2×CTAB法植物總DNA提取

1、2XCTAB法植物總DNA提取液氮研磨1g左右的植物組織，轉(zhuǎn)移到離心管中。改用研磨槍在冰上研磨，不加B-巰基乙醇研磨時(shí)可加入適量的PVP、B-巰基乙醇。若CTAB準(zhǔn)備2-3天內(nèi)用完，則可將PVP、B-巰基乙醇直接加入其中。C：TABPVP|3-mere0.5ml0.02&2.515nil0.2?20mlo.sg100pl加入500卩1的2*CTAB(60C或65C預(yù)熱)，顛倒混合均勻后在60C或65C水浴30m-lh小時(shí),其間要上下顛倒混勻數(shù)次。3取出離心管，加入等體積的24：1(三氯甲烷：異戊醇)，上下顛倒充分混合。若量多，則可以直接側(cè)立于搖床上晃動(dòng)10分鐘。4.12000轉(zhuǎn)速離心5-10m

2、in。將離心管動(dòng)作輕緩的取出轉(zhuǎn)子，放置于離心管架上。離心后溶液分三層：上層為水相；中層為碎片和蛋白相；底層為氯仿迅速進(jìn)入下一步，以免各相混合5用移液槍吸取管中上層水相，動(dòng)作一定要輕緩，不可攪動(dòng)其它兩層。此步驟要寧舍不貪多，盡量避免吸取到下層液體。若上步驟中中間層較厚，則繼續(xù)加入等體積24：1，再次抽提一次，直至中間層較薄。在抽提出的水相中加入1/3體積的5M的KAc及等體積的異丙醇(4C預(yù)冷)，輕輕晃動(dòng)混合均勻后在-20C沉淀。沉淀至少15分鐘至過夜。6-1在抽提出的水相中加入1/10體積醋酸鈉(pH5.2,3M)，混勻后，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，-20C沉淀15min至過夜。6-3.在抽

3、提出的水相中加入加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，-20C沉淀15分鐘至過夜。a.時(shí)間越長(zhǎng)，DNA的產(chǎn)量越多，污染也越多12000轉(zhuǎn)速離心5-10min,去上清，倒置于吸水紙上數(shù)分鐘，加入700卩170%的酒精，上下顛倒數(shù)次，洗滌沉淀。12000轉(zhuǎn)離心5-10m，去上清，倒置于吸水紙上數(shù)分鐘。重復(fù)一遍。12000轉(zhuǎn)速離心5-10min，去上清，倒置于吸水紙上數(shù)分鐘，最后置于超凈工作臺(tái)中吹干。在離心管中加入30-50卩1的滅菌去離子水或者TE溶液，4C放置數(shù)小時(shí)，使其充分溶解。用瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果。-20C70C低溫保存。去除總DNA中的RNA污染先做預(yù)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，若RNE污染無嚴(yán)重影響則舍去該步驟A在

4、總DNA溶液中加入滅菌去離子水或者TE溶液調(diào)整總體積至200卩1,加入10卩RNase-A(10mg/ml)4C過夜，或者37C1h.用等體積的24：1抽提。沉淀DNA洗滌DNA干燥DNA溶解DNA20C70C低溫保存。B直接加入10卩RNase-A(10mg/ml)后冷凍保存。試劑配方IMTris-HCl(pH7.4,7.6,8.0)pH濃HClTris去離子水7.4約70ml121.1g定容至1升7.6約60ml121.1g定容至1升8.0約42ml121.1g定容至1升高溫高壓滅菌后，室溫保存注意：應(yīng)該在溶液冷卻至室溫后再調(diào)定pH值，因?yàn)門ris溶液的pH值隨溫度的變化差異很大，溫度每升

5、高1C,溶液的pH大約降低0.03個(gè)單位5XTBE緩沖液Tris硼酸0.5MEDTA(pH8.0)去離子水54g27.5g20ml定容至1L室溫保存50XTAE緩沖液Tris冰乙酸0.5MEDTA(pH8.0)去離子水242g57.1ml100ml定容至1L室溫保存2XCTAB成分終濃度已有溶液濃度配100ml所加量CTAB2%2gTris-HCl(pH8.0)100mM1M10mlEDTA20mM0.5M4mlNaCl1.4M5M28ml0.5MEDTA(pH8.0)二水乙二胺四乙酸二鈉Na2EDTA2H2ONaOH去離子水186.1g約20克定容至1L高溫高壓滅菌，室溫保存。注：只有pH值

