(整理)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)的功能與調(diào)控機(jī)制cb919000-g

1、精品文檔項(xiàng)目名稱：首席科學(xué)家：脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)的功能與調(diào)控機(jī)制宋保亮中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院起止年限：2009.1至2013.8依托部門：中國(guó)科學(xué)院一、研究?jī)?nèi)容（一）擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題脂質(zhì)代謝包括合成、吸收、運(yùn)輸、貯存等動(dòng)態(tài)過(guò)程，主要由膜蛋白復(fù)合物介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)，并且在多個(gè)水平受到調(diào)控，包括一些重要轉(zhuǎn)錄因子對(duì)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控作用。脂質(zhì)代謝過(guò)程中涉及到膜蛋白復(fù)合物、核轉(zhuǎn)錄因子和小分子代謝物組成復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)。其中的關(guān)鍵蛋白是重要的調(diào)控點(diǎn)，這些蛋白的功能紊亂和調(diào)控失衡將直接導(dǎo)致嚴(yán)重代謝性疾病的發(fā)生。本項(xiàng)目擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題是（1）發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律；

2、（2）闡明脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白的功能調(diào)控和重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；（3）揭示脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白的生理功能和在重大疾病發(fā)生發(fā)展中的作用；（4）鑒定以脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白為靶點(diǎn)的活性小分子化合物。以上研究成果不僅對(duì)蛋白質(zhì)科學(xué)、脂質(zhì)代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等學(xué)科的基礎(chǔ)理論有重要貢獻(xiàn)，而且有助于解析重要生命活動(dòng)的基本規(guī)律，為研究心腦血管疾病、脂肪肝、糖尿病和肥胖等重大疾病的發(fā)生機(jī)理、疾病早期診斷和治療奠定重要基礎(chǔ)。（二）主要研究?jī)?nèi)容本項(xiàng)目將圍繞脂質(zhì)的合成、吸收、運(yùn)輸、貯存等過(guò)程，針對(duì)其中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)和調(diào)控因子開(kāi)展研究。力圖將大規(guī)模和系統(tǒng)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析與經(jīng)典的科學(xué)假設(shè)驅(qū)動(dòng)的研究策略相結(jié)合，將蛋白質(zhì)復(fù)合物的功能研究從整體

3、與局部?jī)蓚€(gè)方面有機(jī)的結(jié)合起來(lái)，分析蛋白質(zhì)在脂質(zhì)代謝中的分子調(diào)控機(jī)制和整體功能作用，尋找其功能調(diào)控在生理與病理狀態(tài)下的動(dòng)態(tài)變化。闡釋重要蛋白質(zhì)在脂質(zhì)代謝中的功能與調(diào)控機(jī)制。系統(tǒng)地分析脂質(zhì)代謝過(guò)程中重要蛋白質(zhì)之間的相互作用，鑒定新的結(jié)合蛋白。通過(guò)規(guī)模性的蛋白質(zhì)相互作用篩選方法，我們將重點(diǎn)研究脂質(zhì)代謝調(diào)控過(guò)程中重要核轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、脂質(zhì)合成與吸收過(guò)程中的膜蛋白復(fù)合物以及脂質(zhì)運(yùn)輸和貯存過(guò)程的蛋白質(zhì)復(fù)合物等。深入探討蛋白質(zhì)介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。通過(guò)動(dòng)態(tài)定量脂質(zhì)分析技術(shù)，并結(jié)合其它現(xiàn)代生物學(xué)的研究方法，分析蛋白質(zhì)和脂質(zhì)分子的相互作用，動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)運(yùn)和定位變化。解析重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)的調(diào)控

4、作用。脂質(zhì)代謝過(guò)程產(chǎn)生大量的小分子代謝物和衍生物，它們中相當(dāng)一部分具有調(diào)控活性，能夠前饋或反饋?zhàn)饔糜谥|(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白，對(duì)相應(yīng)的代謝途徑產(chǎn)生重要影響，本項(xiàng)目將發(fā)現(xiàn)并揭示該類信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，闡明其生理功能。解析脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)功能調(diào)控異常在重大疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。利用細(xì)胞、動(dòng)物模型和病理樣本，開(kāi)展脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白在心腦血管疾病、脂肪肝、糖尿病和肥胖發(fā)生發(fā)展中的分子病理學(xué)機(jī)制研究。構(gòu)建篩選活性小分子化合物的靶點(diǎn)系統(tǒng)，進(jìn)行高通量篩選獲得各種活性小分子化合物。鑒定具有功能作用的小分子化合物，進(jìn)行構(gòu)效優(yōu)化獲得先導(dǎo)結(jié)構(gòu)分子等研究爭(zhēng)取深入相應(yīng)藥物的研發(fā)。二、預(yù)期目標(biāo)(一)總體目標(biāo)本項(xiàng)目針對(duì)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白的

5、功能與調(diào)控機(jī)制開(kāi)展前沿領(lǐng)域研究，系統(tǒng)地分析蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成、相互作用、動(dòng)態(tài)變化及在脂質(zhì)代謝中的功能調(diào)控作用。鑒定脂質(zhì)代謝中重要蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成和作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控機(jī)制和信號(hào)途徑，揭示其在脂質(zhì)代謝中的作用機(jī)理，闡明其在心腦血管病、糖尿病和肥胖等重大疾病發(fā)生發(fā)展中的病理學(xué)意義，并篩選獲得活性小分子化合物。以上研究成果必將為脂質(zhì)代謝和蛋白質(zhì)科學(xué)的基礎(chǔ)理論增添新的內(nèi)容，為我國(guó)人口與健康事業(yè)做出重要貢獻(xiàn)。本項(xiàng)目的實(shí)施將獲得一系列具有國(guó)際領(lǐng)先和擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的研究成果，打造一支達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平的研究脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白質(zhì)的科研隊(duì)伍，躋身于國(guó)際蛋白質(zhì)科學(xué)研究的領(lǐng)先行列。(二)五年預(yù)期目標(biāo)1.在基礎(chǔ)理論

