(整理)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)的功能與調(diào)控機制cb919000-g

1、精品文檔項目名稱：首席科學家：脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)的功能與調(diào)控機制宋保亮中國科學院上海生命科學研究院起止年限：2009.1至2013.8依托部門：中國科學院一、研究內(nèi)容（一）擬解決的關(guān)鍵科學問題脂質(zhì)代謝包括合成、吸收、運輸、貯存等動態(tài)過程，主要由膜蛋白復(fù)合物介導(dǎo)實現(xiàn)，并且在多個水平受到調(diào)控，包括一些重要轉(zhuǎn)錄因子對脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因的表達調(diào)控作用。脂質(zhì)代謝過程中涉及到膜蛋白復(fù)合物、核轉(zhuǎn)錄因子和小分子代謝物組成復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)。其中的關(guān)鍵蛋白是重要的調(diào)控點，這些蛋白的功能紊亂和調(diào)控失衡將直接導(dǎo)致嚴重代謝性疾病的發(fā)生。本項目擬解決的關(guān)鍵科學問題是（1）發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成和動態(tài)變化規(guī)律；

2、（2）闡明脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白的功能調(diào)控和重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；（3）揭示脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白的生理功能和在重大疾病發(fā)生發(fā)展中的作用；（4）鑒定以脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白為靶點的活性小分子化合物。以上研究成果不僅對蛋白質(zhì)科學、脂質(zhì)代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等學科的基礎(chǔ)理論有重要貢獻，而且有助于解析重要生命活動的基本規(guī)律，為研究心腦血管疾病、脂肪肝、糖尿病和肥胖等重大疾病的發(fā)生機理、疾病早期診斷和治療奠定重要基礎(chǔ)。（二）主要研究內(nèi)容本項目將圍繞脂質(zhì)的合成、吸收、運輸、貯存等過程，針對其中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)和調(diào)控因子開展研究。力圖將大規(guī)模和系統(tǒng)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析與經(jīng)典的科學假設(shè)驅(qū)動的研究策略相結(jié)合，將蛋白質(zhì)復(fù)合物的功能研究從整體

3、與局部兩個方面有機的結(jié)合起來，分析蛋白質(zhì)在脂質(zhì)代謝中的分子調(diào)控機制和整體功能作用，尋找其功能調(diào)控在生理與病理狀態(tài)下的動態(tài)變化。闡釋重要蛋白質(zhì)在脂質(zhì)代謝中的功能與調(diào)控機制。系統(tǒng)地分析脂質(zhì)代謝過程中重要蛋白質(zhì)之間的相互作用，鑒定新的結(jié)合蛋白。通過規(guī)模性的蛋白質(zhì)相互作用篩選方法，我們將重點研究脂質(zhì)代謝調(diào)控過程中重要核轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、脂質(zhì)合成與吸收過程中的膜蛋白復(fù)合物以及脂質(zhì)運輸和貯存過程的蛋白質(zhì)復(fù)合物等。深入探討蛋白質(zhì)介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝動態(tài)變化過程。通過動態(tài)定量脂質(zhì)分析技術(shù)，并結(jié)合其它現(xiàn)代生物學的研究方法，分析蛋白質(zhì)和脂質(zhì)分子的相互作用，動態(tài)轉(zhuǎn)運和定位變化。解析重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)的調(diào)控

4、作用。脂質(zhì)代謝過程產(chǎn)生大量的小分子代謝物和衍生物，它們中相當一部分具有調(diào)控活性，能夠前饋或反饋作用于脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白，對相應(yīng)的代謝途徑產(chǎn)生重要影響，本項目將發(fā)現(xiàn)并揭示該類信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，闡明其生理功能。解析脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)功能調(diào)控異常在重大疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。利用細胞、動物模型和病理樣本，開展脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白在心腦血管疾病、脂肪肝、糖尿病和肥胖發(fā)生發(fā)展中的分子病理學機制研究。構(gòu)建篩選活性小分子化合物的靶點系統(tǒng)，進行高通量篩選獲得各種活性小分子化合物。鑒定具有功能作用的小分子化合物，進行構(gòu)效優(yōu)化獲得先導(dǎo)結(jié)構(gòu)分子等研究爭取深入相應(yīng)藥物的研發(fā)。二、預(yù)期目標(一)總體目標本項目針對脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白的

5、功能與調(diào)控機制開展前沿領(lǐng)域研究，系統(tǒng)地分析蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成、相互作用、動態(tài)變化及在脂質(zhì)代謝中的功能調(diào)控作用。鑒定脂質(zhì)代謝中重要蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成和作用機制，發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控機制和信號途徑，揭示其在脂質(zhì)代謝中的作用機理，闡明其在心腦血管病、糖尿病和肥胖等重大疾病發(fā)生發(fā)展中的病理學意義，并篩選獲得活性小分子化合物。以上研究成果必將為脂質(zhì)代謝和蛋白質(zhì)科學的基礎(chǔ)理論增添新的內(nèi)容，為我國人口與健康事業(yè)做出重要貢獻。本項目的實施將獲得一系列具有國際領(lǐng)先和擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的研究成果，打造一支達到國際先進水平的研究脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白質(zhì)的科研隊伍，躋身于國際蛋白質(zhì)科學研究的領(lǐng)先行列。(二)五年預(yù)期目標1.在基礎(chǔ)理論

