正常細胞的培養(yǎng)技術(miao)

1、正常細胞，不管是來自人或動物的細胞，在體外培養(yǎng)時都不易生長，建立細胞系更難，因為它們是已分化的細胞，對體外生存條件要求嚴格，目前體外模擬的培養(yǎng)條件都還達不到與體內(nèi)相一致的要求。正常細胞在體外并非不能培養(yǎng)，只要各種條件適當仍然有培養(yǎng)成功的可能，初代培養(yǎng)較傳代細胞系容易。正常細胞培養(yǎng)可用于許多方面，如研究細胞代謝、物理、化學、生物因素的影響，作為 觀察和檢測手段研究活細胞的變化變異、分化，可從細胞水平開展亞細胞結構和代謝分子的表達，也可大量培養(yǎng)用于生物制品的生產(chǎn)，等等。一、上皮細胞培養(yǎng)上皮細胞可來源于外、內(nèi)、中三個胚層，其中來源于內(nèi)外胚層的上皮細胞可呈膜狀生長。不同器官的上皮細胞均具有不同的特定的

2、功能，培養(yǎng)上皮細胞不僅有利于研究其功能，還可為燒傷、燙傷的皮膚進行上皮膜層移植，加速傷口愈合，不留疤痕，在皮膚美容方面也具有潛在的應用價值。上皮細胞培養(yǎng)有三個難點：需特殊底物 如需在底層涂以膠原或鋪上飼養(yǎng)層細胞，以利于生長。需特殊的培養(yǎng)液 如加濃縮維生素及氨基酸的EMEM及KGM培養(yǎng)消化上皮細胞、EGM培養(yǎng)一般上皮細胞等，價格昂貴。與上皮細胞混雜的成纖維細胞的過度生長，常常干擾上皮細胞在體外的培養(yǎng)使其難以長期生存。為此，需要從表皮別離、培養(yǎng)液和基質(zhì)底物的選擇、增加適當生長因子等方面著手，以抑制成纖維細胞生長，促進上皮細胞生長。由此可見，要純化和延長上皮細胞生存期，抑制成纖維細胞生長或去除或減少

3、成纖維細胞是上皮細胞培養(yǎng)成功的關鍵。(一)表皮細胞別離與培養(yǎng)皮膚是表皮細胞的重要來源，小兒陰莖包皮是表皮培養(yǎng)的好材料。目前，全皮培養(yǎng)混有大量成纖維細胞，因而不采用，常采用皮膚表皮和真皮別離培養(yǎng)法可獲得純上皮細胞。 1無菌條件下切取皮膚標本，以角化層薄者為佳，早產(chǎn)、流產(chǎn)胎兒皮膚更好。 2將皮塊置于消化液中進行消化，此時表皮層與真皮層自然別離，表皮層為淺棕色，真皮層為白色。 3取出表皮層再進行第二次消化 。 4待充分消化后，剪碎移至瓶內(nèi)參加適量培養(yǎng)液，吹打分散制成細胞懸液，用不銹鋼紗網(wǎng)過濾，調(diào)整細胞濃度，用含15%胎牛血清的培養(yǎng)液進行分瓶培養(yǎng)，3天后可見大局部上皮細胞貼壁生長。 (二)乳腺上皮細胞

4、別離培養(yǎng)乳腺主要由腺上皮組成，早期乳汁或斷奶后的乳汁含有上皮細胞團塊，可用離心法收集上皮細胞，培養(yǎng)時常用人胚小腸成纖維細胞作飼養(yǎng)層可抑制間質(zhì)細胞生長。 (1) 取材， 于產(chǎn)后27天收集乳汁1:1的比例與培養(yǎng)基混合。 (2) 低速離心，仔細去除上清，收集細胞。 (3) 細胞洗滌后置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。 (4) 35天更換培養(yǎng)基，待細胞長滿后可消化、傳代 。 (5) 用乳腺細胞培養(yǎng)上皮細胞時，注意：應盡可能去除脂肪組織，如果標本中纖維組織較多，可用膠原酶消化法獲取細胞，初時有巨噬細胞存在，可作飼養(yǎng)層細胞，培養(yǎng)時也可用經(jīng)照射或用絲裂霉素C處理過的3T3細胞作飼養(yǎng)層細胞，或用膠原層，培養(yǎng)液中也可加刺激生長

