微生物實驗三

1、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實驗 Tel: Email:3029130 科教科：1注意！ 本次實驗部分涉及生物危險(糞便中致病微生物)，請謹(jǐn)慎操作(無菌操作)！2內(nèi) 容 提 要 一 腸道桿菌的鑒定（2學(xué)時） 革蘭染色（1片/人），雙糖鐵培養(yǎng) 基接種（8支/室），玻片凝集試驗（1片/人） 二 藥敏試驗（0.5學(xué)時） 介紹及展示示教平板 三 抗酸染色（2.5學(xué)時） 示教，1片/人3一 腸道桿菌的鑒定（2學(xué)時）4病原菌的檢驗程序增菌培養(yǎng)革蘭染色分離培養(yǎng)接種瓊脂斜面純培養(yǎng)采集標(biāo)本生化試驗血清學(xué)試驗動物試驗分析鑒定革蘭染色觀察菌落特征5概念：用生化的方法來檢測細(xì)菌對各種基質(zhì)的代謝作用及代謝產(chǎn)物，借以鑒別細(xì)菌種類，這種生

2、化試驗稱為細(xì)菌的生化反應(yīng)試驗。意義：是鑒別細(xì)菌的重要依據(jù)。1.細(xì)菌的生化反應(yīng)6生化反應(yīng)碳水化合物代謝試驗各種酶類試驗抑菌試驗糖發(fā)酵試驗甲基紅試驗V-P試驗蛋白質(zhì)和氨基酸代謝試驗硫化氫試驗吲哚試驗碳源和氮源利用試驗枸櫞酸鹽利用試驗IMViC試驗7糖發(fā)酵試驗原理 根據(jù)細(xì)菌分解利用糖能力的差異表現(xiàn)出是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣作為鑒定菌種的依據(jù)。是否產(chǎn)酸，可在糖發(fā)酵培養(yǎng)基中加入指示劑溴甲酚紫（即B.C.P指示劑，其pH在5.2以下呈黃色，pH在6.8以上呈紫色），經(jīng)培養(yǎng)后根據(jù)指示劑的顏色變化來判斷。是否產(chǎn)氣，可在發(fā)酵培養(yǎng)基中放入倒置杜氏小管觀察。81、確定細(xì)菌是否生長2、產(chǎn)酸，則培養(yǎng)基指示劑（溴甲酚紫）變?yōu)辄S色，以

3、“+”表示。3、產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，則培養(yǎng)基除變黃外，在倒置的小管中有氣泡，用“”表示。4、不發(fā)酵糖類，培養(yǎng)基仍為紫色，小管內(nèi)無氣泡，以“-”表示。 結(jié)果方法 取糖發(fā)酵管培養(yǎng)基，此時培養(yǎng)基應(yīng)呈澄清、紫色，倒立小管內(nèi)無氣泡，接種細(xì)菌后置37溫箱培養(yǎng)1824小時，觀察結(jié)果。 910硫化氫產(chǎn)生試驗 原理 某些細(xì)菌能分解蛋白質(zhì)中的含硫氨基酸，如半胱氨酸、甲硫氨酸，而生成硫化氫。硫化氫遇培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽，形成黑色的硫化鉛或硫化亞鐵沉淀物。方法 分別穿刺接種大腸桿菌、傷寒桿菌至兩管雙糖鐵培養(yǎng)基中。37孵育24小時后觀察結(jié)果。11結(jié)果 沿穿刺線部位呈黑褐色，表明有硫化氫產(chǎn)生，為陽性以“+”表示， 不變色者為陰性

