成功。用抗體作 為探針進(jìn)行特異性的免疫反應(yīng)檢測抗原蛋白，分為

3、 4步：用非特異性、非反 應(yīng)活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由結(jié)合區(qū)， 以防止作為探針的抗體結(jié) 合到膜上，出現(xiàn)檢測時的高背景固定化膜用專一性的一抗溫育， 使一抗與膜上的抗原蛋白分子特異性結(jié)合酶標(biāo)二抗與一抗特異結(jié)合加入酶底物，適當(dāng)保 溫，膜上便可見到顏色反應(yīng)，檢測出抗原蛋白區(qū)帶。主要溶液10%分離膠水 3.3mL、30% 丙烯酰胺混合液 4.0mL、1.0mol/L Tris (pH8.8 )2.5mL、10% SDS 0.1mL 、10% 過硫酸錢 0.1mL、TEMED 0.004mL5%濃縮膠水 2.7mL、30% 丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/L Tris0.5mL、10

4、%SDS0.04Ml/10%過硫酸錢 0.04mL、TEMED0.004mLx Tris -甘氨酸電泳緩沖液Tris堿3.03g、甘氨酸18.77g、SDS 1g ,用去離子水定容至1LX SDS凝膠加樣緩沖液Tris-HCl (pH6.8 ) 100mmol/L ,伊琉基乙醇 10% , 10% 甘油，0.01%澳酚藍(lán)，10%SDS轉(zhuǎn)移緩沖液Tris 2.45g ,甘氨酸11.25g ,甲醇100mL ,加去離子水至1LTBSTTris 1.21g NaCl 8.77g, Tween-20 1 mL ,加去離子水至 1LStripping1.3mL Tris (pH 6.8 ), 4mL10

5、%SDS , 140 l-皖基乙醇，用水定容到20mL實(shí)驗(yàn)步驟1 SDS 一聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠配置分離膠的配置：將配置好的分離膠液混勻后迅速倒入膠槽中，至距離短玻璃板頂端約2cm處，停止灌膠。檢查是否有氣泡，若有用濾紙條吸出。然后在 膠液界面上加蒸儲水進(jìn)行水封。1530min 后，凝膠和水封層界面清晰，說明 膠已經(jīng)聚合完全，然后用濾紙吸取水封層，濾紙切勿接觸到凝膠面。 （使蛋白樣 品分離）濃縮膠的配置：將配置好的濃縮膠灌注在分離膠之上， 直至短玻璃板的頂 端，然后插入樣品槽梳子。室溫下濃縮膠聚合，約 2030min 。（使蛋白樣品濃 縮）蛋白樣品的處理將蛋白樣品溶于樣品溶解液，終濃度為0.

6、51mg/ml 。然后轉(zhuǎn)移到小離心管中，輕輕蓋上蓋子（不能塞緊，以免加熱時液體迸出），在100 C沸水浴中加 熱3min ,取出冷卻后備用，使用前需要將樣品離心除去顆粒物質(zhì)。暫時用不到 的話，可放在-20 C冰箱長期保存，使用時沸水浴中加熱3min ,以除去亞穩(wěn)聚 合態(tài)物質(zhì)。上樣前的樣品一定要均勻以防電泳時出現(xiàn)縱向條帶。加樣拔去樣品槽梳子，倒入電極緩沖液，沒過短板約 0.5cm以上，若樣品槽中 有氣泡，用槍頭挑除。按順序向凝膠樣品槽中加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白和未知蛋白樣品，每孔的加樣量要相同，一般加樣體積為 1030 11 l ,加樣時槍頭深入到加樣槽內(nèi)， 盡量接近底部，記錄加樣順序。電泳上槽接負(fù)極，下槽

7、接正極，打開直流穩(wěn)壓電源，先 80V過了濃縮膠后改為 120V ,待澳酚藍(lán)指示劑遷移到凝膠下沿 1cm時停止電泳。2蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移水平半干式電轉(zhuǎn)移戴乳膠手套剪濾紙6張，濾紙長與寬比SDSPAGE膠各大1cm。裁剪與SDS膠長寬相等的NC膜。將3張濾紙和SDS膠浸在負(fù)極轉(zhuǎn)移液中待用。將另3張濾紙和NC轉(zhuǎn)移膜浸在正極轉(zhuǎn)移液中待用。將浸在負(fù)極轉(zhuǎn)移液中的濾紙取出， 盡量少帶液體，置于轉(zhuǎn)移槽負(fù)極上，然 后在負(fù)極濾紙上依次鋪放 SDS膠、NC膜、3張用正極轉(zhuǎn)移液飽和的濾 紙。注意排除氣泡，因?yàn)闅馀輹a(chǎn)生高阻抗點(diǎn)，形成低效印跡區(qū)，即所謂“禿斑”。蓋上石墨陽極板，設(shè)定50mA恒流，轉(zhuǎn)移一定時間。垂直濕式轉(zhuǎn)移凝