6、研究方面：從分子、細胞到動物整體水平，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成、新途徑及新相互作用，闡明生理和病理狀態(tài)下蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系；鑒定脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白的重要功能調(diào)控和發(fā)現(xiàn)新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，發(fā)現(xiàn)重要的調(diào)控點和作用機制；闡明脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白在脂類分子合成、吸收、運輸、貯存中的功能作用，揭示其生理功能和在重大疾病發(fā)生發(fā)展中的作用；發(fā)現(xiàn)以脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)為靶點的活性小分子化合物，鑒定具有功能作用的小分子化合物，進行構(gòu)效優(yōu)化獲得先導(dǎo)結(jié)構(gòu)分子等研究，并在動物水平分析獲得其對脂質(zhì)代謝和心腦血管疾病、糖尿病和肥胖等疾病的作用。2.在應(yīng)用基礎(chǔ)研究方面：鑒定三種以上可供心腦血管疾病、糖尿病和肥胖等代謝性疾病

7、診治與新藥開發(fā)等研究的重要靶標，開發(fā)和建立蛋白質(zhì)復(fù)合物特別是膜蛋白復(fù)合物動態(tài)變化研究的新方法和新技術(shù)，申請8項以上發(fā)明專利，促進有自主知識產(chǎn)權(quán)新藥的開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化。3.成果考核指標：在國際一流雜志（IF10）發(fā)表論文8-10篇，在有影響力的雜志（IF5）上發(fā)表論文20-40篇。4.人才培養(yǎng)：培養(yǎng)博士研究生30-50人，國家杰出青年等高級人才3-5名。三、研究方案（一）學術(shù)思路脂質(zhì)代謝是生命活動的重要事件，并與重大疾病的發(fā)生密切相關(guān)。蛋白質(zhì)是脂質(zhì)代謝及其調(diào)控的主要執(zhí)行者，認識脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)分子的生化特性及其相互作用將有助于解釋脂質(zhì)代謝調(diào)控的規(guī)律、闡明重大疾病的發(fā)病機制，為藥物靶點的發(fā)現(xiàn)和藥物開

8、發(fā)提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。本項目主要從脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成和動態(tài)變化規(guī)律、重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、生理功能、病理作用和與之相互作用的小分子等方面著手，應(yīng)用現(xiàn)代生物學（包括生物化學、細胞生物學、蛋白質(zhì)組學等）技術(shù)，研究脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)動態(tài)變化及其對脂質(zhì)代謝的作用，揭示其與重大代謝性疾?。ㄈ鐒用}粥樣硬化、冠心病、中風、糖尿病、脂肪肝、肥胖等）發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在關(guān)系，創(chuàng)建我國脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的功能研究的基礎(chǔ)理論和技術(shù)體系。（二）技術(shù)路線蛋白質(zhì)幾乎介導(dǎo)所有的生命活動，在脂質(zhì)代謝領(lǐng)域的關(guān)鍵蛋白，又有其顯著特點，如脂質(zhì)代謝涉及較復(fù)雜的膜蛋白復(fù)合物；有代謝小分子與蛋白質(zhì)的直接相互作用與調(diào)控；以

9、及有很強的應(yīng)用前景。因此，本申請項目首先在分子水平研究脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成、功能調(diào)控、重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；其次在動物整體水平分析重要蛋白因子對脂質(zhì)代謝和疾病發(fā)生的影響，同時利用病理樣本開展病理學研究；最后基于這些前沿進展，構(gòu)建以脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)為靶點的活性小分子化合物篩選系統(tǒng)，篩選獲得具有臨床應(yīng)用前景化合物。本項目從分子水平揭示蛋白質(zhì)的功能調(diào)控機制，在整體水平闡明其生理和病理作用，并最終旨在研發(fā)新型調(diào)脂藥物。本項目針對細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝的動態(tài)過程設(shè)置了相應(yīng)的三個研究課題，包括：（1）脂質(zhì)代謝調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子；（2）脂質(zhì)合成與吸收的關(guān)鍵膜蛋白及其復(fù)合物；（3）脂質(zhì)貯存和運輸密切相關(guān)的重要

10、蛋白?？傮w技術(shù)途徑如下圖：酵母雙雜交、免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)等鑒定相互作用的新蛋白（三）可行性分析本研究項目的總體研究方案切實可行從學術(shù)思路上，本項目擬從脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成和動態(tài)變化規(guī)律、重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、生理功能、病理作用和與之相互作用的小分子等方面著手，應(yīng)用現(xiàn)代生物學（包括生物化學、細胞生物學、蛋白質(zhì)組學等）技術(shù)，研究脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)動態(tài)變化及其對脂質(zhì)代謝的作用，揭示其與重大代謝性疾?。ㄈ鐒用}粥樣硬化、冠心病、中風、糖尿病、脂肪肝、肥胖等）發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在關(guān)系，創(chuàng)建我國脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的功能研究的基礎(chǔ)理論和技術(shù)體系。由于蛋白質(zhì)脂質(zhì)代謝及其調(diào)控的主要執(zhí)行者，蛋白質(zhì)功能