4、，以“-”表示。 大腸桿菌：- 傷寒桿菌：+122.腸道桿菌的鑒定實驗?zāi)康模?熟悉病原性桿菌的一般鑒定過程13糞 便增菌培養(yǎng)（必要時） SS 培養(yǎng)基 雙糖鐵培養(yǎng)基 生化反應(yīng)血清學(xué)鑒定腸道桿菌的鑒定程序已完成革蘭染色14大腸桿菌在SS平板上的菌落特點；傷寒桿菌在SS平板上的菌落特點；（1）觀察SS平板上菌落特點 SS平板大腸桿菌 粉紅色大菌落痢疾桿菌 無色細(xì)小 半透明菌落傷寒桿菌 無色細(xì)小 半透明菌落15（2） 雙糖鐵培養(yǎng)基接種雙糖鐵培養(yǎng)基成分含有乳糖和葡萄糖：產(chǎn)酸產(chǎn)氣含有硫酸亞鐵：如細(xì)菌分解含硫氨基酸生成 硫化氫，可形成黑色沉淀酚紅指示劑： 酸：黃 堿：紅 16各菌的生長特點1)大腸桿菌發(fā)酵乳

5、糖和葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣（糖發(fā)酵試驗），是斜面及底層均呈黃色并有氣泡。2) 沙門菌和志賀菌只發(fā)酵葡萄糖，不發(fā)酵乳糖，分解葡萄糖產(chǎn)的酸使培養(yǎng)基pH下降，酚紅指示劑變黃，但是培養(yǎng)基中的葡萄糖僅有0.1%，在斜面的酸性物質(zhì)被氧化成揮發(fā)性酸，且細(xì)菌氧化氨基酸物質(zhì)產(chǎn)生的氨的中和作用，使斜面變紅，而底層則為黃色。17雙糖鐵培養(yǎng)基接種方法 將可疑菌落接種于雙糖鐵培養(yǎng)基上（穿刺+斜面 ），37度培養(yǎng)24小時，第二天觀察結(jié)果。18雙糖鐵培養(yǎng)基上各菌的生長現(xiàn)象大腸桿菌黃色有氣泡傷寒桿菌上紅下黃中間有黑色沉淀福氏痢疾桿菌上紅下黃19沖洗染色完成之后，在涂片區(qū)滴上香柏油使用油鏡觀察實驗結(jié)果（3）革蘭染色方法與步驟 1、細(xì)菌

6、涂片的制備 涂片 干燥 固定 2、染色 初染（結(jié)晶紫） 媒染（盧戈氏碘液） 脫色（95%乙醇） 復(fù)染（稀釋石碳酸復(fù)紅） 吸水紙吸干 1min1min30s30s沖洗沖洗沖洗20（4）傷寒桿菌玻片凝集試驗原理： 當(dāng)顆粒性抗原與其相應(yīng)的抗體特異結(jié)合時，在電解質(zhì)存在下，兩者比例合適時，可出現(xiàn)凝集顆粒，此現(xiàn)象稱凝集反應(yīng)。21試劑與器材沙門氏菌屬AE群多價O血清，SS平板上菌落，玻片、消毒缸、酒精燈，記號筆等。方法 1.取清潔玻片一張，用記號筆劃分成兩部分。用移液槍分別在兩邊加沙門氏菌屬A-E群多價O血清8微升。 2.無菌操作下用接種環(huán)分別取少許SS平板上菌落（黑色或無色菌落，以及粉紅色大菌落）與血清混

7、合成均勻乳狀(注意：取菌量不宜過多，使懸液呈輕度乳濁即可)。 3.輕輕搖動玻片，經(jīng)1-2min后觀察結(jié)果。22注意事項：注意涂菌時，標(biāo)明菌落，以免混淆產(chǎn)生錯誤結(jié)果。記錄結(jié)果之后，將玻片放入含消毒液的指定容器內(nèi)，切勿任意放置或沖洗。 結(jié)果觀察液體變清，并有乳白色凝集塊出現(xiàn)者為陽性。液體仍然混濁，無凝集塊出現(xiàn)者為陰性。如待檢菌與沙門氏菌屬A-E群多價O血清發(fā)生凝集，則該菌為沙門氏菌屬。23（5）結(jié)果判斷 SS平板：菌落的形態(tài)，顏色； 雙糖鐵培養(yǎng)基上生化特點； 革蘭染色：形態(tài)，排列，染色特點； 玻片凝集試驗結(jié)果 24本次實驗所做內(nèi)容桿菌鑒定觀察菌落特征（SS平板）取可疑菌落做革蘭染色 4片/臺 將可