8、膠片的平衡：把電泳后的凝膠從玻璃板上轉(zhuǎn)移至成有適量轉(zhuǎn)移緩沖液的 大培養(yǎng)皿中，浸泡3060min,以除去膠中的SDS ,使其pH及離子強(qiáng)度和印跡 緩沖液相一致，防止凝膠發(fā)生膨脹或皺縮。將轉(zhuǎn)移緩沖液冷卻至4c準(zhǔn)備NC膜和濾紙：戴乳膠手套裁剪與凝膠大小相同的 NC膜和4張濾紙，用轉(zhuǎn)移緩沖液浸潤膜和濾紙15min ,直到?jīng)]有氣泡，將海綿在轉(zhuǎn)移緩沖液中充分浸濕打開蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移槽的轉(zhuǎn)移夾，依次放入：浸濕的海綿，兩張用轉(zhuǎn)移緩沖液飽和的濾紙，用轉(zhuǎn)移緩沖液浸過的膠，NC膜，兩張用轉(zhuǎn)移緩沖液飽和的濾紙，浸濕的海綿，然后合上轉(zhuǎn)移夾。轉(zhuǎn)移槽中倒入轉(zhuǎn)移緩沖液，然后將轉(zhuǎn)移夾置于槽中，凝膠靠近負(fù)極NC膜 靠近正極將轉(zhuǎn)移槽放到

9、4 c冰箱內(nèi)，電轉(zhuǎn)移，恒流80 mA , 4 h。3免疫印跡分析NC膜上總蛋白的染色和脫色：將電泳轉(zhuǎn)移完后的NC膜取出，置于培養(yǎng)皿中。麗春紅S染色3min后，用鉛筆輕輕標(biāo)出標(biāo)準(zhǔn)蛋白帶的位置以備計算特異性蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量所需。然后，用麗春紅S脫色液輕輕漂洗數(shù)次至紅色消失。特異性抗體檢測脫色后的NC膜置于培養(yǎng)皿中，加入封閉液，并在水平搖床上不斷振搖，室溫下封閉2h以上。（將膜上未結(jié)合目的蛋白的區(qū)域封閉以防止一抗的結(jié)合）倒出封閉液，加入漂洗液，水平搖床上不斷振搖，洗膜3次，每次5min。 （除去封閉液）漂洗完后，將膜轉(zhuǎn)移至雜交袋中，加入特異性一抗，4C搖床過夜或室溫放搖3h （一抗與目的抗原蛋白特

10、異性結(jié)合）利用水平搖床，用TBST洗膜3次，每次5min。（洗去未結(jié)合的一抗）將膜轉(zhuǎn)移到稀釋的酶標(biāo)二抗中，在室溫下孵育 30min傾去二抗，用TBST洗膜，室溫?fù)u洗三次，每次5min ,蛋白面朝上，置于保鮮膜中，將ECL的A液和B液以1:1體積混合，于暗室中，按0.05-0.1ml/cm 2的量滴加于膜表面，孵育1min ,濾紙吸去多余液體用保鮮膜包好，立即于暗室內(nèi)曝光數(shù)秒在暗室中，將1 X顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出 X- 光片，剪裁適當(dāng)大小（比膜的長和寬均需大1cm）;打開X-光片夾，把X光片放在膜上，一旦放上，便不能移動，關(guān)上 X-光片夾，開始計時；根據(jù)信號的 強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)

11、整曝光時間，一般為1min或5min，曝光完成后，打開X-光片夾， 取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯 影時間一般為12min （2025 C）,溫度過低時（低于 16C）需適當(dāng)延長 顯影時間；顯影結(jié)束后，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時間一般為510min ,以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。注意事項(xiàng)在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性；不同濃度的凝膠用于分離不同相對分子質(zhì)量的蛋白選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和 共價鍵、二硫鍵；對于多亞基蛋白或含多條肽鏈的蛋白，SDS 只能測定它們的

12、亞基或單條肽鏈的相對分子質(zhì)量。盡量除去核酸、多糖、脂類等干擾分子；蛋白質(zhì)樣品在處理過程中應(yīng)低溫下進(jìn)行， 以避免細(xì)胞破碎釋放出各種酶對 其進(jìn)行修飾盡量使用新鮮的loading buffer ,樣品要與loading buffer 混合均勻， 不可將蛋白質(zhì)反復(fù)凍融使用以防改變蛋白質(zhì)的抗原特性，Buffer 一定要漫過梳子孔，否則可能會發(fā)現(xiàn)蛋白跑不動；電泳時先用低電壓跑過濃縮膠，再換高電壓跑分離膠，特別是對于高分子量的目的蛋白，硝酸纖維素（NC）膜：NC與蛋白質(zhì)靠疏水作用結(jié)合，無需預(yù)先活化，對蛋白質(zhì)的活性影響小；非特異性本底顯色淺；價格低廉，使用方便。但結(jié)合在NC上的小分子蛋白質(zhì)在洗滌時易丟失；NC