11、異常是重大疾病發(fā)生的重要原因，因此以脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)等科學前沿作為切入點，研究脂質(zhì)代謝調(diào)控和疾病的關(guān)系切實可行。從技術(shù)途徑上看，本項目設(shè)置三個課題，以脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白的重要調(diào)節(jié)功能為主線，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用為共同的主題，應(yīng)用蛋白質(zhì)科學和其它現(xiàn)代生物學的技術(shù)（如酵母雙雜交系統(tǒng)、免疫共沉淀技術(shù)、質(zhì)譜分析、脂質(zhì)代謝分析、高通量化合物篩選等），尋找脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白在生理與病理狀態(tài)下的功能變化，闡釋其生物學功能與調(diào)控機制。三個具體研究課題的技術(shù)途徑和路線清晰和明確，切實可行。本研究項目凝聚了優(yōu)秀的研究團隊本項目有高級職稱人員9名，其他研究技術(shù)人員22名，平均年齡為34.3歲。研究隊伍包括“國家杰出

12、青年基金”獲得者3名、中科院“百人計劃”入選者5名。本項目凝聚的優(yōu)秀研究團隊，確保了本項目切實可行。研究團隊成員已經(jīng)承擔多項本研究項目相關(guān)項目，其中包括國家“十五”科技攻關(guān)計劃課題、科技部“973”項目、科技部“863”項目、國家自然科學基金重點項目、國家杰出青年基金、國家自然科學基金創(chuàng)新團隊和國際合作項目。特別是具有相關(guān)國家級重大/重點項目順利實施的豐富經(jīng)驗，扎實的工作基礎(chǔ)確保了本研究項目順利實施本研究團隊在蛋白質(zhì)復(fù)合物動態(tài)變化的分子機制和功能研究方面有著非常扎實的研究基礎(chǔ)，近5年來，項目組成員已經(jīng)作為通訊作者/第一作者在Cell子刊上發(fā)表論文5篇，影響因子大于10分的有10篇，影響因子大于

13、5分的有30余篇。良好的工作條件和環(huán)境為本研究項目順利完成提供了保障本項目依托、承擔和參加研究單位（中國科學院上海生命科學研究院、中國科學院北京生物物理研究所和中國科學院北京遺傳發(fā)育研究所等）都屬于國內(nèi)一流的科研院校，有很強的綜合科研實力。并且大部分科研骨干都依托于多個國家級和省部級重點實驗室，包括分子生物學國家重點實驗室，這些國內(nèi)一流的科研院校及所依托的國家級和省部級重點實驗室為本項目的開展提供了良好的工作環(huán)境和條件。本項目依托、承擔和參加研究單位裝備了開展分子生物學、細胞生物學、免疫學、電生理、形態(tài)學和行為學方面研究的儀器設(shè)備，建立了成熟的實驗方法，包括免疫熒光組織化學技術(shù)、激光共聚焦顯微

14、鏡術(shù)、包埋前/后免疫電鏡技術(shù)、活細胞成像技術(shù)、流式細胞分析技術(shù)、分子原位雜交技術(shù)、酵母雙雜交系統(tǒng)、免疫共沉淀技術(shù)、全細胞膜片嵌技術(shù)、動物模型制備、行為學分析以及蛋白質(zhì)肽譜分析、轉(zhuǎn)基因動物制備和基因敲除技術(shù)等。這些條件都確保了本項目在儀器設(shè)備和技術(shù)方法的需求方面切實可行。（四）創(chuàng)新點與特色脂質(zhì)代謝是生命活動的重要事件，并與冠心病、腦中風、糖尿病、肥胖等重大疾病的發(fā)生密切相關(guān)。蛋白質(zhì)是脂質(zhì)代謝及其調(diào)控的主要執(zhí)行者，認識脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)分子的生化特性及其相互作用將有助于解釋脂質(zhì)代謝調(diào)控的規(guī)律、闡明重大疾病的發(fā)病機制，為藥物靶點的發(fā)現(xiàn)和藥物開發(fā)提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。本申請項目開展的脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白

15、質(zhì)的研究，有以下顯著特點與創(chuàng)新點。第一、脂質(zhì)代謝過程涉及許多重要的膜蛋白及其復(fù)合物。由于脂類分子高度疏水，其相當多的代謝步驟發(fā)生在細胞膜性結(jié)構(gòu)內(nèi)，有許多膜蛋白參與，膜蛋白復(fù)合物的功能調(diào)控精細并且極其重要，已成為國際前沿重點領(lǐng)域研究。但是，針對生命體膜性結(jié)構(gòu)環(huán)境的特異性研究技術(shù)方法進展緩慢，因此，本申請項目中針對脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白，特別是膜蛋白復(fù)合物的探索，既是當前研究的熱點、又是難點。第二、脂質(zhì)代謝過程中涉及很多蛋白質(zhì)和小分子的相互作用。這些相互作用，不僅僅表現(xiàn)為酶與底物的關(guān)系，更為重要的是活性代謝小分子作為觸發(fā)信號，引起細胞內(nèi)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，對其自身或相關(guān)代謝進行反饋或前饋調(diào)控。本申請項目