6、接近8.0時(shí)，EDTA才能完全溶解。溶解過程可在磁力攪拌器上劇烈攪拌。耗材準(zhǔn)備：需要滅菌者：1.5ml離心管、研磨槍頭、藍(lán)色槍頭、黃色槍頭、其他：衛(wèi)生紙（吸水用）、鑷子、封口膜、挑菌針、酒精燈、70%酒精、離心管架子、離心管盒子、移液槍。CTAB法提取植物基因組藥品：2*CTAB終濃度組分藥品用量0.1M/L20nM/L1MTris-HCl(pH8.0)0.5MEDTA(pH8.0)NaClCTABPVP40100ml40ml82g20g20g加去離子水800ml充分溶解定容到IL。120C1.5個(gè)大氣壓，滅菌20分鐘用之前加0.2-1%的0.5MEDTA(pH8.0)配制量：1L配制方法：稱

7、取186.1gNa2EDTA2H2O，置于1L燒杯中。加入約800mL的去離子水，充分?jǐn)嚢?。用NaOH調(diào)節(jié)pH值值8.0(約20gNaOH)。注意：pH值至8.0時(shí)，EDTA才能完全溶解。加去離子水將溶液定容至1L。適量分成小份后，高溫高壓滅菌。室溫保存1MTris-HCl(pH8.0)氯仿：異戊醇24:1異丙醇流程1、研缽預(yù)冷，葉片放入研缽，加液氮，研磨成粉末，用小勺放入2.0mlEP管。2、加入65C預(yù)熱的2*CTAB600ul,搖勻；3、65C水浴1小時(shí)，lOmin搖動(dòng)一次4、12000rpm離心10min,取上清到一新的EP管中。(次步驟視情況可省略)5、加入200ul氯仿：異戊醇(2

8、4:1)。6、12000rpm離心10min,取上層水相到一新的EP管中。7、加入等體積的異丙醇，輕輕上下?lián)u動(dòng)10次，靜置10min。8、12000rpm離心10min,棄上清9、加入75%乙醇1.0ml,搖動(dòng)10、12000rpm離心2min,棄上清11、吸取多余乙醇，室溫吹干12、加入50ul的ddH2O,或TE溶解。-20C保存CTAB法提取植物基因組DNACTAB法原理CTAB(Cetyltrimethylammoniumbromide)，十六烷基三甲基溴化銨，是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，能與核酸形成復(fù)合物，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸的特性。當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度(0.3

9、mol/LNaCl)時(shí)，CTAB-核酸的復(fù)合物從溶液中沉淀，通過離心就可將其與蛋白，多糖類物質(zhì)分開，在經(jīng)過有機(jī)溶劑抽提,去除蛋白，多糖，酚類等雜質(zhì)。最后通過乙醇或異丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或異丙醇而除去在高離子強(qiáng)度的溶液中(0.7mol/LNaCl)，CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，不能沉淀核酸。CTAB溶液在低于15C時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此，在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15C。另外，它還能保護(hù)DNA不受內(nèi)源核酸酶的降解。主要試劑與溶液的配制：PVP(聚乙烯吡咯烷酮K30)巰基乙醇氯仿：異戊醇(24:1)異丙醇70%乙醇Tris-苯酚RNaseA無水

10、乙醇CTAB溶液：CTAB20g/LNaCl(58.44)1.4mol/L(81.816g)EDTA(292.25)10mmol/L(2.9225g)Tris(121.14)100mmol/L(12.114g)pH8.01XTE緩沖液：EDTA(292.25)1mmol/L(0.29225g)Tris(121.14)10mmol/L(1.2114g)pH8.0NaAC溶液：NaAC(82.03)3mol/L(246.09g)pH4.0植物總DNA的提取1、取適量甘薯新鮮葉片，用液氮迅速研磨，中間加PVP(聚乙烯吡咯烷酮K30)少許，成粉末后轉(zhuǎn)入10mL的離心管中，放入液氮或-80C冰箱儲(chǔ)存(在

