菌種保藏方法

1、菌種保存方法常用有以下方法：1半固體保存法：將菌落穿刺接種在半固體中，4度存放，一般可以管3 6月2低溫凍存法：接種菌落的肉湯加20%滅菌甘油，置一20或一70度，可存放一年以上。3真空凍干法：試最理想的保存方法，但需要特殊儀器基因工程菌：1： 30%的滅菌甘油與培養(yǎng)好的菌懸液按照1： 1的比例混合，分裝到1.5ML的離心管中， 每關(guān)1ML，存于-20度，但僅保存半年就不太好了，最好保存到一一70度的低溫冰箱中。 也可用10%的滅菌甘油從斜面上洗下保存。2：菌懸液中加甘露醇和人血白蛋白目前菌種的保存方法主要有以下幾種:1.傳代培養(yǎng)保存法:一般來說，這是最基本的保存法,用 斜面，穿刺或其他方法培

2、養(yǎng)的傳代菌種，一般要保存在5度，但因類而異，如霍亂，淋球，腦膜炎, 厭氧菌，鉤體等要保存于37度為宜.2.液體石蠟覆蓋保存法:這是傳代培養(yǎng)的變相方法,可以適 當(dāng)?shù)匮娱L(zhǎng)保存時(shí)間，主要適用于霉菌,酵母菌，放線菌,需氧性細(xì)菌等的保存.3 .載體保存法/1) 土壤保存法:主要用于形成抱子回抱囊的微生物的保存，特別適用于真菌和放線菌不改變性狀 的長(zhǎng)期保存.(2)砂土保存法:常用于梭狀芽抱桿菌和一部分霉菌的保存，可保存數(shù)年.(3)硅膠 保存法:本法對(duì)保存鏈抱霉菌較有效，對(duì)酵母菌的保存也較有效(4)磁珠保存法:用本法保存根 瘤菌在室溫下至少可保存2年半(5)濾紙保存法:適用于對(duì)干燥抵抗力較強(qiáng)的微生物，如油芽

3、 抱細(xì)菌和葡萄球菌.另外噬菌體，放線菌和絲狀菌也可用本法.4.懸液保存法哆1)蒸溜水保存 法:霉菌，酵母菌和放線菌的大部分，使其懸浮于蒸餾水中，可在室溫下保存數(shù)年,青枯病假單抱 桿菌也可用本法.(2)糖液保存法:過去用于保存酵母菌，但現(xiàn)在已不常用.(3)其他懸液保存法: 如乳鏈球菌可用PBS保存，放線菌可用0.125%稀瓊脂液保存.5.寄主保存法:一些微生物如一 部分病毒，立克次氏體，螺旋體.原蟲和少量絲狀菌目前只能使活著的動(dòng)物，昆蟲，植物體和寄生 微生物等感染并傳代，否則不能保存.6.冷凍保存法噎1)低溫冰箱保存法:多說微生物在-20度 保存效果良好,(2)干冰保存法:-70度保存,(3)液

4、氮保存法:保存溫度克達(dá)到-196度，本法可說 是使用范圍最廣的微生物保存法.7.冷凍干燥保存法:使微生物在冷凍狀態(tài)下，在減壓下利用升 華現(xiàn)象除去水份，使細(xì)胞的生理活動(dòng)事實(shí)上停止，從而長(zhǎng)期維持生活狀態(tài)，本法適用于大多數(shù) 細(xì)菌和放線菌，另外病毒,噬菌體，立克次氏體，霉菌和酵母菌再多數(shù)情況下用本法保存.8.冷凍 干燥以外的干燥保存法唆1)常壓干燥保存法,(2)菌片封袋干燥保存法，(3)Stamp干燥保存 法,(4)Sordelli干燥保存法,(5)1-干燥保存法(真空干燥保存法)我們實(shí)驗(yàn)室保存菌種的方法是：1將菌落穿刺接種在半固體中，如加有瓊脂的肉湯培養(yǎng)基，4度存放，保存時(shí)間較短一般3 4月2接種菌

5、落的肉湯0.9ml加100%滅菌甘油0.1ml，置一20度冰箱中可以保存一年左右，一 70度冰箱或液氮中可放置N年，細(xì)胞的保存我們放了近十年，仍然復(fù)蘇的很好 3基因工程菌的保存：1：為防止基因工程菌質(zhì)粒丟失或不穩(wěn)定，保存菌種加入甘油的量應(yīng)該不大于10%，一般 0.9ml的菌液加0.1ml80%高壓滅菌甘油一70度冰箱保存菌種的保藏：菌種是一個(gè)國(guó)家所擁有的重要生物資源，菌種保藏(preservation)是一項(xiàng)重要的微生 物學(xué)基礎(chǔ)工作。菌種保藏機(jī)構(gòu)的任務(wù)是在廣泛收集實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)菌種、菌株(包括病毒株甚 至動(dòng)、植物細(xì)胞株和質(zhì)粒等)的基礎(chǔ)上，將它們妥善保藏，使之達(dá)到不死、不衰、不亂以及 便于研究、交