6、研究方面：從分子、細(xì)胞到動(dòng)物整體水平，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成、新途徑及新相互作用，闡明生理和病理狀態(tài)下蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系；鑒定脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白的重要功能調(diào)控和發(fā)現(xiàn)新的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，發(fā)現(xiàn)重要的調(diào)控點(diǎn)和作用機(jī)制；闡明脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白在脂類分子合成、吸收、運(yùn)輸、貯存中的功能作用，揭示其生理功能和在重大疾病發(fā)生發(fā)展中的作用；發(fā)現(xiàn)以脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)為靶點(diǎn)的活性小分子化合物，鑒定具有功能作用的小分子化合物，進(jìn)行構(gòu)效優(yōu)化獲得先導(dǎo)結(jié)構(gòu)分子等研究，并在動(dòng)物水平分析獲得其對(duì)脂質(zhì)代謝和心腦血管疾病、糖尿病和肥胖等疾病的作用。2.在應(yīng)用基礎(chǔ)研究方面：鑒定三種以上可供心腦血管疾病、糖尿病和肥胖等代謝性疾病

7、診治與新藥開(kāi)發(fā)等研究的重要靶標(biāo)，開(kāi)發(fā)和建立蛋白質(zhì)復(fù)合物特別是膜蛋白復(fù)合物動(dòng)態(tài)變化研究的新方法和新技術(shù)，申請(qǐng)8項(xiàng)以上發(fā)明專利，促進(jìn)有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)新藥的開(kāi)發(fā)及產(chǎn)業(yè)化。3.成果考核指標(biāo)：在國(guó)際一流雜志（IF10）發(fā)表論文8-10篇，在有影響力的雜志（IF5）上發(fā)表論文20-40篇。4.人才培養(yǎng)：培養(yǎng)博士研究生30-50人，國(guó)家杰出青年等高級(jí)人才3-5名。三、研究方案（一）學(xué)術(shù)思路脂質(zhì)代謝是生命活動(dòng)的重要事件，并與重大疾病的發(fā)生密切相關(guān)。蛋白質(zhì)是脂質(zhì)代謝及其調(diào)控的主要執(zhí)行者，認(rèn)識(shí)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)分子的生化特性及其相互作用將有助于解釋脂質(zhì)代謝調(diào)控的規(guī)律、闡明重大疾病的發(fā)病機(jī)制，為藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和藥物開(kāi)

8、發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。本項(xiàng)目主要從脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律、重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、生理功能、病理作用和與之相互作用的小分子等方面著手，應(yīng)用現(xiàn)代生物學(xué)（包括生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等）技術(shù)，研究脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)變化及其對(duì)脂質(zhì)代謝的作用，揭示其與重大代謝性疾?。ㄈ鐒?dòng)脈粥樣硬化、冠心病、中風(fēng)、糖尿病、脂肪肝、肥胖等）發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在關(guān)系，創(chuàng)建我國(guó)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的功能研究的基礎(chǔ)理論和技術(shù)體系。（二）技術(shù)路線蛋白質(zhì)幾乎介導(dǎo)所有的生命活動(dòng)，在脂質(zhì)代謝領(lǐng)域的關(guān)鍵蛋白，又有其顯著特點(diǎn)，如脂質(zhì)代謝涉及較復(fù)雜的膜蛋白復(fù)合物；有代謝小分子與蛋白質(zhì)的直接相互作用與調(diào)控；以

9、及有很強(qiáng)的應(yīng)用前景。因此，本申請(qǐng)項(xiàng)目首先在分子水平研究脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成、功能調(diào)控、重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；其次在動(dòng)物整體水平分析重要蛋白因子對(duì)脂質(zhì)代謝和疾病發(fā)生的影響，同時(shí)利用病理樣本開(kāi)展病理學(xué)研究；最后基于這些前沿進(jìn)展，構(gòu)建以脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)為靶點(diǎn)的活性小分子化合物篩選系統(tǒng)，篩選獲得具有臨床應(yīng)用前景化合物。本項(xiàng)目從分子水平揭示蛋白質(zhì)的功能調(diào)控機(jī)制，在整體水平闡明其生理和病理作用，并最終旨在研發(fā)新型調(diào)脂藥物。本項(xiàng)目針對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝的動(dòng)態(tài)過(guò)程設(shè)置了相應(yīng)的三個(gè)研究課題，包括：（1）脂質(zhì)代謝調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子；（2）脂質(zhì)合成與吸收的關(guān)鍵膜蛋白及其復(fù)合物；（3）脂質(zhì)貯存和運(yùn)輸密切相關(guān)的重要

10、蛋白?？傮w技術(shù)途徑如下圖：酵母雙雜交、免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)等鑒定相互作用的新蛋白（三）可行性分析本研究項(xiàng)目的總體研究方案切實(shí)可行從學(xué)術(shù)思路上，本項(xiàng)目擬從脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律、重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、生理功能、病理作用和與之相互作用的小分子等方面著手，應(yīng)用現(xiàn)代生物學(xué)（包括生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等）技術(shù)，研究脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)變化及其對(duì)脂質(zhì)代謝的作用，揭示其與重大代謝性疾?。ㄈ鐒?dòng)脈粥樣硬化、冠心病、中風(fēng)、糖尿病、脂肪肝、肥胖等）發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在關(guān)系，創(chuàng)建我國(guó)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的功能研究的基礎(chǔ)理論和技術(shù)體系。由于蛋白質(zhì)脂質(zhì)代謝及其調(diào)控的主要執(zhí)行者，蛋白質(zhì)功能