11、研磨樣品時(shí)，研的細(xì)和研的粗，提出的DNA量可以相差幾倍，所以，在液氮保護(hù)的很好的情況下盡量多研磨幾次)。2、將(200ml)CTAB溶液放于65C水浴鍋中預(yù)熱。3、力Mml巰基乙醇到預(yù)熱的200mlCTAB中。4、速口3ml預(yù)熱的CTAB到裝有粉末的10mL離心管中，之后放入65C水浴鍋中，保溫3060min,期間輕搖數(shù)次（一般20min左右一次，剛投入水浴時(shí)可以稍快速的晃動(dòng)，之后的晃動(dòng)一定要輕柔）。5、加入34ml氯仿：異戊醇（24:1）（在通風(fēng)櫥中操作），輕搖混勻至乳白色（100200次，劇烈晃動(dòng)會(huì)使DNA機(jī)械切割）。6、1520C,11000rpm離心15min（CTAB配平，相對(duì)應(yīng)的離

12、心管，質(zhì)量相差0.7mol/LNaCl)，CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方Tris-HCl(pH8.0)提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，在于液相中；CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；卩-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；

13、同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。用酚抽提細(xì)胞DNA時(shí)，有什么作用？使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時(shí)，由于蛋白與DNA聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的優(yōu)點(diǎn)：1有效變性蛋白質(zhì)；2抑制了DNase的降解作用。缺點(diǎn)：1.能溶解10-15%的水，從而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺點(diǎn)；加速有機(jī)相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。(酚易溶于氯仿中)用酚-氯仿抽提細(xì)胞基因組DNA時(shí)，通常要在酚-氯仿中加少許異戊醇，為什么？異

14、戊醇：減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。用乙醇沉淀DNA時(shí)，為什么加入單價(jià)的陽離子?用乙醇沉淀DNA時(shí)，通常要在溶液中加入單價(jià)的陽離子，如NaCl或NaAc,Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀。簡(jiǎn)言之，無論哪種抽提方法，藥品的作用基本都是一樣的。CTAB法原理(植物DNA提取經(jīng)典方法)發(fā)布：2010-06-0208:20|來源:生物吧|編輯:劉浩|查看：634次原理：CTAB(hexadecyltrimeth

15、ylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化銨)，是一種陽離子去污劑,具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶液中(0.7mol/LNaCl),CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。注：CTAB溶液在低于15C時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此，在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15C。一、CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方：Tris-HCl(pH8.0)提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個(gè)高

16、鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；B-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除。二、CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方：PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖；蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性(SDS、異硫氰酸胍等)高鹽洗滌蛋白酶處理核酸分離，純(2)DNA降解，DNA提取常見問題。實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少，破壁或裂解不充分，吸附或沉淀不完全，洗化；多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5MNa

17、CI，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500pLDNA液中加入200川20%PEG8000(含1.2MNaCI)，冰浴20min.核酸分離，純化；多酚的去除:在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：B-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合；鹽離子的去除：70%的乙醇洗滌核酸吸附,沉淀和溶解使用合適的吸附材料吸附核酸，其它的雜質(zhì)均被洗掉，達(dá)到純化DN

18、A的目的另一種方式加入1/10體積的NaAc(pH5.2,3M)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后應(yīng)用70%的乙醇洗滌，以除去鹽離子等若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解。三、基因組DNA提取常見問題DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)。DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)，DNA中殘留有金屬離子，有RNA的存留。對(duì)策：重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)，重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)，增加70%乙醇洗滌的次數(shù)(2-3次)，加入RNase降解RNA。(1)DNA樣品不純，抑制

19、后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。DNA提取常見問題：材料不新鮮或反復(fù)凍融、未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性、提取過程操作過于劇烈，DNA被機(jī)械打斷，外源核酸酶污染反復(fù)凍融。盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融，液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液。在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的含量，細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔。所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌。將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融。滌時(shí)DNA丟失。盡量選用新鮮（幼嫩）的材料，動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；G+菌，酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁。高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)（對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞，細(xì)菌可增加PK的用量）

