仿制藥雜質(zhì)檢查方法建立和方法學(xué)研究與評價

1、仿制藥雜質(zhì)檢查方法建立和方法學(xué)研究與評價主講人：許真玉講習(xí)組成員：霍秀敏、高楊藥品審評中心2008年7月一、概述二、雜質(zhì)檢查方法的建立三、雜質(zhì)檢查方法學(xué)驗證的要求四、雜質(zhì)檢查方法和方法驗證常見問題分析五、幾個小問題的計論六、小結(jié)主要內(nèi)容2雜質(zhì)：任何影響藥物純度的物質(zhì)統(tǒng)稱為雜質(zhì)。 藥品中的雜質(zhì)按其理化性質(zhì)一般分為三類：有機雜質(zhì)、無機雜質(zhì)及殘留溶劑。 有關(guān)物質(zhì)：有機雜質(zhì)包括工藝中引入的雜質(zhì)和降解產(chǎn)物等，可能是已知的或未知的、揮發(fā)性的或不揮發(fā)性的。由于這類雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)一般與活性成分類似或具淵源關(guān)系，故通常又可稱之為有關(guān)物質(zhì)。 有關(guān)物質(zhì)包括已知雜質(zhì)和未知雜質(zhì)。 主要內(nèi)容31、雜質(zhì)檢查方法和方法學(xué)驗證

2、對仿制藥的重要意義（1）安全性的重要保證-關(guān)注毒性雜質(zhì)（2）評價仿制藥質(zhì)量是否一致的關(guān)健指標之一-仿制藥與被仿制藥的質(zhì)量一致-雜質(zhì)的種類和數(shù)量不高于被仿制藥（3）雜質(zhì)研究的基礎(chǔ)-雜質(zhì)檢查方法不合適或方法學(xué)驗證不完善，雜質(zhì)檢查不可靠，無法準確評價藥品質(zhì)量一、概述4仿制藥與被仿制藥一致性要求藥學(xué)方面一致（含量、結(jié)構(gòu)、雜質(zhì)、其它檢查項等）雜質(zhì)的數(shù)量和種類低于被仿制藥，否則需要分析雜質(zhì)的安全性并提供有關(guān)數(shù)據(jù)，必要時應(yīng)進行相關(guān)的安全性試驗建立雜質(zhì)適宜的雜質(zhì)檢查方法用于判斷一致性用于工藝優(yōu)化、去除雜質(zhì)、考察穩(wěn)定性、控制藥物質(zhì)量一、概述52、目前國內(nèi)仿制藥研究中雜質(zhì)檢查面臨的困難-雜質(zhì)來源不清被仿制藥和仿制

3、藥雜質(zhì)的種類和數(shù)量不清，包括雜質(zhì)產(chǎn)生或引入過程、降解途徑-雜質(zhì)檢查方法缺乏針對性不知控制何種雜質(zhì)以及為何控制，缺乏安全性數(shù)據(jù)的支持-雜質(zhì)對照品制備困難（受限于工藝困難），方法驗證不充分-雜質(zhì)檢查結(jié)果難于評價研究基礎(chǔ)薄弱，需要提高雜質(zhì)研究水平，包括雜質(zhì)檢查方法和驗證水平，以提高仿制藥研制水平一、概述6例鹽酸曲美他嗪片進口標準釆用梯度洗脫，對3種已知雜質(zhì)、單個未知雜質(zhì)及總雜質(zhì)分別進行控制國內(nèi)仿制釆用等度洗脫，僅對未知雜質(zhì)（單個雜質(zhì)和/或總雜質(zhì)）進行控制國內(nèi)同品種標準對有關(guān)物質(zhì)的規(guī)定：總雜質(zhì)不得過1.0%。一、概述7例BP收載的核黃素磷酸鈉雜質(zhì)檢驗-HPLC法-已知雜質(zhì)核黃素：對照品法-其它雜質(zhì)：相