5、因子如EGF、胰島素、氫化可的松、豬促乳素和前列腺素E1等，有利于細胞生長繁殖。 表皮細胞生長融合成片，并向復層開展 表皮細胞貼壁生長，呈多邊形，不規(guī)那么(三)子宮頸上皮細胞別離培養(yǎng)子宮頸上皮細胞體外培養(yǎng)在細胞癌前病變及致癌的研究中有重要意義 。常用組織塊法進行原代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)需用經(jīng)照射或絲裂霉素C處理的3T3細胞作滋養(yǎng)層。培養(yǎng)液需添加適當?shù)拇碳どL的添加物。 1收集活檢標本， 盡可能防止污染。2洗滌、剪碎，去除纖維組織。337培養(yǎng)10天以上，組織塊貼壁，參加EGF并用此培養(yǎng)液換液。4消化、分散、傳代培養(yǎng)。(四) 肝細胞別離培養(yǎng)可用組織塊法和原位灌注消化法收獲肝細胞進行原代培養(yǎng)，其形態(tài)規(guī)那么

6、，適于作多種功能的研究。肝臟原位灌注消化法：從門靜脈或其分支中插管，用無鈣、鎂PBS沖洗肝臟15分鐘，然后用膠原酶液灌注15分鐘，使纖維組織網(wǎng)被消化，經(jīng)過23次離心別離，可獲得大量肝細胞懸液。培養(yǎng)時可將肝細胞接種在游離漂浮的膠原薄片上，細胞能較好地表達其功能 。 (五) 胰腺細胞別離將獲取的胰臟標本修剪切碎后消化，并使之浮于牛血清白蛋白溶液上，經(jīng)過3次離心別離收集細胞，在水浴槽中用旋轉法使細胞聚集224h，接種涂布了膠原的培養(yǎng)皿，可獲得體外培養(yǎng)的胰腺細胞。 此法可用于家鼠和人胰腺細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)時采用照射過的肺成纖維細胞作為飼養(yǎng)層，效果更佳。 (六) 氣管及支氣管上皮細胞別離培養(yǎng)在血清存在條件下

7、，正常人氣管上皮細胞停止分裂和生長分化，因此需用無血清培養(yǎng)基(LHC-9),可使組織碎塊的氣管上皮細胞生長，并且抑制纖維細胞生長。 (七) 前列腺細胞培養(yǎng)前列腺細胞的培養(yǎng)，關鍵是改進培養(yǎng)液的成分，參加激素樣生長因子，以刺激前列腺細胞生長，抑制纖維細胞生長，可用于研究前列腺的生長和功能。 (八) 口腔粘膜上皮細胞培養(yǎng)口腔粘膜上皮為復層鱗狀上皮，體外培養(yǎng)口腔粘膜上皮細胞的關鍵是：用膠原酶消化法使鱗狀上皮細胞層與底層的間質(zhì)分開，再進一步用胰蛋白酶消化法使鱗狀上皮細胞別離為單細胞懸液，然后在角化細胞培養(yǎng)液(KGM)中培養(yǎng)。 (九) 胃上皮細胞培養(yǎng)培養(yǎng)正常人胃上皮細胞對研究胃癌癌變機理有很大應用價值。但

8、培養(yǎng)難度大，培養(yǎng)成功要注重三點：第一，用膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化法，并用消化細胞；第二，應用膠原底物培養(yǎng)；第三，制備含有特定成分的培養(yǎng)基。 胃上皮細胞培養(yǎng)多加血清并不能促進細胞生長，可能與血清中含有抑制上皮細胞生長的TGF-1有關。完全培養(yǎng)基中添加的許多種成分和生長因子，可利于上皮細胞生長，而且呈現(xiàn)對胞外基質(zhì)ECM的依賴性，尤以型膠原對胃上皮細胞作用更好。 二、中胚層細胞培養(yǎng)中胚層細胞培養(yǎng)包括結締組織、肌肉組織、骨組織、骨髓細胞、內(nèi)皮細胞、血細胞等的培養(yǎng)。(一)結締組織細胞在細胞培養(yǎng)中包括人在內(nèi)的結締組織細胞(如成纖維細胞等)都很容易培養(yǎng)成功，也是其他組織培養(yǎng)時的副產(chǎn)物，無需特殊的培養(yǎng)條件，常規(guī)