11、異常是重大疾病發(fā)生的重要原因，因此以脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)等科學(xué)前沿作為切入點(diǎn)，研究脂質(zhì)代謝調(diào)控和疾病的關(guān)系切實(shí)可行。從技術(shù)途徑上看，本項(xiàng)目設(shè)置三個(gè)課題，以脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白的重要調(diào)節(jié)功能為主線，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用為共同的主題，應(yīng)用蛋白質(zhì)科學(xué)和其它現(xiàn)代生物學(xué)的技術(shù)（如酵母雙雜交系統(tǒng)、免疫共沉淀技術(shù)、質(zhì)譜分析、脂質(zhì)代謝分析、高通量化合物篩選等），尋找脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白在生理與病理狀態(tài)下的功能變化，闡釋其生物學(xué)功能與調(diào)控機(jī)制。三個(gè)具體研究課題的技術(shù)途徑和路線清晰和明確，切實(shí)可行。本研究項(xiàng)目凝聚了優(yōu)秀的研究團(tuán)隊(duì)本項(xiàng)目有高級(jí)職稱人員9名，其他研究技術(shù)人員22名，平均年齡為34.3歲。研究隊(duì)伍包括“國(guó)家杰出

12、青年基金”獲得者3名、中科院“百人計(jì)劃”入選者5名。本項(xiàng)目凝聚的優(yōu)秀研究團(tuán)隊(duì)，確保了本項(xiàng)目切實(shí)可行。研究團(tuán)隊(duì)成員已經(jīng)承擔(dān)多項(xiàng)本研究項(xiàng)目相關(guān)項(xiàng)目，其中包括國(guó)家“十五”科技攻關(guān)計(jì)劃課題、科技部“973”項(xiàng)目、科技部“863”項(xiàng)目、國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目、國(guó)家杰出青年基金、國(guó)家自然科學(xué)基金創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)和國(guó)際合作項(xiàng)目。特別是具有相關(guān)國(guó)家級(jí)重大/重點(diǎn)項(xiàng)目順利實(shí)施的豐富經(jīng)驗(yàn)，扎實(shí)的工作基礎(chǔ)確保了本研究項(xiàng)目順利實(shí)施本研究團(tuán)隊(duì)在蛋白質(zhì)復(fù)合物動(dòng)態(tài)變化的分子機(jī)制和功能研究方面有著非常扎實(shí)的研究基礎(chǔ)，近5年來(lái)，項(xiàng)目組成員已經(jīng)作為通訊作者/第一作者在Cell子刊上發(fā)表論文5篇，影響因子大于10分的有10篇，影響因子大于

13、5分的有30余篇。良好的工作條件和環(huán)境為本研究項(xiàng)目順利完成提供了保障本項(xiàng)目依托、承擔(dān)和參加研究單位（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院、中國(guó)科學(xué)院北京生物物理研究所和中國(guó)科學(xué)院北京遺傳發(fā)育研究所等）都屬于國(guó)內(nèi)一流的科研院校，有很強(qiáng)的綜合科研實(shí)力。并且大部分科研骨干都依托于多個(gè)國(guó)家級(jí)和省部級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，包括分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，這些國(guó)內(nèi)一流的科研院校及所依托的國(guó)家級(jí)和省部級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室為本項(xiàng)目的開(kāi)展提供了良好的工作環(huán)境和條件。本項(xiàng)目依托、承擔(dān)和參加研究單位裝備了開(kāi)展分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、電生理、形態(tài)學(xué)和行為學(xué)方面研究的儀器設(shè)備，建立了成熟的實(shí)驗(yàn)方法，包括免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)、激光共聚焦顯微

14、鏡術(shù)、包埋前/后免疫電鏡技術(shù)、活細(xì)胞成像技術(shù)、流式細(xì)胞分析技術(shù)、分子原位雜交技術(shù)、酵母雙雜交系統(tǒng)、免疫共沉淀技術(shù)、全細(xì)胞膜片嵌技術(shù)、動(dòng)物模型制備、行為學(xué)分析以及蛋白質(zhì)肽譜分析、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備和基因敲除技術(shù)等。這些條件都確保了本項(xiàng)目在儀器設(shè)備和技術(shù)方法的需求方面切實(shí)可行。（四）創(chuàng)新點(diǎn)與特色脂質(zhì)代謝是生命活動(dòng)的重要事件，并與冠心病、腦中風(fēng)、糖尿病、肥胖等重大疾病的發(fā)生密切相關(guān)。蛋白質(zhì)是脂質(zhì)代謝及其調(diào)控的主要執(zhí)行者，認(rèn)識(shí)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)分子的生化特性及其相互作用將有助于解釋脂質(zhì)代謝調(diào)控的規(guī)律、闡明重大疾病的發(fā)病機(jī)制，為藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和藥物開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。本申請(qǐng)項(xiàng)目開(kāi)展的脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白

15、質(zhì)的研究，有以下顯著特點(diǎn)與創(chuàng)新點(diǎn)。第一、脂質(zhì)代謝過(guò)程涉及許多重要的膜蛋白及其復(fù)合物。由于脂類分子高度疏水，其相當(dāng)多的代謝步驟發(fā)生在細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)內(nèi)，有許多膜蛋白參與，膜蛋白復(fù)合物的功能調(diào)控精細(xì)并且極其重要，已成為國(guó)際前沿重點(diǎn)領(lǐng)域研究。但是，針對(duì)生命體膜性結(jié)構(gòu)環(huán)境的特異性研究技術(shù)方法進(jìn)展緩慢，因此，本申請(qǐng)項(xiàng)目中針對(duì)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白，特別是膜蛋白復(fù)合物的探索，既是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)、又是難點(diǎn)。第二、脂質(zhì)代謝過(guò)程中涉及很多蛋白質(zhì)和小分子的相互作用。這些相互作用，不僅僅表現(xiàn)為酶與底物的關(guān)系，更為重要的是活性代謝小分子作為觸發(fā)信號(hào)，引起細(xì)胞內(nèi)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，對(duì)其自身或相關(guān)代謝進(jìn)行反饋或前饋調(diào)控。本申請(qǐng)項(xiàng)目