20、。增加吸附的時(shí)間、或低溫沉淀小心操作。要用冰凍材料提出高質(zhì)量的基因組DNA,應(yīng)確保以下幾點(diǎn)：確保采樣后立即投入液氮中保存.在磨樣時(shí)一定要一直使材料處于低溫狀態(tài)。研磨前先將液氮倒入研缽，研缽徹底冷卻后，再放入材料，研磨過程中，一定不要讓液氮揮發(fā)凈使材料回溫！否則會(huì)DNA降解得很厲害。裝管的時(shí)候，材料一定要有液氮的保護(hù)才行!否則研磨時(shí)的液氮保護(hù)DNA不都前功盡棄了？可以這樣做：將幾個(gè)離心管放入一個(gè)容器，向容器中加液氮，將其冷凍一下，使之處于低溫狀態(tài)，將液氮還為揮發(fā)干凈的材料放入管內(nèi)，不要急著蓋蓋子，因?yàn)橐旱粨]發(fā)干凈就蓋上會(huì)再次彈開。將離心管放入盛有液氮的容器，等管內(nèi)的液氮揮發(fā)干凈蓋上蓋子即可。另

21、外，如果是在離心管上編號(hào)，最好在冷凍前寫好，否則離心管冷凍后材料會(huì)受影響不說，也很難寫上。提取DNA時(shí)加液氮的目的主要是防止DNA的降解，所以必須一直提醒自己，減少材料回溫的機(jī)會(huì)，液氮保護(hù)必須自始至終。3在用CTAB法提取時(shí)，剛投入水浴時(shí)可以稍快速的晃動(dòng)，之后的晃動(dòng)一定要輕柔！加酚/氯仿/異戊醇靜置30min后，離心溫度不可過低。盡量保持在15度以上。將DNA加入異丙醇析出時(shí)用的槍頭一定要剪過的。這點(diǎn)很重要。過尖的槍頭會(huì)把DNA鏈弄斷。加入異丙醇后出現(xiàn)的DNA絮狀物盡量要挑出，盡量不要離心，因?yàn)殡x心后雖然產(chǎn)量會(huì)增大，但是不完整的DNA也增多了。另外，看樓主的電泳圖條帶比較弱，看來不只是降解，提

22、取量也比較少。這里對(duì)于增加提取量想說明一點(diǎn)，在研磨樣品時(shí)，研得細(xì)和研得很細(xì)，提出的DNA量可以相差幾倍！所以，在液氮保護(hù)的很好的情況下多研磨幾次，要比在后面的過程中離心以增加產(chǎn)量要?jiǎng)澋脕恚≈饕噭┑呐渲茀⒖迹溃┧_姆布魯克（Sambrook,J.）等.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（下冊(cè)）配置如下94：（1）0.5mol/LEDTA（pH8.0）：稱取EDTA-Na218.61g，力口80mL雙蒸水，磁力攪拌器上劇烈攪拌。加入7mL10mo1/LNaOH調(diào)至pH8.0再用雙蒸水定容到100mL，在1.03X105Pa下高壓滅菌20min。（2）5mol/LNaC1溶液：稱取NaCl29.22g，溶解于90m

23、L的雙蒸水，加熱到80C溶解，冷卻，再用雙蒸水定容100mL,在高壓滅菌20min。（3）10mol/LNaOH溶液：稱取40.00gNaOH溶于80mL的雙蒸水，攪拌，定容到100mL。1mol/LTris-HCl溶液(pH8.0)：稱取12.114gTris堿，溶于80mL的雙蒸水,加入濃HC14.2mL,調(diào)整PH值到8.0,加水定容到100mL,高壓滅菌20min。10%CTAB(m/v)：稱取CTAB10.00g，溶解于80mL的雙蒸水，加熱促進(jìn)溶解，加雙蒸水定容到100mL,室溫保存。5mo1/LKAc溶液(pH4.8和6.5):分別稱取KAc晶體49.07g,溶于80mL的雙蒸水，

