02 消毒與滅菌 微生物與免疫學

1、第二章消毒與滅菌 (理化因子控制微生物)一、幾個基本概念抑菌(Inhibition)：生長停止，但不一定死亡；無菌操作(Antiseptic technique)：防止微生物污染的操作。防腐(Antisepsis)：防止或抑制霉腐微生物在食品等物質(zhì)上的生長；無菌(Asepsis)：不存在任何活菌；消毒(Disinfection)：殺死或滅活病原微生物（營養(yǎng)體細胞）；滅菌(Sterilization)：殺死包括芽孢在內(nèi)的所有微生物；理化因子抑菌、殺菌作用的相關(guān)因素：理化因子的強度或濃度；同一濃度理化因子作用時間的長短；不同種類的微生物；同種微生物的不同生長時期；（一）滅菌（sterilizati

2、on） 采用強烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切微生物永遠喪失其生長繁殖能力的措施，稱為滅菌。Eg. 高溫滅菌、輻射滅菌等 殺菌（bacteriocidation）溶菌（bacteriolysis）菌體雖死，但形體尚存菌體殺死后，其細胞發(fā)生溶化、消失的現(xiàn)象滅菌（二）消毒（disinfection） 消 除 毒 害“毒害”就是指傳染源或致病菌 消毒是一種采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體或動、植物有害的病原菌，而對被消毒的對象基本無害的措施。Eg. 對皮膚、水果、飲用水進行藥劑消毒的方法；對啤酒、牛奶、果汁和醬油等進行消毒處理的巴氏消毒法，等等。（三）防腐（antisepsi

3、s） 防腐就是利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，防止食品、生物制品等對象發(fā)生霉腐的措施。防腐的措施（1）低溫（2）缺氧（3）干燥 （4）高滲（5）高酸度 （6）高醇度（7）防腐劑防腐劑和消毒劑特點： 對一切活細胞都有毒性，不能用于人或動物體內(nèi)的化學治療。消毒劑：可殺死微生物，通常用于非生物材料的滅菌或消毒。防腐劑：能殺死微生物或抑制其生長，但對人及動物的體表組織無毒性或毒性低，可作為外用抗微生物藥物。殺滅或抑制微生物的物理因素溫度輻射作用過濾滲透壓干燥超聲波等二、物理滅菌溫度 當溫度超過微生物生長的最高溫度或低于生長的最低溫度都會對微生物產(chǎn)生殺滅作用或抑制作用。(一) 高溫滅菌的種

4、類 高溫使蛋白質(zhì)、核酸等重要生物大分子發(fā)生變性、破壞，以及破壞細胞膜上的類脂成分，導(dǎo)致微生物死亡。1. 干熱滅菌法（dry heat sterilization） 烘箱內(nèi)熱空氣滅菌干熱滅菌火焰灼燒 將金屬制品或清潔玻璃器皿放入電熱烘箱內(nèi)，在150170下維持12小時后，即可達到徹底滅菌的目的。 灼燒（incineration或combustion）是一種最徹底的干熱滅菌方法，其破壞力很強，故應(yīng)用范圍僅限于接種環(huán)、接種針的滅菌或帶病原菌的材料、動物尸體的燒毀等。細胞膜破壞蛋白質(zhì)變性原生質(zhì)干燥各種細胞成分發(fā)生氧化干熱2. 濕熱滅菌法（moist heat sterilization） 濕熱滅菌法是

5、指用100以上的加壓蒸汽進行滅菌。濕熱比干熱滅菌更好：濕熱蒸氣透射力強，更易于傳遞熱量；更易破壞保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的氫鍵等結(jié)構(gòu)；濕熱對一般營養(yǎng)體和孢子的殺滅條件：多數(shù)細菌和真菌的營養(yǎng)細胞：在60左右處理5-10分鐘；酵母菌和真菌的孢子：用80以上溫度處理；細菌的芽孢：121處理15分鐘以上；（1）常壓法1）巴斯德消毒（pasteurization）6085處理15s30min低溫濕熱消毒法低溫維持法（LTH，low temperature holding method）高溫瞬時法（HTST，high temperature short time）在63下保持30min可進行牛奶消毒牛奶消毒時只要