16、的各個(gè)課題中，都將對(duì)小分子參與的重要調(diào)控事件開(kāi)展研究。第三、對(duì)脂質(zhì)代謝調(diào)控關(guān)鍵蛋白的研究，有很強(qiáng)的應(yīng)用性。不僅由于脂質(zhì)代謝與重要疾病發(fā)生密切相關(guān)，更是因?yàn)樵趯?duì)脂質(zhì)代謝調(diào)控的研究過(guò)程中，可以揭示內(nèi)源重要的調(diào)節(jié)小分子和信號(hào)通路，本項(xiàng)目中，基于對(duì)關(guān)鍵蛋白質(zhì)的前沿研究，已經(jīng)或即將開(kāi)展活性小分子化合物的篩選，為我國(guó)人口與健康事業(yè)作出貢獻(xiàn)。（五）課題設(shè)置課題設(shè)置思路：本項(xiàng)目擬從“脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)的功能與調(diào)控機(jī)制”這一關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題出發(fā)，圍繞脂質(zhì)代謝調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子、脂質(zhì)合成與吸收、脂質(zhì)運(yùn)輸和貯存等過(guò)程，著眼于脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律、重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、生理功能、病理作用和與之相互作用

17、的小分子化合物，研究脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)變化及其對(duì)脂質(zhì)代謝的作用，揭示其與重大代謝性疾?。ㄈ鐒?dòng)脈粥樣硬化、冠心病、中風(fēng)、糖尿病、肥胖等）發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在關(guān)系，揭示其在生命活動(dòng)中的規(guī)律，為疾病的診斷和治療及其藥物靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。因此，本項(xiàng)目擬設(shè)立三個(gè)課題：課題一，脂質(zhì)代謝調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子；課題二，脂質(zhì)合成與吸收的關(guān)鍵膜蛋白及其復(fù)合物；課題三，脂質(zhì)運(yùn)輸和貯存密切相關(guān)的重要蛋白。課題一、脂質(zhì)代謝調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子研究目標(biāo)本項(xiàng)目將通過(guò)研究LXR、TR和SREBP在不同組織中和不同配體水平下與其它蛋白質(zhì)的互相作用，闡明轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控脂質(zhì)代謝的時(shí)空性從而揭示轉(zhuǎn)錄功能的調(diào)控機(jī)制。本項(xiàng)目將從

18、分子、細(xì)胞、組織和動(dòng)物水平，在體外和體內(nèi)研究蛋白質(zhì)相互作用，著重于研究蛋白質(zhì)相互作用調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子功能的分子機(jī)制。利用脂質(zhì)代謝調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子作為靶點(diǎn)篩選出與代謝性疾病相關(guān)的天然小分子化合物并在動(dòng)物模型上進(jìn)一步研究預(yù)測(cè)其臨床效果。研究?jī)?nèi)容1TR調(diào)控蛋白的鑒定與功能研究通過(guò)酵母雙雜交，我們初步鑒定出了一些新的TR相互作用蛋白質(zhì)，包括一些轉(zhuǎn)錄因子(比如forkheadboxO，B-celllymphoma6protein)和輔助因子(如：Sin3A-associatedprotein，ligand-dependentcorepressor，mixed-lineageleukaemia)。在本項(xiàng)目研

19、究中，我們將以GSTPull-down、Co-IP等方法對(duì)這些潛在的相互作用蛋白質(zhì)因子進(jìn)行鑒定和確認(rèn)，并研究各結(jié)合蛋白的表達(dá)譜。對(duì)于那些輔助因子，我們還將分離純化其所在的復(fù)合物，鑒定該復(fù)合物的各個(gè)組成。除了研究TR與其它轉(zhuǎn)錄因子之間可能存在的cross-talk之外，我們將側(cè)重于研究那些能調(diào)控染色質(zhì)重塑的輔助因子和或具有肝臟組織特異性或脂肪組織特異性表達(dá)的輔助因子，研究其生物學(xué)功能，闡明其對(duì)TR蛋白質(zhì)功能的影響和有關(guān)脂肪酸代謝方面的調(diào)控機(jī)制。2脂肪和肝臟組織特異性的LXR和SREBP輔助因子的鑒定與功能研究由于缺少商業(yè)化的脂肪組織的酵母雙雜交文庫(kù)，我們將分別構(gòu)建小鼠白色和褐色脂肪組織的酵母雙雜

20、交文庫(kù),篩選脂肪組織特異的LXR和SREBP結(jié)合蛋白，特別是輔助因子包括輔激活蛋白和輔阻遏蛋白。同時(shí)我們將利用親和層析的方法直接從小鼠肝臟組織和脂肪組織的核抽提物中分離LXR和SREBP結(jié)合蛋白。在確認(rèn)感興趣的LXR和SREBP輔助因子后，我們將再次利用以上兩種方法發(fā)現(xiàn)和鑒定輔助因子復(fù)合物的各個(gè)組成蛋白，進(jìn)一步揭示該輔助因子復(fù)合物是如何調(diào)控LXR和SREBP，配合LXR和SREBP來(lái)調(diào)節(jié)肝臟細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)代謝的。其中我們將側(cè)重于研究那些有翻譯后修飾功能的輔助因子或被翻譯后修飾所調(diào)控的輔助因子，闡明甲基化，乙?；?，磷酸化，泛素化和蘇素化這些翻譯后修飾過(guò)程調(diào)控LXR和TR蛋白質(zhì)功能的分子機(jī)制