24、再用冰乙酸調(diào)至pH4.8和6.5,加雙蒸水定容到100mL,在1.03X105Pa下滅菌20min。4C保存。3mo1/LNaAc*3H2O溶液(pH5.2)：稱取NaAc晶體20.412g溶解于約30mL的雙蒸水，用冰乙酸調(diào)至pH5.2,加雙蒸水定容到50mL,高壓滅菌20min。4C保存。提取緩沖液(0.4mol/L葡萄糖，3%PVP,2%B-巰基乙醇)250mL：稱取葡萄糖19.817g、PVP7.50g,加水溶解并定容到250mL,在1.03X105Pa下滅菌20min,B-巰基乙醇現(xiàn)用現(xiàn)加。4C保存。裂解緩沖液(3%CTAB；100mmo1/LTris-HC1,pH8.0；20mmo

25、1/LEDTA,pH8.0；1.4mol/LNaCl；2%B-巰基乙醇)100mL：取10%CTAB30mL,加1mol/LTrisHC1(pH8.0)10mL,加0.5mo1/LEDTA(pH8.0)4mL,加5mol/LNaCl28mL并定容到100mL,高壓滅菌20min,B-巰基乙醇現(xiàn)用現(xiàn)加。(11)TE緩沖液(10mmo1/LTris-HC1,pH8.0；1mmo1/LEDTA,pH8.0):取Tris-HCl溶液(pH8.0)1mL,EDTA(pH8.0)0.2mL,用雙蒸水定容到100mL,高壓滅菌20min。4C保存。(12)電泳緩沖液TAE(Tris-乙酸)的配制50XTAE

26、母液的配制：242.0gTris-Bace、57.1mL冰乙酸、100ml0.5mo1/LEDTA(pH8.0)，用雙蒸水空容至1000mL。1XTAE電泳緩沖液的配制：取50XTAE10mL,再加入490mL雙蒸水，定容至500mL主要溶液如下：1MTris-HC1(pH8.0)：在800mL水中溶解121gTris堿，用濃HC1調(diào)節(jié)pH至所需值pH8.0(約42mLHC1),加水定容1000mL，分裝后高壓滅菌。0.5MEDTA(pH8.0)：在400mL水中加入90.05g二水乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa22H2O),攪拌溶解，用NaOH調(diào)pH至8.0(約10gNaOH顆粒)，定容至5

27、00mL，高壓滅菌。5MNaCl：稱取292.2gNaCl，用雙蒸水定容到1000mL，高壓滅菌備用。TE緩沖液(pH8.0)：10mMTris-HC1(pH8.0),1.0mMEDTA(pH8.0)。2XCTAB提取液(pH8.0)：2%(w/v)CTAB,1.4MNaCl,20mMEDTA,100mMTris-HC1,0.2%巰基乙醇(v/v)。即稱取CTAB2g,加蒸餾水40mL,力口1MTris-HCl(pH8.0)10mL、0.5MEDTA(pH8.0)4mL和5MNaCl28mL,待CTAB溶解后用蒸餾水定容到100mL。CTAB提取DNA緩沖液配方CTAB4gNaCl16.364

28、g1MTris-HCl20ml(PH8.0)0.5MEDTA8ml,先用70mlddH2O溶解，再定容至200ml滅菌。TE緩沖液配方TE的組成濃度為：10mMTris-HCl；1mMEDTAPH=8.0，配制過程如下：量取下列溶液于500ml燒杯中1MTris-HClBufferPH=8.05ml0.5MEDTAPH=8.01ml向燒杯中加入約400mlddH2O均勻混合；將溶液定容到500ml后，高溫高壓滅菌；室溫保存.CTAB法提取植物基因組DNA1實(shí)驗(yàn)原理1、在生物體中核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，以核蛋白的形式存在,在制備核酸時(shí)，通過研磨破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使核蛋白被釋放出來。2、在濃氯

29、化鈉溶液(12mol/L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小而在稀氯化鈉溶液(0.14mol/L)中QNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的氯化鈉溶液將DNA核蛋白和RNA核蛋白從樣品中分別抽提出來。3、進(jìn)一步將蛋白等雜質(zhì)除去，常采用的去除蛋白：用含異戊醇的氯仿振蕩核蛋白溶液，使其乳化，然后離心除去變性蛋白質(zhì)，此時(shí)蛋白質(zhì)凝膠停留在水相和氯仿相中間,而DNA溶于上層水相。用兩倍體積95乙醇溶液將DNA鈉鹽沉淀出來。反復(fù)使用上述方法多次處理DNA核蛋白溶液,就能將蛋白等雜質(zhì)較徹底地除去,得到較純的DNA制品。為了徹底除去DNA制品中混雜的RNA