6、在72下保持15秒鐘即可巴氏消毒法專用于牛奶、啤酒、果酒和醬油等不宜進行高溫滅菌的液態(tài)風味食品或調(diào)料的低溫消毒方法。 可殺滅物料中無芽孢的病原菌（如牛奶中的結(jié)核桿菌或沙門氏菌），而又不影響它們的風味，但不能殺滅引起Q熱的病原體Coxiellaburnetii（伯氏考克斯氏體，是一種立克次氏體）。2）煮沸消毒100 處理1530min一般用于飲用水的消毒3）間歇滅菌（fractional sterilization或tyndallization）80100 下蒸煮1560min，室溫或37下保溫過夜，循環(huán)三次。 此法又稱丁達爾滅菌法或分段滅菌法。適用于不耐熱培養(yǎng)基的滅菌。例如，培養(yǎng)硫細菌的含硫培

7、養(yǎng)基用間歇滅菌法滅菌，因其內(nèi)所含元素硫在99100的溫度下可保持正常結(jié)晶形，而常規(guī)的加壓滅菌（121）后會引起硫熔化。（2）加壓法1）常規(guī)加壓蒸汽滅菌法（normal autoclaving）121（壓力為1kgcm2或15磅英寸2），1520min；115（0.7kgcm2或10磅英寸2），35min； 一般稱作“高壓蒸汽滅菌法”。這是一種利用高溫進行濕熱滅菌的方法。優(yōu)點：操作簡便、效果可靠，廣泛使用。高壓蒸汽滅菌法適合于一切微生物學實驗室、醫(yī)療保健機構(gòu)或發(fā)酵工廠中對培養(yǎng)基及多種器材、物料的滅菌 。5）連續(xù)加壓蒸汽滅菌法（continuous autoclaving ）135140，5-15

8、s，工業(yè)上發(fā)酵培養(yǎng)基135150，2-6s，牛奶或其它液態(tài)食品（超高溫滅菌） 在發(fā)酵行業(yè)里也稱“連消法”。此法只在大規(guī)模的發(fā)酵工廠中作培養(yǎng)基滅菌用。主要操作是將培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外連續(xù)不斷地進行加熱、維持和冷卻，然后才進入發(fā)酵罐。利用溫度進行殺菌的定量指標 也稱熱致死時間，指在某一溫度下，殺死某微生物的水懸浮液群體所需的最短時間。（1）熱死時間（thermal death time）Eg. E. coli在60下為10min；Salmonella typhi（傷寒沙門氏菌）在58下為30min等。（2）熱死溫度（thermal death point） 也稱熱死點，指在一定時間內(nèi)（一般為10min

9、），殺死某微生物的水懸浮液群體所需的最低溫度。Eg. Agrobacterium tumefaciens（根癌土壤桿菌）為53；Erwinia carotovora （胡蘿卜軟腐歐文氏菌）為4851等 。（二）影響加壓蒸汽滅菌效果的因素 1.殺菌物體含菌量 不同的微生物個體（包括營養(yǎng)體和孢子）的耐熱性是有差別的。一般滅菌物體中的含菌量越高，需要的滅菌時間越長。2.滅菌鍋內(nèi)空氣排除程度 在一切利用加壓蒸汽滅菌法的場合下，必須做到徹底排除滅菌鍋內(nèi)的殘余空氣 。滅菌鍋上同時裝有壓力表和溫度計3.滅菌對象的pHpH6.08.0時，微生物較不易死亡；pH6.0時，最易引起死亡。4.滅菌對象的體積 滅菌對