21、。3亮氨酸缺乏時(shí)mTOR對(duì)SREBP-lc的功能調(diào)控為驗(yàn)證mTOR對(duì)GCN2依賴的脂肪合成的調(diào)節(jié)作用是必要的這一假設(shè)，在Gcn2-/-小鼠中我們將用雷帕霉素處理來(lái)阻斷mTOR信號(hào)通路，看是否可以模擬在Gcn2+/+小鼠中亮氨酸缺乏引起的脂肪合成抑制。Gcn2-/-小鼠將用亮氨酸缺乏飲食喂養(yǎng)7天，在第4天時(shí)注射雷帕霉素(bid,0.5mg/kg),直持續(xù)注射到第7天。所有的評(píng)估脂肪合成和相關(guān)代謝指標(biāo)將被詳細(xì)檢測(cè)。尤其是我們將觀測(cè)脂肪肝是否消失或緩解，肝中TAG是否降低和脂肪合成基因是否被抑制。如果我們能夠證明mTOR的確是參與介導(dǎo)GCN2依賴的脂肪合成的調(diào)控，我們將進(jìn)一步檢測(cè)mTOR的上下游蛋白

22、，如S6激酶(S6K)、真核細(xì)胞啟動(dòng)子4E結(jié)合蛋白(eIF4Ebindingprotein,eIF4EBP)和hVPs34的功能作用。4亮氨酸缺乏時(shí)LXRa/RXR對(duì)SREBPIc的功能調(diào)控LXRa/RXR是SREBP-lc的主要調(diào)控因子，我們將首先檢測(cè)LXRa/RXR的表達(dá)和活性在亮氨酸缺乏飲食喂養(yǎng)的Gcn2+/+和Gcn2-/-小鼠肝中是否存在差異。LXRa/RXR的mRNA水平和蛋白水平將分別用qRT-PCR和westernblots的方法檢驗(yàn)。為評(píng)估LXRa/RXR結(jié)合到SREBP-1c啟動(dòng)子上的能力，我們將應(yīng)用Nakatani的方法，用percoll梯度離心純化的肝細(xì)胞核提取物進(jìn)行E

23、MSA(gelmobilityshiftassays)實(shí)驗(yàn)。如果在亮氨酸缺乏后Gcn2+/+小鼠中的LXRa和RXR兩者或其一的表達(dá)被抑制，而在Gcn2-/-小鼠中沒(méi)有出現(xiàn)，那么意味著它們或其一可能是介導(dǎo)GCN2對(duì)SREBP-1c的調(diào)節(jié)。但是，因?yàn)槎嗖伙柡椭舅岷脱趸檀伎梢孕揎桳XRa/RXR異二聚體的形成或與SREBP-1c啟動(dòng)子結(jié)合的親和性，所以，如果我們發(fā)現(xiàn)兩種小鼠中僅是LXRa/RXR異二聚體的結(jié)合活性不同，則說(shuō)明該變化可能是通過(guò)多不飽和脂肪酸和氧化固醇的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。如果多不飽和脂肪酸組成和水平改變，那就意味著它是LXRa/RXR水平改變的主要原因。5.調(diào)控TR、LXR和SREBP

24、活性小分子的篩選及其作用機(jī)制在上述對(duì)脂肪酸代謝關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子功能與作用機(jī)制的基礎(chǔ)上，篩選調(diào)控脂肪酸代謝關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子功能的天然活性小分子，尋找先導(dǎo)化合物。將3T3-L1脂肪前體細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞作為體外模型，采用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合法和報(bào)告基因分析法篩選出小分子化合物，檢測(cè)LXRa，TR，SREBP-1c以及靶基因FAS、SCD-1、ACC的基因表達(dá)，在細(xì)胞模型上首先論證篩選出的小分子化合物對(duì)脂肪合成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。采用高脂餐誘導(dǎo)建立肥胖動(dòng)物模型或db/db糖尿病小鼠，在動(dòng)物模型上證實(shí)小分子化合物對(duì)脂肪酸關(guān)鍵蛋白質(zhì)合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響和作用及預(yù)防和治療代謝綜合癥的效果。承擔(dān)單位：中科院上海生命科學(xué)研究

25、院課題負(fù)責(zé)人：秦瑩，研究員，中科院上海生命科學(xué)研究院經(jīng)費(fèi)比例：30課題二、脂質(zhì)合成與吸收的關(guān)鍵膜蛋白及其復(fù)合物研究目標(biāo)闡明脂質(zhì)合成與吸收的關(guān)鍵膜蛋白HMGCR、NPC1L1和ACAT等發(fā)揮功能的分子機(jī)制，鑒定上述膜蛋白復(fù)合物的關(guān)鍵組成因子，揭示其重要生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制。探索這些重要蛋白質(zhì)在膽固醇代謝調(diào)控、動(dòng)脈粥樣硬化及心腦血管疾病發(fā)生中的功能作用，篩選活性小分子化合物，為相關(guān)疾病的診斷、藥物靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)及先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供直接基礎(chǔ)。研究?jī)?nèi)容膜蛋白HMGCR降解復(fù)合物中蛋白質(zhì)因子的鑒定與功能研究HMGCR是膽固醇合成途徑中的限速酶，其蛋白質(zhì)降解受反應(yīng)下游產(chǎn)物甾醇反饋調(diào)控。我們前期研究結(jié)果已經(jīng)揭