16、的各個課題中，都將對小分子參與的重要調(diào)控事件開展研究。第三、對脂質(zhì)代謝調(diào)控關(guān)鍵蛋白的研究，有很強的應(yīng)用性。不僅由于脂質(zhì)代謝與重要疾病發(fā)生密切相關(guān)，更是因為在對脂質(zhì)代謝調(diào)控的研究過程中，可以揭示內(nèi)源重要的調(diào)節(jié)小分子和信號通路，本項目中，基于對關(guān)鍵蛋白質(zhì)的前沿研究，已經(jīng)或即將開展活性小分子化合物的篩選，為我國人口與健康事業(yè)作出貢獻。（五）課題設(shè)置課題設(shè)置思路：本項目擬從“脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)的功能與調(diào)控機制”這一關(guān)鍵科學問題出發(fā)，圍繞脂質(zhì)代謝調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子、脂質(zhì)合成與吸收、脂質(zhì)運輸和貯存等過程，著眼于脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成和動態(tài)變化規(guī)律、重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、生理功能、病理作用和與之相互作用

17、的小分子化合物，研究脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)動態(tài)變化及其對脂質(zhì)代謝的作用，揭示其與重大代謝性疾?。ㄈ鐒用}粥樣硬化、冠心病、中風、糖尿病、肥胖等）發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在關(guān)系，揭示其在生命活動中的規(guī)律，為疾病的診斷和治療及其藥物靶點的開發(fā)提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。因此，本項目擬設(shè)立三個課題：課題一，脂質(zhì)代謝調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子；課題二，脂質(zhì)合成與吸收的關(guān)鍵膜蛋白及其復(fù)合物；課題三，脂質(zhì)運輸和貯存密切相關(guān)的重要蛋白。課題一、脂質(zhì)代謝調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子研究目標本項目將通過研究LXR、TR和SREBP在不同組織中和不同配體水平下與其它蛋白質(zhì)的互相作用，闡明轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控脂質(zhì)代謝的時空性從而揭示轉(zhuǎn)錄功能的調(diào)控機制。本項目將從

18、分子、細胞、組織和動物水平，在體外和體內(nèi)研究蛋白質(zhì)相互作用，著重于研究蛋白質(zhì)相互作用調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子功能的分子機制。利用脂質(zhì)代謝調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子作為靶點篩選出與代謝性疾病相關(guān)的天然小分子化合物并在動物模型上進一步研究預(yù)測其臨床效果。研究內(nèi)容1TR調(diào)控蛋白的鑒定與功能研究通過酵母雙雜交，我們初步鑒定出了一些新的TR相互作用蛋白質(zhì)，包括一些轉(zhuǎn)錄因子(比如forkheadboxO，B-celllymphoma6protein)和輔助因子(如：Sin3A-associatedprotein，ligand-dependentcorepressor，mixed-lineageleukaemia)。在本項目研

19、究中，我們將以GSTPull-down、Co-IP等方法對這些潛在的相互作用蛋白質(zhì)因子進行鑒定和確認，并研究各結(jié)合蛋白的表達譜。對于那些輔助因子，我們還將分離純化其所在的復(fù)合物，鑒定該復(fù)合物的各個組成。除了研究TR與其它轉(zhuǎn)錄因子之間可能存在的cross-talk之外，我們將側(cè)重于研究那些能調(diào)控染色質(zhì)重塑的輔助因子和或具有肝臟組織特異性或脂肪組織特異性表達的輔助因子，研究其生物學功能，闡明其對TR蛋白質(zhì)功能的影響和有關(guān)脂肪酸代謝方面的調(diào)控機制。2脂肪和肝臟組織特異性的LXR和SREBP輔助因子的鑒定與功能研究由于缺少商業(yè)化的脂肪組織的酵母雙雜交文庫，我們將分別構(gòu)建小鼠白色和褐色脂肪組織的酵母雙雜

20、交文庫,篩選脂肪組織特異的LXR和SREBP結(jié)合蛋白，特別是輔助因子包括輔激活蛋白和輔阻遏蛋白。同時我們將利用親和層析的方法直接從小鼠肝臟組織和脂肪組織的核抽提物中分離LXR和SREBP結(jié)合蛋白。在確認感興趣的LXR和SREBP輔助因子后，我們將再次利用以上兩種方法發(fā)現(xiàn)和鑒定輔助因子復(fù)合物的各個組成蛋白，進一步揭示該輔助因子復(fù)合物是如何調(diào)控LXR和SREBP，配合LXR和SREBP來調(diào)節(jié)肝臟細胞和脂肪細胞的脂質(zhì)代謝的。其中我們將側(cè)重于研究那些有翻譯后修飾功能的輔助因子或被翻譯后修飾所調(diào)控的輔助因子，闡明甲基化，乙?；?，磷酸化，泛素化和蘇素化這些翻譯后修飾過程調(diào)控LXR和TR蛋白質(zhì)功能的分子機制