4、對保留時間加上自身對照的方法5-單磷酸核黃素的保留時間為20分鐘3，4-二磷酸核黃素大約0.23，5-二磷酸核黃素大約0.34，5-二磷酸核黃素大約0.53-單磷酸核黃素大約0.74-單磷酸核黃素大約0.9核黃素大約2-4-單單磷酸核黃素峰與5-單磷酸核黃素峰的分離度應(yīng)不小于1.5一、概述83、本講所依托的主要技術(shù)指導(dǎo)原則和技術(shù)要求化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則已有國家標準化學(xué)藥品研究技術(shù)指導(dǎo)原則 過渡期品種集中審評（化學(xué)藥品）技術(shù)要求 FDA、ICH的相關(guān)指導(dǎo)原則-Guidance for Industry,ANDAs:Impurities in Drug Substances,Chemis

5、try,Manufacturing,and Controls Information-ANDAs:Impurities in Drug Products-Q3A(R)-Q3B(R)一、概述94、本講雜質(zhì)的范圍有機雜質(zhì)-包括工藝中引入的雜質(zhì)和降解產(chǎn)物，化學(xué)結(jié)構(gòu)與活性成分的分子式類似或具淵源關(guān)系，通常稱為有關(guān)物質(zhì)無機雜質(zhì)-產(chǎn)生的無機物殘留溶劑-生產(chǎn)過程中使用的有機溶劑來源-工藝雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、從反應(yīng)物及試劑中混入的雜質(zhì)（外源性雜質(zhì)）等結(jié)構(gòu)雜質(zhì)-幾何異構(gòu)體、光學(xué)異構(gòu)體、聚合物、其它甾體、其它氨基酸一、概述10目的-1、建立雜質(zhì)檢查方法是質(zhì)控的要求包括具體的分析操作方法，以及計算方法，限度要求-2、用

6、于分析雜質(zhì)譜考察與被仿制藥一致性，進而優(yōu)化制備工藝及穩(wěn)定性考察二、雜質(zhì)檢查方法的建立11二、雜質(zhì)檢查方法的建立121、雜質(zhì)檢查方法建立的前提-（1）被仿制藥雜質(zhì)譜如何？參考公開信息：質(zhì)量標準、說明書、有關(guān)文獻和專利-（2）自身雜質(zhì)譜如何？理論綜合分析、直接測試二、雜質(zhì)檢查方法的建立13英國藥典頭孢克洛中收載的雜質(zhì)譜二、雜質(zhì)檢查方法的建立14雜質(zhì)譜分析的一些方法（供參考）-分析起始原料中可能存在的雜質(zhì)例：鹽酸曲美他嗪的合成中哌嗪的控制二、雜質(zhì)檢查方法的建立15-分析中間體雜質(zhì)-分析副反應(yīng)及副反應(yīng)產(chǎn)物制劑工藝中可能的Millard反應(yīng)雜質(zhì)產(chǎn)生的來源？結(jié)構(gòu)？工藝條件（滅菌溫度、滅菌時間）的影響？例：

7、氨甲環(huán)酸與葡萄糖二、雜質(zhì)檢查方法的建立16-推測降解產(chǎn)物舉例：甘氨酰谷酰胺 降解雜質(zhì)：環(huán)-（甘氨酰-谷氨酰胺）和焦谷氨酸二、雜質(zhì)檢查方法的建立17研究頭孢菌素的降解途徑研究，為雜質(zhì)譜提供基礎(chǔ)二、雜質(zhì)檢查方法的建立18-UV法（HPLC-PAD）二、雜質(zhì)檢查方法的建立19-LC-MS/GC-MS或CE-MS法-HPLC峰保留時間對比法 用于未知雜質(zhì)或未定性雜質(zhì)的“標記”-其他方法雜質(zhì)研究實例.DOC二、雜質(zhì)檢查方法的建立202、仿制藥雜質(zhì)檢查方法建立的一般考慮點（1）參考被仿制藥的方法被仿制藥雜質(zhì)檢查方法和限度如何？標準中控制了哪些雜質(zhì)？重要參考，為方法建立提供重要的信息，全面考察不可簡單套-工

