基因工程常用的工具酶課件

1、第二章 基因工程常用的工具酶第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶隘販盜琴知拒熟疤謙齲鰓燙點(diǎn)卓很清佑矽辦斜抄羚割苔泣憋昂婁齡成痙嬌第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶：簡(jiǎn)稱限制酶。是一類能識(shí)別雙鏈DNA分子中某種特定的核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶 20世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)： 噬菌體 E.coli B PFU10-4 E.coli B PFU1噬菌體DNA被降解DNA被修飾E.coli B限制性核酸內(nèi)切酶：降解外來(lái)DNA 防御修飾酶：DNA甲基化 保護(hù)寄主細(xì)胞控制的限制與修飾系統(tǒng)（R/M體系）！能維抱嶺簧脹獰咕傍霞如藤層木膛敘溪關(guān)藏靶歐拋浸潘瑪遼樓惕轅崩騙初第

2、二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶一、限制酶的種類限制修飾活性酶蛋白結(jié)構(gòu)相對(duì)分子質(zhì)量切割位點(diǎn)切割作用輔助因子實(shí)用性代表型酶 型酶 型酶同時(shí)存在 單獨(dú)存在 同時(shí)存在多亞基結(jié)構(gòu) 單亞基結(jié)構(gòu) 兩個(gè)亞基 30萬(wàn)dal 2-10萬(wàn)dal 、之間 與識(shí)別位點(diǎn)不一致 與識(shí)別位點(diǎn)一致 與識(shí)別位點(diǎn)不一致 Mg2+、ATP、SAM Mg2+ Mg2+、 SAM 低 高 低 EcoK、EcoB Hind EcoP醛巳娃谷院蚊府駭鼎癢峙挎刻索培制遁指棘添擰某渙崎獄廢槐盞跳焙摯臃第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶二、限制酶的命名命名原則限制酶寄主微生物屬名頭字母（大寫）和種名前兩字母（

3、小寫）表示寄主物種菌株名位于其后 羅馬數(shù)字表示同一寄主菌株的不同限制修飾系統(tǒng) Haemophilus influenzae d Hind、 Hind、 Hind 屬名 種名 株名 不同限制修飾系統(tǒng) 悸剛盯韋劍菌穎隴增敝盟待嚏排成訓(xùn)島峪怠球腑蹈玄接謾睛瘓萬(wàn)狗疑妹征第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶三、型限制酶的特性-識(shí)別序列識(shí)別雙鏈DNA分子中特定的4 - 8對(duì)核苷酸序列5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5EcoR I的識(shí)別序列EcoR I的切割位點(diǎn)5 G A G G C C G A G 33 C T C

4、C G G C T C 5Hae的識(shí)別序列Hae 的切割位點(diǎn)樊洶謊怎集鉸撿楓俐冤碴枕濘唆侗狂范廁跺裹懲葦幟婆伯拔埋儀涪郴孝彤第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè)部分限制酶能識(shí)別多種核苷酸序列5 G C G T Py Pu A C G A G 33 C G C A Pu Py T G C T C 5Hind的識(shí)別序列Py dCMP、dTMPPu dAMP、dGMP蝸錠弦培矽漬彪詢陸癬鄂坷枯漣墅膽挖疚肝怯攘脫夜咳恩蜒峰最仇睡趁辦第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶識(shí)別序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱型回文結(jié)構(gòu)5 G C T G A A T

5、T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5EcoR I的識(shí)別序列EcoR I的切割位點(diǎn)回文結(jié)構(gòu):兩條核苷酸鏈的核酸序列呈雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱排列的 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)霄儀諒拯碳漓扼盧孩揍弟譽(yù)任棵仙練鑒望奎阻醉蕭講檀恐瑩考拾膀銷腫痘第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶三、型限制酶的特性-切割后形成的末端粘性末端：5 GTGAATTCGA 33 CACTTAAGCT 5EcoR I5 GTG AATTCGA 33 CACTTAA GCT 5平齊末端：5 GAGGCCGAG 33 CTCCGGCTC 55 GAGG CCGAG 33 CTCC GGCTC 5H

6、ae彼此具有互補(bǔ)核苷酸的單鏈延伸末端野梅緞突輩禿選適喜椎琶遙赫找筏啞誦卑掏攙掩背排肌噶峨蛆拖妓重拼場(chǎng)第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶三、型限制酶的特性-同尾酶、同裂酶同尾酶:來(lái)源各異、識(shí)別序列也不相同，但都產(chǎn)生相同粘性 末端的一類限制酶5 GTGGATCCGA 33 CACCTAGGCT 5BamH I5 GTG GATCCGA 33 CACCTAG GCT 55 GTTGATCAGA 33 CAACTAGTCT 5 Bcl I5 GTT GATCAGA 33 CAACTAG TCT 5BamHI、 BclI為一組同尾酶攪搶淄途但盔殲抿郭鹼謠墟斡腋錳價(jià)磨殉玄扁銳釋澎份知聚庸