26、示Insig/gp78/VCP/Ufd1復(fù)合物介導(dǎo)了HMGCR蛋白降解，但該復(fù)合物中的其它蛋白因子尚未被完全發(fā)現(xiàn)，我們將利用酵母雙雜交、免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合大規(guī)模質(zhì)譜鑒定等手段，系統(tǒng)地篩選與HMGCR及其復(fù)合物中Insig和gp78等結(jié)合的蛋白質(zhì)，研究它們?cè)贖MGCR蛋白質(zhì)降解以及膽固醇合成代謝中的生物學(xué)功能。脂質(zhì)吸收關(guān)鍵膜蛋白NPC1L1的作用機(jī)制與結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)NPC1L1是介導(dǎo)膽固醇吸收的關(guān)鍵蛋白，它含有1300多個(gè)氨基酸，序列預(yù)測(cè)含有多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，其中的5個(gè)跨膜區(qū)段構(gòu)成保守的“甾醇感受結(jié)構(gòu)域”(SterolSensingDomain,SSD)。我們前期工作揭示甾醇促進(jìn)Clathrin/AP2

27、介導(dǎo)的NPC1L1的內(nèi)吞，揭示了NPC1L1介導(dǎo)膽固醇吸收的分子機(jī)制。為深入研究NPC1L1蛋白在膽固醇吸收過(guò)程中發(fā)揮作用重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，我們?cè)谶@部分工作中將重點(diǎn)篩選鑒定NPC1L1蛋白結(jié)合膽固醇的位點(diǎn)以及鑒定其結(jié)合AP2復(fù)合物2亞基的Motif。NPC1L1膜蛋白復(fù)合物中新蛋白因子的鑒定與功能研究我們前期研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇促進(jìn)NPC1L1蛋白從細(xì)胞質(zhì)膜向胞內(nèi)小泡轉(zhuǎn)運(yùn)，它通過(guò)小泡內(nèi)吞而將膽固醇大量運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞。NPC1L1在其動(dòng)態(tài)調(diào)控及行使功能過(guò)程中，涉及到和其它蛋白相互作用，形成復(fù)雜的膜蛋白復(fù)合物。我們?cè)谶@部分研究?jī)?nèi)容中，將利用酵母雙雜交以及免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜鑒定的方法，尋找鑒定NPC1L1膜蛋白

28、復(fù)合物中的未知蛋白因子，深入研究其中NPC1L1蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)以及膽固醇吸收過(guò)程中的生物學(xué)功能。膽固醇酯合成酶ACAT蛋白降解調(diào)控的分子機(jī)制及其作用ACAT是細(xì)胞內(nèi)唯一催化膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懝檀减サ拿福鼘?duì)于維持膽固醇代謝平衡、減少膽固醇毒性以及在膽固醇吸收和脂蛋白裝配中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。但是，ACAT基因的轉(zhuǎn)錄并不直接受膽固醇水平的調(diào)控。我們?cè)谇捌谔剿髦邪l(fā)現(xiàn)，膽固醇能夠顯著增加ACAT的蛋白量，推測(cè)膽固醇前饋提高ACAT的穩(wěn)定性，并且發(fā)現(xiàn)Insig在ACAT的降解過(guò)程中發(fā)揮作用。我們將深入研究Insig/gp78/VCP/Ufdl復(fù)合物是否同時(shí)介導(dǎo)ACAT蛋白降解，鑒定ACAT的泛素化修飾位點(diǎn)，

29、揭示參與其降解調(diào)控的重要蛋白質(zhì)，以及探索相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制及生物學(xué)意義。ACAT1不同異構(gòu)體的功能與調(diào)控機(jī)制我們前期研究揭示ACAT-1基因定位于兩條染色體上，由各自的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄出兩個(gè)前體RNA,通過(guò)反式和順式剪接產(chǎn)生出多種成熟的mRNA,后者通過(guò)AUG和非AUG起始翻譯分別編碼50-kDa和56-kDaACAT蛋白。我們將深入研究不同形式的ACAT-1Isoform的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、酶活性、聚集體形式以及對(duì)甾醇和脂肪酸的底物特異性。同時(shí)分析它們的組織細(xì)胞和不同生理病理?xiàng)l件的表達(dá)譜、亞細(xì)胞地位等，該工作將揭示ACAT-1不同Isoform在細(xì)胞內(nèi)膽固醇和膽固醇酯之間的代謝平衡調(diào)控中的功能作用和調(diào)控機(jī)制

30、。調(diào)控脂質(zhì)合成與吸收的活性小分子化合物的篩選及其作用機(jī)制我們將基于上述對(duì)于膽固醇代謝關(guān)鍵蛋白功能與作用機(jī)制的良好研究進(jìn)展，設(shè)計(jì)構(gòu)造可用以高通量化合物篩選的藥靶系統(tǒng)，篩選調(diào)控膽固醇代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)功能的小分子化合物，并對(duì)所獲得的化合物進(jìn)行優(yōu)化改造，獲得先導(dǎo)化合物。進(jìn)而，利用該先導(dǎo)化合物，揭示其在膽固醇代謝調(diào)控及相關(guān)疾?。òǜ吣懝檀佳Y、動(dòng)脈粥樣硬化引起的心血管疾?。┌l(fā)生中的作用。這部分工作既提高前沿基礎(chǔ)研究水平、也促進(jìn)優(yōu)化獲得先導(dǎo)化合物和研發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、針對(duì)膽固醇代謝紊亂疾病的新藥。承擔(dān)單位：中科院上海生命科學(xué)研究院課題負(fù)責(zé)人：宋保亮，研究員，中科院上海生命科學(xué)研究院經(jīng)費(fèi)比例：50課題三、