8、藝或處方的不同，二者的雜質(zhì)譜可能不同，被仿制藥雜質(zhì)檢查方法可能不適用-被仿制藥標閃較低，無雜質(zhì)檢查項或控制較為簡單-被仿制藥的雜質(zhì)檢查方法無法獲得二、雜質(zhì)檢查方法的建立21（2）結(jié)合雜質(zhì)理化特點根據(jù)雜質(zhì)譜，考慮雜質(zhì)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)例如：阿司匹林 比色法游離水楊酸（CP2005）葡萄糖UV法5-羥甲基糠醛（CP2005）氨基酸原料藥 TLC法其他氨基酸（CP2005） 二、雜質(zhì)檢查方法的建立22（3）結(jié)合雜質(zhì)的毒性特點安全性控制的需要被仿制藥和自身雜質(zhì)的毒性如何？重視藥理毒理及臨床安全性研究的結(jié)果的作用對于有些分子通過以下化學(xué)反應(yīng)可能產(chǎn)生潛在的遺傳毒性作用-烷基化-交聯(lián)-脫嘌呤可參考遺傳毒性結(jié)構(gòu)庫

9、遺傳毒性雜質(zhì)或具有可能引起遺傳毒性的結(jié)構(gòu)（alerting stucture）的雜質(zhì)需要建立靈敏的試驗方法-EMEA遺傳毒性雜質(zhì)限度指導(dǎo)原則：毒理學(xué)閾值（TTC）1.5ug/人/日二、雜質(zhì)檢查方法的建立23(4)考慮不同檢查方法的特點主要是靈敏度和專屬性能否符合要求痕量雜質(zhì)和遺傳毒性雜質(zhì)的嚴格控制，對方法的要求較高-化學(xué)法vsTLC法vsHPLC法-HPLC/MS，HPLC/熒光CE法可用于微量樣品GC適用于揮發(fā)性雜質(zhì)檢查二、雜質(zhì)檢查方法的建立24（5）注意多種方法聯(lián)用由雜質(zhì)多樣性復(fù)雜性和方法局限性所決定單一方法不能滿足多個雜質(zhì)的檢測時，可釆用兩種或兩種以上的方法互為補充，控制雜質(zhì)-化學(xué)法、色

10、譜法、光譜法、生物檢定法-同一方法釆用不同的測試條件如正相HPLC、反相HPLC、不同流動相的反相HPLC等-分離技術(shù)與檢測手段聯(lián)用，較為有效，如HPLC、GC、LC-MS、HPLC-PDA、CE等例：肝素鈉中多硫酸軟骨素的NMR檢查方法二、雜質(zhì)檢查方法的建立25（6）綜合藥學(xué)其他研究結(jié)果雜質(zhì)檢查與藥物外觀色澤、含量等項目間存在密切聯(lián)系，如果這些項目發(fā)生明顯變化，而雜質(zhì)基本不變時，應(yīng)分析原因，關(guān)注雜質(zhì)檢查方法的可行性二、雜質(zhì)檢查方法的建立26例：5-羥甲基糠醛的檢查方法的綜合分析-溶液顏色法、紫外法、HPLC法葡萄糖注射液顏色深淺與5-HMF產(chǎn)生的量有關(guān)，非葡萄糖注射液變色唯一因素，專屬性、準

11、確性差5-HMF的最大吸收波長為284nm，干擾較少如果制劑中的主藥或輔料在284nm有明顯的明收，會干擾5-HMF的檢查，可釆用HPLC法代替二、雜質(zhì)檢查方法的建立273、雜質(zhì)檢查常見方法介紹HPLC法-考慮被仿制藥的色譜條件-參考同類物質(zhì)質(zhì)量標準中的雜質(zhì)檢查方法-一般選擇多種色譜條件 反相和正相-方法包括固定相、流動相、洗脫方式、波長、測試樣品的處理、具體操作、計算方法二、雜質(zhì)檢查方法的建立28（1）固定相的選擇-根據(jù)待研究的藥物的特性選擇合適填料的柱子，常用RP-HPLC，色譜柱多選用C18柱，C8柱、苯基柱、氨基柱也有使用-C18柱時，流動相有機溶劑%通常5%-流動相PH值2-8PH8