10、象體積的大小會影響熱的傳導(dǎo)速率。在實驗室工作中，對大容量培養(yǎng)基滅菌時，必須注意相應(yīng)延長滅菌時間。5.加熱與散熱速度 根據(jù)季節(jié)的變化或滅菌物件體積的大小，確定相應(yīng)的“上磅”（預(yù)熱速度）或“下磅”（散熱）時間。（三）高溫對培養(yǎng)基成分的有害影響及其防止 1.有害影響高溫，尤其是長時間的高溫除對培養(yǎng)基中的淀粉成分有促進糊化和水解等少數(shù)有利影響外，一般對培養(yǎng)基成分產(chǎn)生很多不利的影響。產(chǎn)生褐變的機制由氨基化合物（氨基酸、肽、蛋白質(zhì)）與羰基化合物（糖類）間發(fā)生復(fù)雜的梅拉特反應(yīng)（maillard reaction）所引起，它在導(dǎo)致培養(yǎng)基褐變的同時，還降低了有關(guān)營養(yǎng)物成分，應(yīng)盡量設(shè)法避免。2.防止法（1）采用特

11、殊加熱滅菌法 對易破壞的含糖培養(yǎng)基進行滅菌時，應(yīng)先將糖液與其他成分分別滅菌后再合并；對含Ca2+或Fe3+的培養(yǎng)基與磷酸鹽先作分別滅菌，再混合，不易形成磷酸鹽沉淀；對含有在高溫下易破壞成分的培養(yǎng)基（如含糖組合培養(yǎng)基）可進行低壓滅菌（在112即0.57kgcm2或8磅英寸2下滅菌15分鐘）或間歇滅菌；在大規(guī)模發(fā)酵工業(yè)中，可采用連續(xù)加壓滅菌法進行培養(yǎng)基的滅菌等。（2）過濾除菌法 對培養(yǎng)液中某些不耐熱的成分可采用過濾除菌法“滅菌”。缺點：無法濾除液體中的病毒和噬菌體。各種濾器（filter）例如，濾膜過濾裝置、燒結(jié)玻璃濾板過濾器、石棉板過濾器（Seitz filter）、素燒瓷過濾器（Chamber

12、land candle）、硅藻土過濾器（Berkefeld candle）等。（a）注射式微孔濾器 （b）小型過濾裝置 （c）層流生物安全柜 棉花、玻璃纖維或石棉微孔濾膜0.220.45醋酸纖維素、硝酸纖維素核孔濾器過濾除菌（3）其他方法 加入0.01EDTA（乙二胺四乙酸）或0.01NTA（氮川三乙酸）等螯合劑到培養(yǎng)基中，可防止金屬離子發(fā)生沉淀； 用氣體滅菌劑如氧化乙烯（環(huán)氧乙烷）等對個別成分進行滅菌處理，在混入以滅過菌的其它培養(yǎng)基成分中。 輻射滅菌（Radiation Sterilization）是利用電磁輻射產(chǎn)生的電磁波殺死大多數(shù)物質(zhì)上的微生物的一種有效方法。用于滅菌的電磁波二、物理滅菌

13、輻射作用微波紫外線（UV）X-射線-射線1、紫外光200300nm范圍的紫外光殺菌作用最好。殺菌作用機制：使蛋白質(zhì)（約280nm）和核酸（約260nm）吸收變性失活；也可產(chǎn)生有毒的光化學產(chǎn)物-自由基，結(jié)合到DNA、RNA和蛋白質(zhì)分子上，干擾細胞的代謝過程。紫外光穿透能力很差，不能穿過玻璃、衣物、紙張或大多數(shù)其他物體，但能夠穿過空氣。主要用作物體表面或室內(nèi)空氣的殺菌。2、電離輻射主要使用X射線和射線。當X射線或射線撞擊分子時，形成離子和自由基分子。電離輻射產(chǎn)生H2O2，使蛋白質(zhì)發(fā)生變化，細胞受到損傷或死亡。電離輻射主要用于其他方法所不能解決的塑料制品、醫(yī)療設(shè)備、藥品和食品的滅菌。3.強可見光 4