31、脂質(zhì)貯存和運(yùn)輸密切相關(guān)的重要蛋白研究目標(biāo)闡明Seipin調(diào)控脂滴成熟及脫離內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過(guò)程的功能及分子機(jī)制，并揭示脂滴在脂類合成與運(yùn)輸過(guò)程中的作用及其調(diào)控機(jī)理，以及它與其它細(xì)胞器相互作用機(jī)理。闡明參與膽固醇運(yùn)輸與吸收的重要蛋白NPC1和NPC1L1功能的蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)。1Seipin在脂滴形成過(guò)程中的作用我們將利用基因敲除技術(shù)建立人類遺傳性脂肪營(yíng)養(yǎng)障礙的Seipin突變的果蠅模型，觀察突變體中脂滴的發(fā)育、形成過(guò)程，并利用果蠅體系中豐富的遺傳學(xué)手段尋找Seipin互作基因，研究它們是如何調(diào)控脂滴形成。我們還將從生物化學(xué)的角度利用免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)譜分析尋找Seipin的結(jié)合蛋白，同時(shí)研究這些結(jié)合

32、蛋白對(duì)脂滴形成以及人類遺傳性脂肪營(yíng)養(yǎng)障礙的影響。我們也將利用激光共聚焦實(shí)時(shí)成像技術(shù)輔以熒光標(biāo)記的Seipin及脂滴從細(xì)胞生物學(xué)的角度研究脂滴的動(dòng)態(tài)形成過(guò)程。2脂質(zhì)合成關(guān)鍵酶在脂滴中的功能及其調(diào)控機(jī)制脂滴的蛋白組學(xué)及熒光蛋白的定位研究發(fā)現(xiàn)脂滴上不僅有脂質(zhì)水解酶，同時(shí)還有參與脂質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，這個(gè)發(fā)現(xiàn)顯示脂滴可能具有脂質(zhì)合成功能，為鑒定這個(gè)可能性，我們已成功地建立了脂滴invitro脂質(zhì)合成方法。我們用純化的脂滴，在ATP和CoA存在的條件下，與放射性標(biāo)記的脂肪酸相互作用。反應(yīng)完成后，將脂滴再純化，然后分析脂滴的放射性標(biāo)記的脂質(zhì)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)主要用于檢測(cè)脂滴上Acyl-CoAligase和Acyl-C

33、oAtransferase活性。為了區(qū)分這兩種酶的調(diào)控，我們還可以測(cè)定反應(yīng)中間產(chǎn)物，即放射標(biāo)記的Acyl-CoA，以反映ligase活性。同時(shí)我們還將細(xì)胞質(zhì)加入反應(yīng)，以尋找細(xì)胞質(zhì)中調(diào)控這兩個(gè)酶的活性因子。若細(xì)胞質(zhì)確有調(diào)控這兩個(gè)酶的活性因子，我們將用FPLC和HPLC進(jìn)一步分離純化這個(gè)活性因子。而后，我們將深入研究這個(gè)活性因子調(diào)控Acyl-CoAligase和Acyl-CoAtransferase的分子機(jī)制，為尋找脂滴上這兩個(gè)酶的結(jié)合位點(diǎn)及深入探討它們的活性調(diào)控分子機(jī)理，我們還將用脂滴蛋白進(jìn)行這兩個(gè)酶的免疫共沉淀，然后用質(zhì)譜分析以確定這兩個(gè)酶分別在脂滴上的結(jié)合蛋白。RNAi方法將用于檢驗(yàn)其中哪個(gè)

34、蛋白是確定這兩個(gè)酶在脂滴上定位的蛋白。基因突變技術(shù)及轉(zhuǎn)基因技術(shù)將用于尋找脂滴定位蛋白與之相結(jié)合的酶的結(jié)合位點(diǎn)。3Rab18調(diào)控脂滴與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的相互作用脂滴有可能參與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)運(yùn)輸?shù)募僬f(shuō)基本建立在脂滴表面上被發(fā)現(xiàn)具有一系列膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，尤其是一組小G蛋白，Rabs。其中Rabl8近來(lái)進(jìn)一步被揭示調(diào)控脂滴與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的相互結(jié)合。由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)最主要的脂質(zhì)合成及代謝的細(xì)胞器，所以脂滴與之的相互作用將是脂滴的形成及脂質(zhì)運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵步驟。為此，我們將以Rabl8為基點(diǎn)，進(jìn)一步深入探討脂滴與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相互作用的分子機(jī)制。首先我們將從純化的脂滴上獲得脂滴蛋白，然后用Rabl8抗體進(jìn)行免疫共沉淀，再用質(zhì)譜蛋白分析技術(shù)以

35、確定Rabl8在脂滴上的結(jié)合蛋白。并輔果蠅體系的遺傳篩選技術(shù)研究Rab18的互作蛋白。從這些蛋白中找到Rab18的作用蛋白，用基因突變技術(shù)及RNAi方法檢測(cè)該蛋白在脂滴與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相互作用中的功能。在尋找Rab18在脂滴上的作用蛋白中，我們將用GTP-Rab18(Q67L)和GDP-Rab18(S22N)相互比較，選用GTP-Rab18專一結(jié)合蛋白。分析脂滴與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的相互作用將利用我們已建立的invitro脂滴與endosome相互作用方法。4NSF和aSNAP參與脂滴和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)半融合的功能我們用蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)的NSF和a-SNAP預(yù)示了脂滴有可能參與膜融合過(guò)程。去年發(fā)表的有關(guān)SNARE的脂滴融合

36、的文章證實(shí)了這一假想。但脂滴是否與其它細(xì)胞器融合仍然有待進(jìn)一步證實(shí)。由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與脂滴的相互作用最具生理意義且已被許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，所以我們選用這兩個(gè)細(xì)胞器來(lái)研究它們的融合過(guò)程及調(diào)控。因?yàn)橹沃痪哂袉螌恿姿崮?，所以脂滴的全融合只相?dāng)于其它細(xì)胞器的半融合(hemifusion)。按傳統(tǒng)的膜融合觀念，我們?nèi)约僬f(shuō)這種融合為半融合。我們同時(shí)還假設(shè)脂滴是通過(guò)這種半融合來(lái)傳遞脂質(zhì)的。我們將用自身抑制(self-quenching)濃度的Rh-PE標(biāo)記純化的脂滴，將其與純化的內(nèi)質(zhì)相互作用，用GTP-Rab18,GDP-Rab1&RabGDP,GTP,GDP以及ATP來(lái)調(diào)控這個(gè)反應(yīng)。兩細(xì)胞器的半融合將由Rh-PE濃