12、，溶解硅膠載體，宜選用耐堿填充劑：包覆聚合物、高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠、非硅膠或有機-無機雜化填充劑-PH2，鍵合相水解脫落，宜選用耐酸填充劑：有機-無機雜質(zhì)填充劑、具有大體積側(cè)鏈的二異丙基或二異丁基取代基取代C18鍵合硅膠等二、雜質(zhì)檢查方法的建立29注意不同品牌柱子在耐用性方面的研究：-當雜質(zhì)峰與主峰的分離情況不十分完美-確定輔料峰的相對保留時間（用于定位扣除輔料峰的干擾）-確定特定雜質(zhì)的相對保留時間-確定有關(guān)物質(zhì)出峰完畢的保留時間 當不同品牌而引起以上各因素不固定時，應(yīng)在標準中注明品牌。二、雜質(zhì)檢查方法的建立30（2）流動相的選擇嘗試多種流動相結(jié)合雜質(zhì)的性質(zhì) -手性雜質(zhì)

13、-無紫外吸收雜質(zhì) -一般雜質(zhì) （3）洗脫方式的選擇 等度洗脫 梯度洗脫：極性大的化合物可能被掩蓋，極性小的化合物難以被洗脫，甚至保留在柱上，可適用梯度洗脫。 二、雜質(zhì)檢查方法的建立31梯度洗脫與等度洗脫條件下有關(guān)物質(zhì)的分離情況二、雜質(zhì)檢查方法的建立32（4）波長的選擇-選擇的原則是大部分主要雜質(zhì)與主成分均在此波長下有吸收二極管陣列方法-無紫外吸收或檢測波長處吸收相差較大的多種化合物，有時在單一檢測波長處不能檢出-兼顧各雜質(zhì)吸收情況；特定波長檢測特定雜質(zhì)-必要時，改用其他類型檢測器二、雜質(zhì)檢查方法的建立33三、雜質(zhì)檢查方法驗證的要求34（5）樣品的處理和配制-預(yù)處理樣品的考慮乳膏提取可能導(dǎo)致的雜

14、質(zhì)漏檢和失真衍生化處理導(dǎo)致的雜質(zhì)丟失-樣品濃度的影響濃度高利于雜質(zhì)的檢出，但防超載低濃度樣品雜質(zhì)的檢查難題？二、雜質(zhì)檢查方法的建立35（6）雜質(zhì)的定量計算方法 -雜質(zhì)對照品法定量準確，已知雜質(zhì)，需用雜質(zhì)對照品 -校正因子的主成分自身對照法定量準確，已知雜質(zhì)，無需長期提供對照品 -不加校正因子的主成分自身對照法前提是假定雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子基本相同有一定誤差，可用于未知雜質(zhì)已知雜質(zhì)對主成分的響應(yīng)因子在0.91.1之間 -峰面積歸一法簡便因雜質(zhì)與主成分響應(yīng)因子不同、線性范圍不同、儀器對它們的積分精度及準確度不同等因素，有一定的局限性二、雜質(zhì)檢查方法的建立36目前定量方法中存在的主要問題-雜質(zhì)對照

15、品法較少使用-主成分自身對照法較少采用校正因子計算雜質(zhì)無法進行歸屬或雜質(zhì)對照品無法得到校正因子無法計算-常見的是對未知雜質(zhì)，不加校正因子的主成分自身對照或面積歸一化法無法準確定量無法有效檢測雜質(zhì)二、雜質(zhì)檢查方法的建立37TLC法-設(shè)備和操作簡便，一些特定雜質(zhì)的檢查-靈敏度較差、定量不夠精確，分離度欠佳，有時無法滿足需要-僅限于限度檢查（半定量），結(jié)合不同原理的檢視技術(shù)能使各雜質(zhì)斑點均可顯示，彌補HPLC的不足-需做好系統(tǒng)適用性試驗二、雜質(zhì)檢查方法的建立38 -定量方法限度檢查（半定量）對照品比較法已知雜質(zhì)，對照品自身對照法已知雜質(zhì)、未知雜質(zhì)，色調(diào)一致檢視技術(shù)顯色、熒光、自身顏色等二、雜質(zhì)檢查方