21、。3亮氨酸缺乏時mTOR對SREBP-lc的功能調(diào)控為驗證mTOR對GCN2依賴的脂肪合成的調(diào)節(jié)作用是必要的這一假設(shè)，在Gcn2-/-小鼠中我們將用雷帕霉素處理來阻斷mTOR信號通路，看是否可以模擬在Gcn2+/+小鼠中亮氨酸缺乏引起的脂肪合成抑制。Gcn2-/-小鼠將用亮氨酸缺乏飲食喂養(yǎng)7天，在第4天時注射雷帕霉素(bid,0.5mg/kg),直持續(xù)注射到第7天。所有的評估脂肪合成和相關(guān)代謝指標將被詳細檢測。尤其是我們將觀測脂肪肝是否消失或緩解，肝中TAG是否降低和脂肪合成基因是否被抑制。如果我們能夠證明mTOR的確是參與介導(dǎo)GCN2依賴的脂肪合成的調(diào)控，我們將進一步檢測mTOR的上下游蛋白

22、，如S6激酶(S6K)、真核細胞啟動子4E結(jié)合蛋白(eIF4Ebindingprotein,eIF4EBP)和hVPs34的功能作用。4亮氨酸缺乏時LXRa/RXR對SREBPIc的功能調(diào)控LXRa/RXR是SREBP-lc的主要調(diào)控因子，我們將首先檢測LXRa/RXR的表達和活性在亮氨酸缺乏飲食喂養(yǎng)的Gcn2+/+和Gcn2-/-小鼠肝中是否存在差異。LXRa/RXR的mRNA水平和蛋白水平將分別用qRT-PCR和westernblots的方法檢驗。為評估LXRa/RXR結(jié)合到SREBP-1c啟動子上的能力，我們將應(yīng)用Nakatani的方法，用percoll梯度離心純化的肝細胞核提取物進行E

23、MSA(gelmobilityshiftassays)實驗。如果在亮氨酸缺乏后Gcn2+/+小鼠中的LXRa和RXR兩者或其一的表達被抑制，而在Gcn2-/-小鼠中沒有出現(xiàn)，那么意味著它們或其一可能是介導(dǎo)GCN2對SREBP-1c的調(diào)節(jié)。但是，因為多不飽和脂肪酸和氧化固醇可以修飾LXRa/RXR異二聚體的形成或與SREBP-1c啟動子結(jié)合的親和性，所以，如果我們發(fā)現(xiàn)兩種小鼠中僅是LXRa/RXR異二聚體的結(jié)合活性不同，則說明該變化可能是通過多不飽和脂肪酸和氧化固醇的變化來實現(xiàn)的。如果多不飽和脂肪酸組成和水平改變，那就意味著它是LXRa/RXR水平改變的主要原因。5.調(diào)控TR、LXR和SREBP

24、活性小分子的篩選及其作用機制在上述對脂肪酸代謝關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子功能與作用機制的基礎(chǔ)上，篩選調(diào)控脂肪酸代謝關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子功能的天然活性小分子，尋找先導(dǎo)化合物。將3T3-L1脂肪前體細胞分化成脂肪細胞作為體外模型，采用競爭結(jié)合法和報告基因分析法篩選出小分子化合物，檢測LXRa，TR，SREBP-1c以及靶基因FAS、SCD-1、ACC的基因表達，在細胞模型上首先論證篩選出的小分子化合物對脂肪合成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。采用高脂餐誘導(dǎo)建立肥胖動物模型或db/db糖尿病小鼠，在動物模型上證實小分子化合物對脂肪酸關(guān)鍵蛋白質(zhì)合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響和作用及預(yù)防和治療代謝綜合癥的效果。承擔單位：中科院上海生命科學研究

25、院課題負責人：秦瑩，研究員，中科院上海生命科學研究院經(jīng)費比例：30課題二、脂質(zhì)合成與吸收的關(guān)鍵膜蛋白及其復(fù)合物研究目標闡明脂質(zhì)合成與吸收的關(guān)鍵膜蛋白HMGCR、NPC1L1和ACAT等發(fā)揮功能的分子機制，鑒定上述膜蛋白復(fù)合物的關(guān)鍵組成因子，揭示其重要生物學功能及調(diào)控機制。探索這些重要蛋白質(zhì)在膽固醇代謝調(diào)控、動脈粥樣硬化及心腦血管疾病發(fā)生中的功能作用，篩選活性小分子化合物，為相關(guān)疾病的診斷、藥物靶點的開發(fā)及先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供直接基礎(chǔ)。研究內(nèi)容膜蛋白HMGCR降解復(fù)合物中蛋白質(zhì)因子的鑒定與功能研究HMGCR是膽固醇合成途徑中的限速酶，其蛋白質(zhì)降解受反應(yīng)下游產(chǎn)物甾醇反饋調(diào)控。我們前期研究結(jié)果已經(jīng)揭

