威尼德分子雜交儀：Western blot常見試驗問題歸納與總結(jié)

1、威尼德分子雜交儀：Western blot常見試驗問題歸納與總結(jié)威尼德生物科技（北京）,研發(fā)生產(chǎn)的經(jīng)濟型分子雜交儀VH-1000、 多功能型分子雜交儀VH-4000、組合型分子雜交儀VH-2000,底部標(biāo)配培養(yǎng)皿圓 周運動托盤，選配250ML/500ML錐形瓶托盤，96孔酶標(biāo)板托盤，可適用于如 放置雜交袋等其他嚴格要求的孵育實驗一以及膜洗脫和凝膠脫色，同時可以做 恒溫微生物培養(yǎng)。分子雜交儀是現(xiàn)代實驗室采用雜交技術(shù)的理想設(shè)備，可替代塑 料雜交袋和水浴搖床，并防止破損帶來的污染危害。QI: PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么？A1:一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián),假設(shè)反復(fù)洗

2、幾次后， 蛋白容易掉下來，效果較差。尼龍膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合（注: 常用的PVDF膜即帶正電荷的尼龍膜），同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣 的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，效果較好。Q2:做組織樣品的western blot的時候，處理樣品有什么訣竅？A2:必須進行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會更好，離心要充分，膜蛋 白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提（超速離心）。還有一 點就是組織中的蛋白酶活性更強，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入PMSF和蛋 白酶抑制劑），封閉劑一般5%脫脂奶粉。如果一抗為多克隆抗體，使用BSA也 是不錯的選擇Q3:免疫組化

3、和 Western blot可以用同一種抗體嗎？A3:免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表 位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮 后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會消失。如果 你所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗 體可同時用于免疫組化和Western blotting,而如果抗體識別構(gòu)象形表位，那么只能 用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區(qū)間。（限于 單抗）Q4:不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？ A4:可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液

4、中加入20%甲醇（是指終濃度）（優(yōu)化的轉(zhuǎn)移緩沖液， 可以參考蛋白質(zhì)技術(shù)手冊），因為甲醇可降低蛋白質(zhì)洗脫效率，但可增加蛋 白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延 長轉(zhuǎn)移時間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.l%SDS,也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu) 質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交聯(lián)；低濃度膠, 如低至6%。太大時還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉(zhuǎn)移電壓/電流；增加轉(zhuǎn)移時 間。威尼德生物科技（北京）,研發(fā)生產(chǎn)的經(jīng)濟型分子雜交儀VH-1000、 多功能型分子雜交儀VH-4000、組合型分子雜交儀VH-2000,底部標(biāo)配培養(yǎng)皿圓 周運動托盤，選配250ML/

5、500ML錐形瓶托盤，96孔酶標(biāo)板托盤，可適用于如 放置雜交袋等其他嚴格要求的孵育實驗一以及膜洗脫和凝膠脫色，同時可以做 恒溫微生物培養(yǎng)。分子雜交儀是現(xiàn)代實驗室采用雜交技術(shù)的理想設(shè)備，可替代塑 料雜交袋和水浴搖床，并防止破損帶來的污染危害。Q5:Western blot哪種染色好？A5:（l）陰離子染料是最常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測極限可達 到1.5解，考馬斯亮藍雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春 紅S和快綠在檢測后容易從蛋白質(zhì)中除去，以便進行隨后的氨基酸分析。缺點是: 溶劑系統(tǒng)的甲醇會引起硝化纖維素膜的皺縮或破壞，不能用于帶正電荷的膜。靈 敏度低。（2）膠體金，

6、靈敏度高，檢測范圍可到pg級，但染色比擬穩(wěn)定。（3）生物素化靈敏度位于1、2之間，可用于任何一種膜。6:用Western檢測基因轉(zhuǎn)染后細胞培養(yǎng)上清中表達的目的蛋白（定性）, 分子量為20KD,濃度約為幾百iiRml。蛋白樣品是否需濃縮、純化？如何濃縮、 純化上清液中的目的蛋白？對小分子蛋白Western blot時需特別注意哪些條件？A6：按照提供的濃度，如果做Western blot,是不用濃縮樣品的.對于20kd的小 分子的蛋白，Western Blot中要注意的是：轉(zhuǎn)移時的時間，轉(zhuǎn)移時的電流或電壓.transfer buffer 中加 20%的甲醇.可以用13-15%的別離膠.Q7:半干