30、，可用RNA酶處理。生物材料中含有的脂肪物質(zhì)和大部分的多糖，在用鹽溶液分離核蛋白和用乙醇或異丙醇分級(jí)沉淀時(shí)即被除去。在DNA提取、制備的過程中，核酸極不穩(wěn)定，許多因素可破壞其完整結(jié)構(gòu)：化學(xué)因素，核酸的結(jié)構(gòu)在pH值4.011.0間較穩(wěn)定，pH值在此范圍外就會(huì)使核酸變性降解，故制備過程應(yīng)避免過酸過堿。物理因素，DNA分子鏈很長(zhǎng)，是雙螺旋結(jié)構(gòu)，既有一定的柔性。又有一定的剛性，故強(qiáng)機(jī)械作用如劇烈攪拌會(huì)令DNA分子斷裂，不利于收集，應(yīng)加以避免。酶的作用，細(xì)胞中普遍存在的核酸酶在細(xì)胞壁或膜遭到破壞時(shí)被釋放出來，它會(huì)降解DNA分子。故須用酶的變性劑、抑制劑使之失活。常用的酶抑制劑有檸檬酸鹽、氟化物、砷酸鹽、

31、乙二胺四乙酸鹽、(ETDA-Na)等。操作過程最好在低溫(0C左右)下進(jìn)行。SDS和苯酚作為蛋白變性劑，同時(shí)可使核酸酶被破壞而失活。CTAB法原理CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化銨)，是一種陽離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶液中(0.7mol/LNaCl),CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。CTAB分離緩沖液2%CTAB，1.4mol/LNaCL,20mmol/LEDTA(PH8.0),1

32、00mmol/LTris-HCL(pH8.0),0.2%巰基乙醇100mL:2gCTAB，8.18gNaCL，0.74gEDTA.Na2.2H2O，加入10mL1mol/L的Tris-HCL(pH8.0),0.2mL巰基乙醇，加水定容到100mL。1、Tris-HCl(pH8.0)提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；2、EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；3、NaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解于液相；4、CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；5、卜巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成釀，避免褐變，使酚容易去除;PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚

33、形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì),有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。1用酚抽提細(xì)胞DNA時(shí)，有什么作用？使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時(shí)，由于蛋白與DNA聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的優(yōu)點(diǎn)：1.有效變性蛋白質(zhì)；2抑制了DNase的降解作用。缺點(diǎn)：1.能溶解10-15%的水，從而溶解一部分poly（A）RNA。不能完全抑制RNase的活性。所以提取RNA時(shí)只用氯仿抽提。2、氯仿的作用？氯仿：加速有機(jī)相與液相分層；去除核酸溶液中的跡量酚。（酚易溶于氯仿中）3、用酚-氯

34、仿抽提細(xì)胞基因組DNA時(shí)，通常要在酚-氯仿中加少許異戊醇，為什么？異戊醇：減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡（異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定）4、用乙醇沉淀DNA時(shí)，為什么加入單價(jià)的陽離子？用乙醇沉淀DNA時(shí)，通常要在溶液中加入單價(jià)的陽離子，如NaCl或NaAc,Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀。1.十六烷基三乙基溴化銨（CTAB）法在目前眾多的DNA提取方法中，CTAB法是其中最為廣泛應(yīng)用的一種。它既可以裂解細(xì)胞，又可以有效地去除多酚類和多糖類物質(zhì)的沉淀，因而經(jīng)常被應(yīng)用于植物的DNA提取工作中。1.1原理及方法CTAB是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜。同時(shí)它能與核酸形成復(fù)合物，這些復(fù)合物在高鹽溶液中(0.7mol/LNaCl)是可解離的，從而可使DNA和多糖物質(zhì)分開。當(dāng)溶液鹽濃度降低到一定程度(0.3m