14、00700nm波長范圍的強可見光也具有直接的殺菌效應(yīng)，它們能夠氧化細菌細胞內(nèi)的光敏感分子，如核黃素和卟啉環(huán)（構(gòu)成氧化酶的成分）。 實驗室應(yīng)注意避免將細菌培養(yǎng)物暴露于強光下。此外，曙紅和四甲基藍能夠吸收強可見光使蛋白質(zhì)和核酸氧化，因此常將兩者結(jié)合用作滅活病毒和細菌。微波：微波的范圍在9152450 MHz/s之間。機理：微波產(chǎn)生熱效應(yīng)，使蛋白質(zhì)、酶等物質(zhì) 變性，導(dǎo)致微生物死亡。 缺點：由于微波加熱食品通常存在不均勻問題,微生物逃逸微波加熱現(xiàn)象常會發(fā)生。 4.微波超聲波：每秒鐘振動在1600以上的聲波。機理：引起膜破壞，細胞破裂，內(nèi)涵物逸出。 超聲波殺菌效力大小與頻率、強度、處理時間等多種因素有關(guān)

15、。三、物理滅菌超聲波其它作用：破碎細胞，提取胞內(nèi)物質(zhì)（代謝產(chǎn)物、酶等） 干燥并不一定殺死微生物，但因使細胞造成代謝停止而抑制微生物生長，有時也可引起某些微生物細胞的死亡。不同微生物種類對干燥的敏感性：淋病球菌 對干燥敏感 幾小時便死亡結(jié)核分支桿菌 耐干燥 10020min仍能生存鏈球菌 耐干燥 保存幾年而不喪失致病性休眠孢子 抗干燥能力強 在干燥條件下可長期不死四、物理滅菌干燥五. 物理滅菌滲透壓 增加滲透壓是另一種通過限制微生物可利用水而控制其生長的方法。高滲環(huán)境中，水從細胞中流出，使細胞脫水。像鹽腌制咸肉或咸魚，糖浸果脯或蜜餞等均是這一方法在食品保存中的應(yīng)用。物理抗菌（學生填空）方法作用機

16、理舉例干熱滅菌蛋白質(zhì)變性濕熱滅菌蛋白質(zhì)變性巴斯德消毒法冷藏減慢酶促反應(yīng)冷凍干燥抑制酶活性物理抗菌（學生填空）方法作用機理舉例冷凍干燥脫水抑制酶活性紫外線蛋白質(zhì)和核酸變性離子輻射蛋白質(zhì)和核酸變性微波吸收水分子后微波以發(fā)熱形式釋放強可見光氧化光敏性物質(zhì)聲波和超聲波空化效應(yīng)膜過濾機械去除滲透壓巴斯德消毒牛奶是無菌產(chǎn)品嗎？微波可有效殺死芽孢桿菌？一邊工作一邊可以用紫外進行消毒？六、化學消毒滅菌抗微生物劑非選擇性（對所有細胞均有毒性）有選擇性（對病原微生物毒性更強）消毒劑（Disinfectant）防腐劑（Antisepsis）抗代謝藥物抗生素中草藥有效成分（化學治療劑） 評價表面活性劑、化學殺菌劑、防

17、霉劑、農(nóng)藥或化學治療劑等的藥效和毒性的3種指標。最低抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）半致死劑量（50 lethal dose，LD50）最低致死劑量（minimum lethal dose，MLD） 評定某化學藥物藥效強弱的指標，指在一定條件下，某化學藥劑抑制特定微生物的最低濃度。 評定某藥物毒性強弱的指標，指在一定條件下，某化學藥物能殺死50試驗動物時的劑量。 評定某藥物毒性強弱的另一指標，指在一定條件下，某化學藥物能引起試驗動物群體100死亡率的最低劑量。化學物質(zhì)的抗微生物能力的測定液體培養(yǎng)法最低抑制濃度（minimum inhibito