26、示Insig/gp78/VCP/Ufd1復(fù)合物介導(dǎo)了HMGCR蛋白降解，但該復(fù)合物中的其它蛋白因子尚未被完全發(fā)現(xiàn)，我們將利用酵母雙雜交、免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合大規(guī)模質(zhì)譜鑒定等手段，系統(tǒng)地篩選與HMGCR及其復(fù)合物中Insig和gp78等結(jié)合的蛋白質(zhì)，研究它們在HMGCR蛋白質(zhì)降解以及膽固醇合成代謝中的生物學功能。脂質(zhì)吸收關(guān)鍵膜蛋白NPC1L1的作用機制與結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)NPC1L1是介導(dǎo)膽固醇吸收的關(guān)鍵蛋白，它含有1300多個氨基酸，序列預(yù)測含有多個跨膜結(jié)構(gòu)域，其中的5個跨膜區(qū)段構(gòu)成保守的“甾醇感受結(jié)構(gòu)域”(SterolSensingDomain,SSD)。我們前期工作揭示甾醇促進Clathrin/AP2

27、介導(dǎo)的NPC1L1的內(nèi)吞，揭示了NPC1L1介導(dǎo)膽固醇吸收的分子機制。為深入研究NPC1L1蛋白在膽固醇吸收過程中發(fā)揮作用重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，我們在這部分工作中將重點篩選鑒定NPC1L1蛋白結(jié)合膽固醇的位點以及鑒定其結(jié)合AP2復(fù)合物2亞基的Motif。NPC1L1膜蛋白復(fù)合物中新蛋白因子的鑒定與功能研究我們前期研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇促進NPC1L1蛋白從細胞質(zhì)膜向胞內(nèi)小泡轉(zhuǎn)運，它通過小泡內(nèi)吞而將膽固醇大量運輸進細胞。NPC1L1在其動態(tài)調(diào)控及行使功能過程中，涉及到和其它蛋白相互作用，形成復(fù)雜的膜蛋白復(fù)合物。我們在這部分研究內(nèi)容中，將利用酵母雙雜交以及免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜鑒定的方法，尋找鑒定NPC1L1膜蛋白

28、復(fù)合物中的未知蛋白因子，深入研究其中NPC1L1蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運以及膽固醇吸收過程中的生物學功能。膽固醇酯合成酶ACAT蛋白降解調(diào)控的分子機制及其作用ACAT是細胞內(nèi)唯一催化膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懝檀减サ拿?，它對于維持膽固醇代謝平衡、減少膽固醇毒性以及在膽固醇吸收和脂蛋白裝配中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。但是，ACAT基因的轉(zhuǎn)錄并不直接受膽固醇水平的調(diào)控。我們在前期探索中發(fā)現(xiàn)，膽固醇能夠顯著增加ACAT的蛋白量，推測膽固醇前饋提高ACAT的穩(wěn)定性，并且發(fā)現(xiàn)Insig在ACAT的降解過程中發(fā)揮作用。我們將深入研究Insig/gp78/VCP/Ufdl復(fù)合物是否同時介導(dǎo)ACAT蛋白降解，鑒定ACAT的泛素化修飾位點，

29、揭示參與其降解調(diào)控的重要蛋白質(zhì)，以及探索相應(yīng)的調(diào)控機制及生物學意義。ACAT1不同異構(gòu)體的功能與調(diào)控機制我們前期研究揭示ACAT-1基因定位于兩條染色體上，由各自的啟動子轉(zhuǎn)錄出兩個前體RNA,通過反式和順式剪接產(chǎn)生出多種成熟的mRNA,后者通過AUG和非AUG起始翻譯分別編碼50-kDa和56-kDaACAT蛋白。我們將深入研究不同形式的ACAT-1Isoform的膜拓撲結(jié)構(gòu)、酶活性、聚集體形式以及對甾醇和脂肪酸的底物特異性。同時分析它們的組織細胞和不同生理病理條件的表達譜、亞細胞地位等，該工作將揭示ACAT-1不同Isoform在細胞內(nèi)膽固醇和膽固醇酯之間的代謝平衡調(diào)控中的功能作用和調(diào)控機制

30、。調(diào)控脂質(zhì)合成與吸收的活性小分子化合物的篩選及其作用機制我們將基于上述對于膽固醇代謝關(guān)鍵蛋白功能與作用機制的良好研究進展，設(shè)計構(gòu)造可用以高通量化合物篩選的藥靶系統(tǒng)，篩選調(diào)控膽固醇代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)功能的小分子化合物，并對所獲得的化合物進行優(yōu)化改造，獲得先導(dǎo)化合物。進而，利用該先導(dǎo)化合物，揭示其在膽固醇代謝調(diào)控及相關(guān)疾?。òǜ吣懝檀佳Y、動脈粥樣硬化引起的心血管疾?。┌l(fā)生中的作用。這部分工作既提高前沿基礎(chǔ)研究水平、也促進優(yōu)化獲得先導(dǎo)化合物和研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)、針對膽固醇代謝紊亂疾病的新藥。承擔單位：中科院上海生命科學研究院課題負責人：宋保亮，研究員，中科院上海生命科學研究院經(jīng)費比例：50課題三、