7、法轉(zhuǎn)移與膠的面積和蛋白分子兩大小有一定關(guān)系、那么濕法轉(zhuǎn)移 是不是所有的轉(zhuǎn)移條件都一樣呢？ 一般的條件是怎樣的？A7：半干轉(zhuǎn)的電流大小是按照面積來算的，時間是根據(jù)蛋白分子大小定的；而 濕轉(zhuǎn)的話電流是恒定的，時間也是根據(jù)分子量而定。Q8:采用生物素標(biāo)記的二抗.SABCDAB檢測系統(tǒng)做western,非特異性的條帶和背景很高，總蛋白考染的時候發(fā)現(xiàn)接近積層膠的條帶比擬清楚，條帶也 很窄，可是越靠下面的條帶越來越寬，有的跑得都連在一起，這是什么原因， 如何解決？ SDSPAGE的時候恒壓和恒流哪個好？A8：非特異性的條帶和背景高：可能性很多，如一抗，二抗，封閉的原因都可 能?？偟鞍卓既镜臅r候發(fā)現(xiàn)接近積層

8、膠的條帶比擬清楚，條帶也很窄，可是越靠 下面的條帶越來越寬，有的跑得都連在一起，這種現(xiàn)象是正常的。另外，也可能 積層膠有問題。SDSPAGE的時候，恒壓和恒流都可以用。威尼德生物科技（北京）,研發(fā)生產(chǎn)的經(jīng)濟型分子雜交儀VH-1000、 多功能型分子雜交儀VH-4000、組合型分子雜交儀VH-2000,底部標(biāo)配培養(yǎng)皿圓 周運動托盤，選配250ML/500ML錐形瓶托盤，96孔酶標(biāo)板托盤，可適用于如 放置雜交袋等其他嚴格要求的孵育實驗一以及膜洗脫和凝膠脫色，同時可以做 恒溫微生物培養(yǎng)。分子雜交儀是現(xiàn)代實驗室采用雜交技術(shù)的理想設(shè)備，可替代塑 料雜交袋和水浴搖床，并防止破損帶來的污染危害。VH-200

9、0 -、g 。9:血清樣品進行 Western blot分析，目的蛋白21kD,結(jié)果顯色出來后, 目的條帶很淡，而白蛋白和及G條帶很濃，為什么？A9：可能是因為白蛋白為67kD和目的蛋白相差較大，且其濃度較低，可以底物二氨基聯(lián)苯胺和0.01%過氧化氫溶液顯色的時間延長為30分鐘，再用去離子水 漂洗以終止反響；也可能是抗體的特異性不好。把封閉的時間延長，同時提高封 閉液的濃度，可以減少以下背景噪音。同時洗的時候要徹底，而目的條帶弱，說 明濃度缺乏，如果不考慮后續(xù)功能的話，可過G-50 （細）柱子，純化靶蛋白, 接著真空冷凍濃縮，可以得到很好的結(jié)果。Western轉(zhuǎn)膜已經(jīng)成功了，但是Marker泳道未見蛋白條帶，其余各泳道均有清晰的蛋白條帶，經(jīng)考馬斯亮藍染膠，結(jié)果相同。經(jīng)5%的脫脂牛奶封閉1小時45分鐘后，進行一抗孵育（1： 200,建議起始濃度）過夜，二抗孵育5個半小時（1:2000）,均在室溫下，DAB顯色，雖出現(xiàn)蛋白條帶，但較弱，且出 現(xiàn)非特異性條帶。所用 Marker可別離14U16KD的蛋白，是否因為 marker有問題？ 一抗（多克隆抗體）、二抗的濃度及孵育的時間是否合適？封閉的時間是 否太短？A10： 1