18、ry concentration，MIC）實驗平板培養(yǎng)法抑菌圈（zone of inhibition）試驗紙片擴散法能區(qū)分殺菌或抑菌作用嗎？（一）表面消毒劑（surface disinfactant） 表面消毒劑是指對一切活細胞都有毒性，不能用作活細胞或機體內(nèi)治療用的化學藥劑。共同規(guī)律：當其處于低濃度時，常常會對微生物的生命活動起刺激作用，隨著濃度逐漸增高，就相繼出現(xiàn)制菌和殺菌作用，因而形成一個連續(xù)的作用譜。各種抗微生物化學制劑殺菌能力的比較標準：石炭酸系數(shù)（phenol coefficient，P.C.）： 指在一定時間內(nèi)，被試藥劑能殺死全部供試菌（test organism）的最高稀釋度與

19、達到同效的石炭酸的最高稀釋度的之比。一般規(guī)定處理時間為10分鐘，而供試菌定為鼠傷寒沙門氏菌（消化系統(tǒng)）和金黃色葡萄球菌（普通傷口）。 在臨床上最早使用的消毒劑石炭酸石碳酸系數(shù)為1：消毒效力與石碳酸相比？系數(shù)小于1：？系數(shù)大于1：？許多微生物學家最低抑菌濃度比石碳酸系數(shù)更有意義。化學藥劑金黃色葡萄球菌鼠傷寒沙門氏菌苯酚11乙醇6.36.3福爾馬林0.30.7雙氧水-0.01來蘇兒5.03.2碘酒6.35.8氧化汞100143氯胺133100甲酚2.32.3表面消毒劑廣泛用于一些熱敏感的或無法進行高溫滅菌的物品或場所的滅菌：溫度計、帶有透鏡的儀器設(shè)備、聚乙烯管或?qū)Ч艿?；墻壁、樓板與儀器設(shè)備等表面和

20、自來水；空氣；乙醇消毒時濃度越高，殺菌效果越強？為什么？ 乙醇消毒：需要水分，因其機理是使菌體蛋白凝固；乙醇水溶液滲透性更強。（二）抗代謝藥物磺胺類藥物 抗代謝藥物（antimetabolite）又稱代謝拮抗物或代謝類似物（metabolite analogue），是指一類在化學結(jié)構(gòu)上與細胞內(nèi)必要代謝物的結(jié)構(gòu)相似，并可干擾正常代謝活動的化學物質(zhì)。 抗代謝物在結(jié)構(gòu)上與生物體所必需的代謝物很相似，以至可以和特定的酶結(jié)合，從而阻礙了酶的功能，干擾了代謝的正常進行。它具有良好的選擇毒力，是一類重要的化學治療劑，多為有機合成藥物。葉酸對抗物（磺胺類） 嘌呤對抗物（6-巰基腺嘌呤） 苯丙氨酸對抗物（對氟苯

21、丙氨酸） 尿嘧啶對抗物（5-氟尿嘧啶） 胸腺嘧啶對抗物（5-溴胸腺嘧啶） 等等磺胺藥物是最早發(fā)現(xiàn)，也是最常見的化學療劑，抗菌譜廣，能治療多種傳染性疾病。大多數(shù)革蘭氏陽性細菌（如肺炎球菌、溶血性鏈球菌等）某些革蘭氏陰性細菌（如痢疾桿菌、腦膜炎球菌、流感桿菌等）對放線菌也有一定的作用。1934年，德國I. G. Farben染料廠的G. Domagk：一種紅色染料（prontosil，百浪多息），白鼠靜脈注射，可治療因鏈球菌引起的感染，但在體外卻無作用。1935年，進一步證明prontosil對人的鏈球菌病也有效。法國人Trefouel和英國人Fuller：prontosil在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成了具有抑菌作用的磺胺磺胺是葉酸組成部分對氨基苯甲酸的結(jié)構(gòu)類似物作用機理： 二氫蝶啶 +對氨基本甲酸 二氫葉酸 四氫葉酸 輔酶F磺胺藥 核酸合成二氫葉酸合成酶二氫葉酸還原酶磺胺藥作