7、到硼剖上朽第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶同裂酶:來(lái)源各異，但識(shí)別相同核酸序列的一類酶5 GTGATCGA 33 CACTAGCT 5Sau3A I5 GAGATCCA 33 CTCTAGGT 5MboI5 GTCCCGGGGA 33 CAGGGCCCCT 5XmaI5 GTCCCGGGGA 33 CAGGGCCCCT 5SmaI虛梁屑哺咱浮坷氟敬慌瘁透栽豎鐳爆餅碎曠厭豹坦杯源授呈溉偏輩竟色芯第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶四、影響限制酶活性的因素DNA的純度：蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、EDTA、SDS增加限制酶用量擴(kuò)大酶催化反應(yīng)體系延長(zhǎng)酶催化時(shí)間DNA的甲基

8、化程度：反應(yīng)溫度：DNA的分子結(jié)構(gòu)：酶緩沖液組成：甘油濃度：MgCl2：NaCl/KCl：Tris-HCl：-巰基乙醇/二硫蘇糖醇（DTT）：牛血清白蛋白（BSA）：仟制噬翹摳盡痔擱墑柬內(nèi)咱樂(lè)統(tǒng)胖?jǐn)P黃所費(fèi)頻臂糙倉(cāng)抵字剎孝懸房磚棠枕第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶第二節(jié) DNA連接酶剖討瞎乾瑩昔偶豈蠟各振春卿婉盤倪爍槽閻香靶兼鍋栗維試丁裔剿爪膩僑第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶 DNA連接酶：能夠催化雙鏈DNA片段相鄰的3羥基與5磷酸基形成磷酸二酯鍵的酶作用特點(diǎn)只能連接雙螺旋DNA分子，不能連接單鏈DNA分子；DNA鏈上必須具有游離的3-OH和5-P；只能

9、封閉DNA鏈上磷酸二酯鍵切口，不能封閉多個(gè)核酸分子缺失形成 的裂口；需要吸能：ATP/NAD+連接方式缺口DNA:平齊末端DNA：粘性末端DNA：5533OHP5533OHPPOH5533偏芳郭榜拘隕潑邊獲橙懸尼磕黃清芳澤番銅薯錯(cuò)份詞迭讕蕪砂蓉刃則授痕第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶基因工程中常用的連接酶T4噬菌體DNA連接酶（T4連接酶）大腸桿菌DNA連接酶熱穩(wěn)定性DNA連接酶稼泥孵瞻泛箭向蛆咕墜忠淑賀畝鴿斷浦轎運(yùn)涎摳?jìng)H臆墟渣攘升贖驟蕾庫(kù)制第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶第三節(jié) DNA聚合酶搭鏈弄半盤用布盂詳幾奉抑雜暖輩滇掃工綱割診斜臣瓦譯匈褲訃燭箕乞

10、瘟第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶 DNA聚合酶：能夠催化DNA復(fù)制和修復(fù)DNA分子損傷的一類酶作用特點(diǎn) 能夠把脫氧核苷酸分子連續(xù)的加到DNA分子引物鏈的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用條件脫氧核苷酸原料：四種脫氧核苷三磷酸dNTP（dATP、dTTP、 dCTP、dGTP）引物鏈：帶有3-OH游離基團(tuán)模板：?jiǎn)捂溁螂p鏈DNA模板Mg2+：降聽(tīng)彬辣俏渙搬蜜序桓居基寅怖即酣乘洋歧取據(jù)磅荔換苦封切詛蚤旦熄幽第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶一、大腸桿菌DNA聚合酶 （ DNA pol I ）酶特性：53聚合酶活性53核酸外切酶活性3 5核酸外切酶活性3 G-C

11、-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5dNTP Mg2+DNA pol I3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 55 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH5 C-G-A-G-T-OH溝赫奄缽杭渝吶琵穗舟罷鬧樓朱紉富誣瞬蠕靈色粱曬揮鞏饋蹈具題疇矢鈴第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶切口平移反應(yīng)（Nick translation）用途：制備32P標(biāo)記的DNA探針53核酸外切酶活性5 3核酸聚合酶活性5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C A-G-C

12、-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 DNase IDNA pol IMg2+ dNTP a-32P-dATP王嘯窖吮簍妖往雁嗡胚白餒褥糜補(bǔ)使壘獲錦咱米每俗咸并鈾匡貪看劣碑創(chuàng)第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶二、Klenow大片段酶DNA聚合酶一個(gè)片段： 53核酸外切酶活性另一個(gè)片段： 53聚合酶活性、 3 5 核酸外切酶活性枯草桿菌蛋白酶Klenow大片段酶Klenow大片段酶特性：53聚合酶活性 3 5 核

13、酸外切酶活性遲煮塘菌講遵吹沾穩(wěn)仆闖堆弧閩奢茨輸福記陽(yáng)翁戍禾畔誤狽它若了氫姨箋第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶Klenow大片段酶用途：補(bǔ)平限制酶切割DNA后產(chǎn)生的粘性末端5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 KlenowdATP dTTP5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5 雷仟繩抉坯肥巢裕注氓康又原顱旅搶錄冤走效盛蘊(yùn)駛炒黃濘失諧蹋費(fèi)諾勘第二章基因工程常用的工具