16、法的建立39LC-MS/GC-MS/GC-IR/CE-MS法-分離技術(shù)和鑒別技術(shù)聯(lián)用，為解析化合物的結(jié)構(gòu)提供直接證據(jù)-有助于雜質(zhì)譜的分析和定性二、雜質(zhì)檢查方法的建立40方法驗證的目的-考察分析方法是否適用于雜質(zhì)的檢測和定量方法驗證中面臨的困難-雜質(zhì)譜不清-雜質(zhì)對照品無法獲得驗證的具體要求三、雜質(zhì)檢查方法驗證的要求411、專屬性指在可能的共存組分存在時，對被分析物準確測定的能力。分離度-專屬性指標-雜質(zhì)譜的明確是基礎(chǔ)雜質(zhì)可得最難分離物質(zhì)對的分離試驗、粗品中間體分離試驗、輔料與雜質(zhì)及主成他的分離試驗雜質(zhì)不可得強制降解試驗、與另一成熟方法比對峰純度-二極管陣列、質(zhì)譜；改變流動相比例方法不夠?qū)贂r，應(yīng)

17、多個方法予以補充三、雜質(zhì)檢查方法驗證的要求42降解試驗的注意點-降解程度-當降解產(chǎn)物、中間體、副產(chǎn)物吸收波長不同時的處理-制劑降解破壞-消除輔料的干擾，當無法避開輔料的干擾時應(yīng)對輔料進行定位予以扣除三、雜質(zhì)檢查方法驗證的要求43破壞性試驗-酸降解一般釆用0.1mol/L-1mol/L鹽酸或硫酸-堿降解釆用0.1mol/L-1mol/L氫氧化鈉溶液-氧化降解釆用合適的過不去氧化氫溶液-必要時可以加熱或提高濃度-高溫試驗通常溫度高于加速試驗溫度的10，50、60等-對于原料藥有時需考慮水溶液或混懸液的降解-考慮在不同PH值條件下的降解-光照試驗條件可釆用4500LX三、雜質(zhì)檢查方法驗證的要求44存

18、在的主要問題：-（1）主藥完全降解，無法對降解產(chǎn)物進行有效檢測-（2）由于選擇的降解條件強度不夠，使藥物未能降解，而誤認為藥物穩(wěn)定-（3）不能選擇合適測定方法測定降解產(chǎn)物，使主成分降解后測定的回收量偏低-（4）未考慮破壞性試驗時產(chǎn)生的聚合物三、雜質(zhì)檢查方法驗證的要求45三、雜質(zhì)檢查方法驗證的要求462、靈敏度-試樣中能被檢測（或定量）的最低量。-通常用檢測限及定量限表征，可根據(jù)直觀評價、信噪比、響應(yīng)值的標準差和斜率獲得。-應(yīng)滿足質(zhì)控需要-信噪比的方法三、雜質(zhì)檢查方法驗證的要求47三、雜質(zhì)檢查方法驗證的要求483、精密度-在規(guī)定的測試條件下，同一個均勻樣品經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度-重

19、復(fù)性、中間精密度、重現(xiàn)性三、雜質(zhì)檢查方法驗證的要求494、準確度-測定結(jié)果與真實值或參考值接近程度-已知雜質(zhì)：回收率（根據(jù)精密度、專屬性、線性）推斷-未知雜質(zhì)：與另一成熟方法比對、根據(jù)質(zhì)量平衡原理結(jié)合含量等結(jié)果進行粗略判定，必要時研究幾種不同色譜條件甚至不同測定原理的方法進行比較選用三、雜質(zhì)檢查方法驗證的要求505、線性-在設(shè)計范圍內(nèi)，檢測響應(yīng)值與待測物質(zhì)量之間成正比關(guān)系的程度。6、-檢測方法能達到一定精密度、準確度和線性的高、低濃度或量的區(qū)間-范圍應(yīng)在規(guī)定限度的20%間或定量限至限度的20%間，若含量測定和雜質(zhì)檢查同用一套色譜系統(tǒng)，則線性范圍應(yīng)為雜質(zhì)限度的-20%至含量限度（上限）的+20%