31、脂質(zhì)貯存和運輸密切相關(guān)的重要蛋白研究目標闡明Seipin調(diào)控脂滴成熟及脫離內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過程的功能及分子機制，并揭示脂滴在脂類合成與運輸過程中的作用及其調(diào)控機理，以及它與其它細胞器相互作用機理。闡明參與膽固醇運輸與吸收的重要蛋白NPC1和NPC1L1功能的蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)。1Seipin在脂滴形成過程中的作用我們將利用基因敲除技術(shù)建立人類遺傳性脂肪營養(yǎng)障礙的Seipin突變的果蠅模型，觀察突變體中脂滴的發(fā)育、形成過程，并利用果蠅體系中豐富的遺傳學手段尋找Seipin互作基因，研究它們是如何調(diào)控脂滴形成。我們還將從生物化學的角度利用免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)譜分析尋找Seipin的結(jié)合蛋白，同時研究這些結(jié)合

32、蛋白對脂滴形成以及人類遺傳性脂肪營養(yǎng)障礙的影響。我們也將利用激光共聚焦實時成像技術(shù)輔以熒光標記的Seipin及脂滴從細胞生物學的角度研究脂滴的動態(tài)形成過程。2脂質(zhì)合成關(guān)鍵酶在脂滴中的功能及其調(diào)控機制脂滴的蛋白組學及熒光蛋白的定位研究發(fā)現(xiàn)脂滴上不僅有脂質(zhì)水解酶，同時還有參與脂質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，這個發(fā)現(xiàn)顯示脂滴可能具有脂質(zhì)合成功能，為鑒定這個可能性，我們已成功地建立了脂滴invitro脂質(zhì)合成方法。我們用純化的脂滴，在ATP和CoA存在的條件下，與放射性標記的脂肪酸相互作用。反應(yīng)完成后，將脂滴再純化，然后分析脂滴的放射性標記的脂質(zhì)。這個實驗主要用于檢測脂滴上Acyl-CoAligase和Acyl-C

33、oAtransferase活性。為了區(qū)分這兩種酶的調(diào)控，我們還可以測定反應(yīng)中間產(chǎn)物，即放射標記的Acyl-CoA，以反映ligase活性。同時我們還將細胞質(zhì)加入反應(yīng)，以尋找細胞質(zhì)中調(diào)控這兩個酶的活性因子。若細胞質(zhì)確有調(diào)控這兩個酶的活性因子，我們將用FPLC和HPLC進一步分離純化這個活性因子。而后，我們將深入研究這個活性因子調(diào)控Acyl-CoAligase和Acyl-CoAtransferase的分子機制，為尋找脂滴上這兩個酶的結(jié)合位點及深入探討它們的活性調(diào)控分子機理，我們還將用脂滴蛋白進行這兩個酶的免疫共沉淀，然后用質(zhì)譜分析以確定這兩個酶分別在脂滴上的結(jié)合蛋白。RNAi方法將用于檢驗其中哪個

34、蛋白是確定這兩個酶在脂滴上定位的蛋白?；蛲蛔兗夹g(shù)及轉(zhuǎn)基因技術(shù)將用于尋找脂滴定位蛋白與之相結(jié)合的酶的結(jié)合位點。3Rab18調(diào)控脂滴與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的相互作用脂滴有可能參與細胞內(nèi)脂質(zhì)運輸?shù)募僬f基本建立在脂滴表面上被發(fā)現(xiàn)具有一系列膜轉(zhuǎn)運蛋白，尤其是一組小G蛋白，Rabs。其中Rabl8近來進一步被揭示調(diào)控脂滴與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的相互結(jié)合。由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)最主要的脂質(zhì)合成及代謝的細胞器，所以脂滴與之的相互作用將是脂滴的形成及脂質(zhì)運輸?shù)年P(guān)鍵步驟。為此，我們將以Rabl8為基點，進一步深入探討脂滴與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相互作用的分子機制。首先我們將從純化的脂滴上獲得脂滴蛋白，然后用Rabl8抗體進行免疫共沉淀，再用質(zhì)譜蛋白分析技術(shù)以

35、確定Rabl8在脂滴上的結(jié)合蛋白。并輔果蠅體系的遺傳篩選技術(shù)研究Rab18的互作蛋白。從這些蛋白中找到Rab18的作用蛋白，用基因突變技術(shù)及RNAi方法檢測該蛋白在脂滴與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相互作用中的功能。在尋找Rab18在脂滴上的作用蛋白中，我們將用GTP-Rab18(Q67L)和GDP-Rab18(S22N)相互比較，選用GTP-Rab18專一結(jié)合蛋白。分析脂滴與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的相互作用將利用我們已建立的invitro脂滴與endosome相互作用方法。4NSF和aSNAP參與脂滴和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)半融合的功能我們用蛋白組學研究發(fā)現(xiàn)的NSF和a-SNAP預(yù)示了脂滴有可能參與膜融合過程。去年發(fā)表的有關(guān)SNARE的脂滴融合

36、的文章證實了這一假想。但脂滴是否與其它細胞器融合仍然有待進一步證實。由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與脂滴的相互作用最具生理意義且已被許多實驗證實，所以我們選用這兩個細胞器來研究它們的融合過程及調(diào)控。因為脂滴只具有單層磷酸膜，所以脂滴的全融合只相當于其它細胞器的半融合(hemifusion)。按傳統(tǒng)的膜融合觀念，我們?nèi)约僬f這種融合為半融合。我們同時還假設(shè)脂滴是通過這種半融合來傳遞脂質(zhì)的。我們將用自身抑制(self-quenching)濃度的Rh-PE標記純化的脂滴，將其與純化的內(nèi)質(zhì)相互作用，用GTP-Rab18,GDP-Rab1&RabGDP,GTP,GDP以及ATP來調(diào)控這個反應(yīng)。兩細胞器的半融合將由Rh-PE濃