13、韌性較差，易損壞。聚偏二氟乙烯（PVDF）膜：與蛋白質(zhì)親和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活 化膜上的正電基團(tuán)，使其更容易與帶負(fù)電荷蛋白結(jié)合。但價格上稍貴。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小要先將膜晾干，然后浸入20%的甲醇，待完全浸濕后取出透光觀察即可看到蛋白條帶（適 用于PVDF膜）。傳統(tǒng)方法是將膜用1X麗春紅染液染5min （于脫色搖床上搖）， 然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易 產(chǎn)生較高的背景。 高背景可能的原因：膜未均勻浸泡；膜或緩沖液污染；封閉 不充分；抗體與封閉液出現(xiàn)交叉反應(yīng)；抗體濃度過

14、高。解決方法有：轉(zhuǎn)膜前用 100%甲醇將膜完全浸泡；雜交前檢測一抗、二抗；檢測一抗、二抗與封閉液是 否有交叉反應(yīng)。轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量最大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液對膜進(jìn)行染色， 以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜 效果。也 可以用考 馬斯亮藍(lán) 快速染色液 對完成 轉(zhuǎn)膜的 SDS膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。作用定性分析蛋白質(zhì)，特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測和測定蛋白質(zhì)分子量，分析目的蛋白表達(dá)的特異性。蛋白樣品的制備單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?、倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵?直立放置一會兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后

15、再用移液器將其吸走）。每瓶細(xì)胞加 3ml 4 C預(yù)冷的 PBS （0.01M pH7.27.3 ）。平放輕輕搖動1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。3、按1ml裂解液加10 pl PMSF（100mM ），搖勻置于冰上。（PMSF 要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合。）每瓶細(xì)胞加 400 口含PMSF的裂解液，于冰上裂解 30min，為 使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動。裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動作要快）， 然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個操作盡量在冰上進(jìn)行。）于4 c下120

16、00rpm 離心5min 。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）7、將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到離心管中放于20 c保存。（2）組織中總蛋白的提?。?、將少量組織塊置于 12ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將 組織塊盡量剪碎。2、加400小單去污劑裂解液裂（含 PMSF ）于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。 然后置于冰上。3、幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。4、裂解30 min 后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4 c下12000rpm 離心5min ,取上滿分裝于 0.5ml離心管中并置 于20 c保存。（3）加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。河捎谑芩幬锏挠绊?，一些細(xì)胞脫落下

17、來，除了按（一）操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提取：1、 將培養(yǎng)液倒至 15ml離心管中，于 2500rpm 離心5min 。2、棄上清，加入 4ml PBS 并用槍輕輕吹打洗滌，然后 2500rpm 離 心5min 。棄上清后用 PBS重復(fù)洗滌一次。3、用槍洗干上清后， 加100以裂解液（含PMSF ）冰上裂解30min , 裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。4、將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4C、12000rpm 離心5min ,取上清分裝于0.5ml離心管中并置于20 c保存。（三）蛋白含量的測定（1）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線從20c取出1mg/ml BSA ,室溫融化后

18、，備用。取18個1.5ml離心管，3個一組，分別標(biāo)記為0mg , 2.5mg ,5.0mg , 10.0mg , 20.0mg , 40.0mg 。3、按下表在各管中加入各種試劑。02.5m5.0m10.020.040.0mgggmgmgmg10.020.040.01mg/ml BSA一2.5ml5.0mlmlmlml10097.595.090.080.060.00.15mol/L NaClmlmlmlmlmlmlG250考馬斯亮藍(lán)1ml1ml1ml1ml1ml1ml溶液4、 混勻后，室溫放置 2min。在生物分光光度計上比色分析。(2)檢測樣品蛋白含量1、取若干1.5ml離心管，每管加入4c

19、儲存的考馬斯亮藍(lán)溶液1ml。室溫放置30min后即可用于測蛋白。2、取一管考馬斯亮藍(lán)加 0.15mol/L NaCl 溶液100 ml ,混勻放置2 分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按 blank測空白樣品。3、棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次(每次0.5ml ),再用無菌水洗一次。4、 取一管考馬斯亮藍(lán)加 95 ml0.15mol/L NaCl NaCl 溶液和5ml 待測蛋白樣品，混勻后靜置2min ,倒入扣干的比色杯中按sample鍵測樣品。注意：每測一個樣品都要將比色杯用無水乙醇洗2次，無菌水洗一次?？赏瑫r混合好多個樣品再一起測，這樣對測定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時間。測得的結(jié)果是5 ml樣品含的蛋白量。主要參考生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教程劉箭主編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)魏群主編還有百度上搜的關(guān)于 wb的方法步驟及試驗(yàn)中出現(xiàn)的問題熱致相分離法的英文縮寫TIPS ,