6、換和使用的目的。為此，在國(guó)際上一些工業(yè)較發(fā)達(dá)的國(guó)家中都設(shè)有相應(yīng)的菌種 保藏機(jī)構(gòu)。例如：中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)(CCCCM)，美國(guó)典型菌種保藏中心(ATCC)， 美國(guó)的“北部地區(qū)研究實(shí)驗(yàn)室”（NRRL），荷蘭的霉菌中心保藏所（CBS），英國(guó)的國(guó)家典型 菌種保藏所（NCTC），蘇聯(lián)的全蘇微生物保藏所（UCM）以及日本的大阪發(fā)酵研究所（IFO） 等都是有關(guān)國(guó)家有代表性的菌種保藏機(jī)構(gòu)。菌種保藏的具體方法很多，原理卻大同小異。首先要挑選典型菌種（typeculture）的優(yōu) 良純種，最好采用它們的休眠體（如分生抱子、芽抱等）；其次，還要?jiǎng)?chuàng)造一個(gè)適合其長(zhǎng)期 休眠的環(huán)境條件，諸如干燥、低溫、缺氧、避光、缺

7、乏營(yíng)養(yǎng)以及添加保護(hù)劑或酸度中和劑等。水分對(duì)生化反應(yīng)和一切生命活動(dòng)至關(guān)重要，因此，干燥尤其是深度干燥，在保藏中占有 首要地位就不言而喻了。五氧化二磷、無水氯化鈣和硅膠是良好的干燥劑，當(dāng)然，高度真空 還可同時(shí)達(dá)到驅(qū)氧和深度干燥的雙重目的。除水分外，低溫乃是保藏中的另一重要條件。微生物生長(zhǎng)的溫度低限約在-30 r，可是， 在水溶液中能進(jìn)行酶促反應(yīng)的溫度低限則在-140C左右。這或許就是為什么在有水分的條件 下，即使把微生物保藏在較低的溫度下，還是難以較長(zhǎng)期地保藏它們的一個(gè)主要原因。在低 溫保藏中，細(xì)胞體積較大者一般要比較小者對(duì)低溫更為敏感，而無細(xì)胞壁者則比有細(xì)胞壁者 敏感。其原因同低溫會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的水

8、分形成冰晶，從而引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)尤其是細(xì)胞膜的損傷有 關(guān)。如果放到低溫（不是一般冰箱）下進(jìn)行冷凍時(shí)，適當(dāng)采用速凍的方法，可因產(chǎn)生的冰晶 小而可減少對(duì)細(xì)胞的損傷。當(dāng)從低溫下移出并開始升溫時(shí)，冰晶又會(huì)長(zhǎng)大，故快速升溫也可 減少對(duì)細(xì)胞的損傷。當(dāng)然，不同微生物的最適冷凍速度和升溫速度也是不同的。例如，酵母 的冷凍速度以每分鐘10C為宜，而紅細(xì)胞則相應(yīng)地為2000C。冷凍時(shí)的介質(zhì)對(duì)細(xì)胞損傷與 否也有顯著的影響。例如，0.5mol/L左右的甘油或二甲亞砜可透入細(xì)胞，并通過降低強(qiáng)烈 的脫水作用而保護(hù)細(xì)胞；大分子物質(zhì)如糊精、血清白蛋白、脫脂牛奶或聚乙烯毗咯烷酮（PVP） 雖不能透入細(xì)胞，但可能是通過與細(xì)胞表面結(jié)合

9、的方式而防止細(xì)胞膜受凍傷。在實(shí)踐中，發(fā) 現(xiàn)用較低的溫度進(jìn)行保藏時(shí)效果更為理想，如液氮溫度（-195C）比干冰溫度（-70C）好， -70 C又比-20 C好，而-20 C則比4 C好。一種良好的保藏方法，首先應(yīng)能保持原菌的優(yōu)良性狀不變，同時(shí)還須考慮方法的通用性 和操作的簡(jiǎn)便性。具體的菌種保藏方法很多，其原理和應(yīng)用范圍各有側(cè)重，優(yōu)缺點(diǎn)也有所差 別，現(xiàn)將其歸納如下：*凡采用休眠態(tài)的微生物保藏時(shí)，不管用其中的何種方法，均可作常溫保藏，也可用低 溫保藏（如12, 4, 0，-2-75, -196C等）。一般溫度越低則保藏效果越好。如果同時(shí)采用 避光保存，則效果更佳。*在濕法保藏中，如采用覆蓋一層無菌石

10、蠟油，或試管口用橡皮塞密封等方法來隔絕氧 氣，則效果更好。*下劃?rùn)M線的方法，為最常用的保藏法。以上介紹的各種保藏法的有關(guān)技術(shù)細(xì)節(jié)可參閱專門參考書?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)室中最常用的五種 菌種保藏法的比較列于表8-13中。在我國(guó)，菌種保藏一般用三種方法進(jìn)行：固體培養(yǎng)基斜面上定期移植法（5C下保藏）； 石蠟油封藏法（室溫下保藏）；冷凍干燥保藏法（10C下保藏）。此外，對(duì)放線菌還另加砂 土法保藏，對(duì)絲狀真菌則另加麥麩皮法保藏等。在國(guó)際著名的美國(guó)ATCC （AmericanTypeCultureCollection）中，目前已改為僅采用兩種 最有效的方法，即保藏期一般達(dá)515年的冷凍干燥保藏法和保藏期一般達(dá)20年以上的液 氮保藏法，以達(dá)到最大限度地減少傳代次數(shù)和避免菌種衰退的目的（見圖840）。圖839中所表示的保藏原理