37、度稀釋而產(chǎn)生的熒光來測定。ATP和NEM將用于分析NSF的作用，a-SNAP的作用蛋白將由脂滴蛋白免疫共沉淀加質(zhì)譜蛋白分析來確定。膽固醇運輸關(guān)鍵膜蛋白NPC1和膽固醇吸收關(guān)鍵膜蛋白NPC1L1功能差異的分子機理我們將用不同細胞系對NPC1及NPC1L1這兩個高度同源但功能不同的膜蛋白進行結(jié)構(gòu)域嵌合分析，以發(fā)掘有關(guān)決定NPC1及NPC1L1蛋白質(zhì)定位及參與膽固醇運輸與吸收所需的結(jié)構(gòu)域，并進行結(jié)構(gòu)域相關(guān)分子機制探討。同時我們也將利用NPC1及NPC1L1突變體果蠅模型驗證細胞系的實驗結(jié)果，并進一步探索膽固醇運輸?shù)姆肿訖C制。承擔單位：中科院北京生物物理研究所課題負責人：劉平生，研究員，中科院北京生物

38、物理研究所經(jīng)費比例：20（六）各課題間的有機聯(lián)系以及與項目總體目標的關(guān)系本項目包含的三個課題的設(shè)置相互間緊密相關(guān)，圍繞脂質(zhì)的合成與吸收、運輸與貯存等代謝途徑，從脂質(zhì)代謝的直接執(zhí)行蛋白和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子等多個層面開展研究，各個課題相互關(guān)聯(lián)和逐漸延續(xù)形成一個完整的研究體系。課題一由研究脂質(zhì)代謝關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的3個實驗室承擔；課題二由從事脂質(zhì)合成與吸收、有機化學合成、藥物篩選以及臨床研究共5個實驗室聯(lián)合承擔；課題三由從事脂質(zhì)貯存與運輸?shù)?個實驗室承擔。首先，脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達受LXR、TR和SREBP等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，該類轉(zhuǎn)錄因子及其復(fù)合物的功能（課題一）和對脂質(zhì)代謝各個途徑（包括脂質(zhì)合成與吸收、運輸

39、和貯存等）（課題二、三）的調(diào)控作用將被研究。脂質(zhì)合成與吸收（課題二）是人體獲取脂類分子的兩個途徑，獲取的脂質(zhì)將在胞內(nèi)運輸并貯存（課題三），并且其中的代謝活性小分子會直接作用于關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子包括LXR、SREBP等（課題一）。脂滴是胞內(nèi)脂質(zhì)貯存的主要細胞器（課題三），同時，脂滴也參與了脂質(zhì)的合成（課題二）。課題二中的科研隊伍同時為三個課題提供臨床病理樣本、高通量化合物篩選、以及小分子化合物的合成改造等方面合作。因此，在本申請項目各個課題的研究內(nèi)容均圍繞項目的總體目標，針對脂質(zhì)代謝的不同重要方面，相互獨立，又緊密聯(lián)系。四、年度計劃硏究內(nèi)容預(yù)期目標第年詳細分析脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)的功能與結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，揭示其

40、發(fā)揮作用的分子機制和調(diào)控途徑。構(gòu)建脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)的各種突變體，結(jié)合過表達、RNAi或基因敲除等實驗手段，詳細分析脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)的生物學功能，包括對脂質(zhì)合成、吸收、貯存和運輸?shù)榷鄠€方面的影響。揭示關(guān)鍵蛋白質(zhì)發(fā)揮作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，闡明重要結(jié)構(gòu)域的功能。在細胞和動物個體水平分析其對脂質(zhì)代謝的作用，并在不冋脂質(zhì)代謝條件下，分析蛋白質(zhì)的相互作用、修飾、亞細胞定位等，揭示重要的調(diào)控途徑。獲得多種脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)功能異常的細胞株和動物模型等研究系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵蛋白質(zhì)與脂質(zhì)代謝各個水平的密切關(guān)系，闡明其相互作用、修飾、亞細胞定位等，揭示重要的調(diào)控途徑。建立脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)的功能與結(jié)構(gòu)域之間的關(guān)系，揭示其發(fā)揮作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和分子機制。第年系統(tǒng)地分析和研究脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白質(zhì)復(fù)合物動態(tài)變化過程中的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，鑒定新的相互作用蛋白。利用酵母雙雜交、GSTpull-down和免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜鑒定等方法，重點研究脂質(zhì)代謝調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子蛋白復(fù)合物（LXR、TR、SREBP）、脂質(zhì)合成與吸收的關(guān)鍵膜蛋白復(fù)合物（gp78、NPC1L1、ACAT）、脂質(zhì)貯存與運輸密切相關(guān)的蛋白復(fù)合物（Seipin、Acyl-CoA