20、間三、雜質(zhì)檢查方法驗證的要求517、耐用性-指測定條件有小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度-HPLC：流動相的組成比例及PH值、不同產(chǎn)家或批號的色譜柱、柱效、柱溫、流速等及被測溶液的穩(wěn)定性、樣品提取的次數(shù)和時間等建議固定上述測定條件的參數(shù)，如柱長、填料的粒度、溫度、流速，甚至品牌-TLC：適當改變展開劑比例及PH值，考察耐用性。如對色譜條件要求苛刻時，規(guī)定最難分離物質(zhì)對試驗-較容易忽略三、雜質(zhì)檢查方法驗證的要求528、溶液的穩(wěn)定性考察-一般在常溫、常光情況下進行，對同份樣品溶液進行時間的測定，以雜質(zhì)量的變化進行考查。-光或溫度引起，應(yīng)在標準中說明避光或?qū)嶒灉囟热?、雜質(zhì)檢查方法驗證的要求53

21、9、系統(tǒng)適用性-理論板數(shù)-柱拖尾因子-難分離物質(zhì)對的分離度-對照品溶液得復(fù)進樣的偏差否則，應(yīng)對色譜系統(tǒng)作必要的調(diào)整或更換色譜柱雜質(zhì)檢查方法驗證實例.doc三、雜質(zhì)檢查方法驗證的要求541、簡單套用被仿制藥的檢查方法，未建立針對性的方法鹽酸偽麻黃堿，分別釆用人工合成與植物提取工藝，有機溶劑殘留量、有關(guān)物質(zhì)均不同2、方法學(xué)驗證不充分-如強制降解條件過于劇烈，無法判斷主峰與降解產(chǎn)物的分離度情況-樣品經(jīng)堿解、氧化破壞后主藥被完全破壞，無法說明其降解物與主峰的分離情況-調(diào)整降解條件的劇烈程度四、雜質(zhì)檢查方法和方法驗證常見問題分析553、檢查方法對雜質(zhì)的控制不全面，尤其是對毒性雜質(zhì)某藥間位和對位異構(gòu)體的檢

22、查脂質(zhì)體溶血磷脂的檢查四、雜質(zhì)檢查方法和方法驗證常見問題分析56案例間位和對位異構(gòu)體的控制合成工藝簡介四、雜質(zhì)檢查方法和方法驗證常見問題分析57合成原料中的異構(gòu)體雜質(zhì)產(chǎn)生的雜質(zhì)四、雜質(zhì)檢查方法和方法驗證常見問題分析58以雜質(zhì)對照品驗證HPLC方法的檢測能力四、雜質(zhì)檢查方法和方法驗證常見問題分析59建議的質(zhì)量保證策略過程控制：控制合成原料的純度終產(chǎn)品控制：檢查終產(chǎn)品殘留的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體四、雜質(zhì)檢查方法和方法驗證常見問題分析60脂質(zhì)體溶血磷脂的檢查四、雜質(zhì)檢查方法和方法驗證常見問題分析614、方法靈敏度不夠-有關(guān)物質(zhì)檢查法的定量限為0.75ng，標準規(guī)定雜質(zhì)限度不得過1.0%，折算為0.5ng，表明此方法不能有效檢測產(chǎn)品雜質(zhì)，需重新建立有效的雜質(zhì)檢測方法5、方法缺乏互補性-合成中重要中間體檢測波長處無吸收，建立的有關(guān)物質(zhì)檢查方法無法檢測該物質(zhì)-建立該中間體適宜的要檢測方法四、雜質(zhì)檢查方法和方法驗證常見問題分析626、積分時間不充分，不能有效檢出雜質(zhì)-氧化破壞試驗中，主峰保留時間的3倍處，仍有降解物峰出現(xiàn)，色譜圖記錄至2倍，不能有效檢出有關(guān)物質(zhì)-改進7、檢測波長缺乏針對性-220nm附近的吸收強度遠高于