37、度稀釋而產(chǎn)生的熒光來(lái)測(cè)定。ATP和NEM將用于分析NSF的作用，a-SNAP的作用蛋白將由脂滴蛋白免疫共沉淀加質(zhì)譜蛋白分析來(lái)確定。膽固醇運(yùn)輸關(guān)鍵膜蛋白NPC1和膽固醇吸收關(guān)鍵膜蛋白NPC1L1功能差異的分子機(jī)理我們將用不同細(xì)胞系對(duì)NPC1及NPC1L1這兩個(gè)高度同源但功能不同的膜蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域嵌合分析，以發(fā)掘有關(guān)決定NPC1及NPC1L1蛋白質(zhì)定位及參與膽固醇運(yùn)輸與吸收所需的結(jié)構(gòu)域，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)域相關(guān)分子機(jī)制探討。同時(shí)我們也將利用NPC1及NPC1L1突變體果蠅模型驗(yàn)證細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并進(jìn)一步探索膽固醇運(yùn)輸?shù)姆肿訖C(jī)制。承擔(dān)單位：中科院北京生物物理研究所課題負(fù)責(zé)人：劉平生，研究員，中科院北京生物

38、物理研究所經(jīng)費(fèi)比例：20（六）各課題間的有機(jī)聯(lián)系以及與項(xiàng)目總體目標(biāo)的關(guān)系本項(xiàng)目包含的三個(gè)課題的設(shè)置相互間緊密相關(guān)，圍繞脂質(zhì)的合成與吸收、運(yùn)輸與貯存等代謝途徑，從脂質(zhì)代謝的直接執(zhí)行蛋白和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子等多個(gè)層面開(kāi)展研究，各個(gè)課題相互關(guān)聯(lián)和逐漸延續(xù)形成一個(gè)完整的研究體系。課題一由研究脂質(zhì)代謝關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的3個(gè)實(shí)驗(yàn)室承擔(dān)；課題二由從事脂質(zhì)合成與吸收、有機(jī)化學(xué)合成、藥物篩選以及臨床研究共5個(gè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合承擔(dān)；課題三由從事脂質(zhì)貯存與運(yùn)輸?shù)?個(gè)實(shí)驗(yàn)室承擔(dān)。首先，脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)受LXR、TR和SREBP等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，該類轉(zhuǎn)錄因子及其復(fù)合物的功能（課題一）和對(duì)脂質(zhì)代謝各個(gè)途徑（包括脂質(zhì)合成與吸收、運(yùn)輸

39、和貯存等）（課題二、三）的調(diào)控作用將被研究。脂質(zhì)合成與吸收（課題二）是人體獲取脂類分子的兩個(gè)途徑，獲取的脂質(zhì)將在胞內(nèi)運(yùn)輸并貯存（課題三），并且其中的代謝活性小分子會(huì)直接作用于關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子包括LXR、SREBP等（課題一）。脂滴是胞內(nèi)脂質(zhì)貯存的主要細(xì)胞器（課題三），同時(shí)，脂滴也參與了脂質(zhì)的合成（課題二）。課題二中的科研隊(duì)伍同時(shí)為三個(gè)課題提供臨床病理樣本、高通量化合物篩選、以及小分子化合物的合成改造等方面合作。因此，在本申請(qǐng)項(xiàng)目各個(gè)課題的研究?jī)?nèi)容均圍繞項(xiàng)目的總體目標(biāo)，針對(duì)脂質(zhì)代謝的不同重要方面，相互獨(dú)立，又緊密聯(lián)系。四、年度計(jì)劃硏究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)第年詳細(xì)分析脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)的功能與結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，揭示其

40、發(fā)揮作用的分子機(jī)制和調(diào)控途徑。構(gòu)建脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)的各種突變體，結(jié)合過(guò)表達(dá)、RNAi或基因敲除等實(shí)驗(yàn)手段，詳細(xì)分析脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，包括對(duì)脂質(zhì)合成、吸收、貯存和運(yùn)輸?shù)榷鄠€(gè)方面的影響。揭示關(guān)鍵蛋白質(zhì)發(fā)揮作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，闡明重要結(jié)構(gòu)域的功能。在細(xì)胞和動(dòng)物個(gè)體水平分析其對(duì)脂質(zhì)代謝的作用，并在不冋脂質(zhì)代謝條件下，分析蛋白質(zhì)的相互作用、修飾、亞細(xì)胞定位等，揭示重要的調(diào)控途徑。獲得多種脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)功能異常的細(xì)胞株和動(dòng)物模型等研究系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵蛋白質(zhì)與脂質(zhì)代謝各個(gè)水平的密切關(guān)系，闡明其相互作用、修飾、亞細(xì)胞定位等，揭示重要的調(diào)控途徑。建立脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)的功能與結(jié)構(gòu)域之間的關(guān)系，揭示其發(fā)揮作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和分子機(jī)制。第年系統(tǒng)地分析和研究脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)復(fù)合物動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，鑒定新的相互作用蛋白。利用酵母雙雜交、GSTpull-down和免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜鑒定等方法，重點(diǎn)研究脂質(zhì)代謝調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子蛋白復(fù)合物（LXR、TR、SREBP）、脂質(zhì)合成與吸收的關(guān)鍵膜蛋白復(fù)合物（gp78、NPC1L1、ACAT）、脂質(zhì)貯存與運(yùn)輸密切相關(guān)的蛋白復(fù)合物（Seipin、Acyl-CoA