8、疑菌落接種于雙糖鐵培養(yǎng)基上（穿刺+斜面 ），37度 培養(yǎng)24小時，觀察結(jié)果. 1支/臺傷寒桿菌玻片凝集試驗25二 藥敏試驗（0.5學(xué)時）26目的要求1.掌握紙片擴(kuò)散法藥敏試驗的原理及結(jié)果判定2.了解藥敏試驗的操作方法和意義27原理含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后便不斷地向紙片周圍區(qū)域擴(kuò)散，形成遞減的濃度梯度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的細(xì)菌的生長被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度。28主要材料1.大腸桿菌菌液普通瓊脂平板2.含抗生素的濾紙片： 青霉素 氯霉素 鏈霉素 慶大霉素29方法標(biāo)記分區(qū)密涂接種貼片培

9、養(yǎng)結(jié)果觀察301.標(biāo)記分區(qū)底部觀312.密涂接種 分三次接種，每次取一環(huán)。第一次密涂接種后旋轉(zhuǎn)60度二次密涂接種，然后同方向旋轉(zhuǎn)60度后再次密涂接種。頂部觀323.貼片底部觀334.培養(yǎng)置37溫箱， 倒置培養(yǎng)18h-24h34青霉素鏈霉素慶大霉素氯霉素 五、 結(jié)果 抑菌圈抑菌圈直徑35結(jié)果觀察抑菌圈直徑15mm 高度敏感抑菌圈直徑10-15mm 中度敏感抑菌圈直徑10mm 低度敏感無抑菌圈 不敏感或耐藥36注意事項接種時均勻密涂貼片時，用無菌鑷子輕輕觸壓藥物紙片使之與培養(yǎng)基充分接觸貼片后不能再更改紙片位置鑷取藥物紙片時一旦掉到培養(yǎng)基表面，則繼續(xù)保持其位置，切勿鑷起重新放置，以防不同抗生素交叉影

10、響整個貼片過程應(yīng)在15min內(nèi)完成37一、實驗?zāi)康模?、掌握細(xì)菌涂片標(biāo)本的制備2、掌握抗酸染色的原理和方法三 抗酸染色38分枝桿菌的細(xì)胞壁內(nèi)含有大量的脂質(zhì)，主要是分枝菌酸，它包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌一般不易著色，要經(jīng)過加熱和延長染色時間來促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結(jié)合后，就很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。齊-尼氏抗酸染色法是在加熱條件下使分枝菌酸與石炭酸復(fù)紅牢固結(jié)合成復(fù)合物，用鹽酸酒精處理也不脫色。當(dāng)再加堿性美蘭復(fù)染后，分枝桿菌仍然為紅色，而其他細(xì)菌及背景中的物質(zhì)為蘭色。二、實驗原理：39三、實驗材料：細(xì)菌：卡介苗 （Bacillus Calmette-Guerin， BCG）染液：石炭酸復(fù)紅液、3%鹽酸酒精、堿性美蘭溶液其它：接種環(huán)、酒精燈、載玻片等40四、實驗方法：1、細(xì)菌涂片標(biāo)本的制備 涂片 干燥 固定2、染 色1）初染：用玻片夾夾持涂片標(biāo)本，滴加石炭酸復(fù)紅2-3滴，在火焰高處徐徐加熱，切勿沸騰，出現(xiàn)蒸汽即暫時離開，若染液蒸發(fā)減少，應(yīng)再加染液，以免干涸，加熱3-5分鐘，待標(biāo)本冷卻后用水沖洗。2）脫色： 3%鹽酸酒精脫色301；用水沖洗。3）復(fù)染：用堿性美蘭溶液復(fù)染1；用水沖洗后用吸水紙吸干。413、油鏡觀察未染色 初染后 脫色后 復(fù)染后初染脫色復(fù)染鏡檢42五、實驗結(jié)果：結(jié)核桿菌呈紅色，常堆積成團(tuán)，排列無序，偶呈分枝