14、酶第二章基因工程常用的工具酶用32PdNTP對(duì)3凹端進(jìn)行末端同位素標(biāo)記5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 Klenowa-32P-pppdA dTTP5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5 揀朱侯苯非棵既攢哺薛炎勢(shì)落奎慕攀孺奠薊仗痙泄侍踴湊祿坷芥紛秸力蕭第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶cDNA克隆中，合成cDNA第二鏈應(yīng)用sanger雙脫氧末端中止法進(jìn)行DNA測(cè)

15、序寅駝華奸寄素紋獺蝎寅壓布榔孺漳苯饅夸湯啊貫筑設(shè)株依途鳳壁鈾扼米樣第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶三、TagDNA聚合酶來(lái)源嗜熱水生棲熱菌酶特性53聚合酶活性、 3 5 核酸外切酶活性耐高溫：7580應(yīng)用：PCR技術(shù)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）槽骨蚌月青宿諾侯慢佃若酸淳邱鞋敖碟榆腑民粥傘畸徑逢劊皆潮趙箋雞鋪第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶PCR技術(shù)基本原理：類似于細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程基本步驟(c)(b)引物2533355(d)新引物53靶DNA的擴(kuò)增(a)53引物13 535引物2互補(bǔ)鏈引物1互補(bǔ)鏈單位長(zhǎng)度的鏈不同長(zhǎng)度的鏈5335引物1互補(bǔ)鏈引物2互補(bǔ)鏈目的片段（

16、不同長(zhǎng)度的鏈未示出）PCR反應(yīng)示意圖(e)(f)(g)逝淖節(jié)搶幕續(xù)灌喇致剩蠅漬意銻驗(yàn)碰床緊瑪幼孵郡童嶄蛋嘻酪圃麗謄憎逆第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶94變性（1min）60 退火（1min）72 延伸（1.5min）溫度（）時(shí)間（min）947260循環(huán)1 循環(huán)2 循環(huán)3PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期漸技顆凹菠頗蔫謾摸邏屬舟衰肢氛勝執(zhí)哀脾燎茂七戍逞苞捅跑忌翅橇麗囪第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶特點(diǎn)待擴(kuò)增的DNA鏈限定在模板上的退火位點(diǎn)之間待擴(kuò)增DNA鏈得到迅速大量擴(kuò)增反應(yīng)體系組成影響因素模板dNTPDNA聚合酶引物A、BMgCl2引物的設(shè)計(jì)退火溫度MgCl

17、2濃度腳碉啊晃瘩貪雞奢琉于懾篡雨押番胚選矢拳橡憊噶呆鹼醒淋碩稼謊值發(fā)箕第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶第四節(jié) DNA修飾酶操煤絆共宋艘隱螢魯敦摔葦廄此舉洱弓榴揀西卻豪釩挨防朔渴息蚜再剃雪第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶（TDT）：在沒(méi)有模板存在的條件下，能催化 dNTP隨機(jī)加于DNA分子的3-OH端5 p3 HOOH 3 p 5 TDTMg2+ dATPAAAAAAAAAAAA OH 3 5 p3 HOp 5 同聚物尾巴 Poly（dA）疽讕腿撂匹費(fèi)冀驟痔扯形美幼罪括自寶劃抨鎢嘔認(rèn)螞搓惋葵氧梭報(bào)臘劣蔽第二章基因工程常用的

18、工具酶第二章基因工程常用的工具酶作用底物：帶3-OH末端的單鏈DNA5 pOH 3 TDTMg2+ dATPAAAAAAAAAAAA OH 3 5 p戒繪疲羨練姿吻粘括孩喻褥餃胞氈割勘拔庸鹵僻挾戮荷冷粉澎非次喇絆爍第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶帶3-OH單鏈突出末端的雙鏈DNA5 p3 HOOH 3 p 5 TDTMg2+ dATP5 p3HOAAAAAAAAAAAAAA OH3 p 5 帶3-OH平齊末端的雙鏈DNA5 p3 HOOH 3 p 5 TDTCo2+ dATP5 p3 HO AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 卑池浪集權(quán)罵刺艦蹲頻漬蛔字酒牙舵空醇高柄郡笆矯嫁燈質(zhì)和荷已褥櫥己第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶用途：外源DNA與載體的重組DNA片段3端標(biāo)記藻獵濺閑咆喧邱觀諱核句脈會(huì)楞捕椅玩內(nèi)澡績(jī)?nèi)梯浬堪_積拿蜀猿河恨嫂兩第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶二、堿性磷酸酶細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP）：來(lái)自E.coli小牛腸堿性磷酸酶（CIP）：來(lái)自小牛腸作用：催化核酸分子脫去5-P5 pOH 3 DNA or RNA5 ppp dNTP5 pppNTPBAP / CIPOH 3 5 HO5 HO dNTP5 HO NTP用途：防止載體自身環(huán)化5端標(biāo)記時(shí)去磷酸化塘葛桔桃勘氧徐蝴啞