9、培養(yǎng)即可。其生物學特性穩(wěn)定，不易發(fā)生轉化，成為二倍體細胞的主要來源，人的二倍體細胞系主要為成纖維細胞。為獲取大量成纖維細胞，用人和動物胚體為好。動物可用鼠胚或雞胚，人胚可取皮膚(包皮或胎兒皮膚)、肺、腎，這些都是很好的研究和應用對象。1、人胚肺細胞別離培養(yǎng)人胚肺細胞可建立二倍體細胞系，可用于病毒疫苗的生產(chǎn)和研究，還可用來生產(chǎn)-干擾素(IFN-)等生物制品。 傳代培養(yǎng)能穩(wěn)定生長，但有壽命限制，一般可連續(xù)傳至6515代左右。染色體數(shù)為2n=46條，通常以1:2傳代后，一周內(nèi)可形成單層，其形態(tài)和生長特性穩(wěn)定，無致瘤性，對某些病毒敏感，但本身無潛在病毒和支原體污染。國際公認的人胚肺二倍體細胞系為WI-

10、38和MRC-5等。 人胚肺細胞的別離和培養(yǎng)方法如下： (1)取妊娠35個月人工流產(chǎn)的正常胎 兒，無菌取肺組織。 (2) 洗滌、剪切、消化，常規(guī)培養(yǎng)，注 意觀察細胞的形態(tài)、密度變化，及時換液、傳代。2、人胚腎細胞別離培養(yǎng)人胚腎細胞利用腎臟的皮質(zhì)細胞經(jīng)胰蛋白酶消化分散后制成，該細胞呈類梭形，細胞界限較模糊，消化時間要控制好，原代培養(yǎng)時血清濃度以20%為宜，貼壁較牢固，傳代培養(yǎng)時，消化時間可適當延長。細胞來自于妊娠35個月人工流產(chǎn)的正常胎兒 ，無菌取得。3、人羊膜細胞別離培養(yǎng)人羊膜細胞目前已建立了細胞系，通過轉化后，可以無限制傳代，常用FL、Wish人羊膜細胞別離、繁殖某些病毒，并用來測定干擾素的

11、效價。正常的人羊膜細胞也易于培養(yǎng)。 細胞來自于剖腹產(chǎn)、順產(chǎn)胎兒或新生兒的胎盤中的羊膜。4、實驗室也經(jīng)常使用幼地鼠腎細胞、鼠胚及地鼠胚成纖維細胞、雞胚纖維母細胞等，這些細胞的別離培養(yǎng)與人細胞的別離培養(yǎng)根本方法是一樣的。 (二) 肌肉組織細胞骨骼肌、心肌和平滑肌細胞都可在體外培養(yǎng)中生長，心肌細胞在培養(yǎng)的最初幾天還具有自動節(jié)律性收縮功能，傳代培養(yǎng)時可能會逐漸喪失這種功能。平滑肌細胞可通過胰蛋白酶或膠原酶消化法從血管氣管壁及腸壁中獲得。骨骼肌可從四肢中獲得。肌細胞含有數(shù)種抗原標記物，如肌漿球蛋白、原肌凝蛋白等。肌動蛋白等可在大多數(shù)細胞中發(fā)現(xiàn)，但并非細胞的特有標記物，肌細胞分化時肌酸磷酸酶活性升高 。1

12、、骨骼肌細胞別離培養(yǎng)動物胚或幼體四肢，特別是大腿肌組織為最好的培養(yǎng)材料，取材常用生后12天的乳鼠Wistar大鼠更好。人骨骼肌細胞來源最好是人工流產(chǎn)的孕期為35個月的健康胎兒肢體。無菌取肌組織，洗滌、剪切、消化。常規(guī)培養(yǎng)，注意觀察細胞形態(tài)、數(shù)量的變化，及時換液、傳代。肌肉細胞成片后，可用胰蛋白酶消化分散，進行傳代培養(yǎng)，可傳1020代。 2、心肌細胞培養(yǎng)心肌組織是最早利用的培養(yǎng)材料之一，最常用的是孵育1012天的雞胚心肌，新生大鼠、乳鼠及人胎兒心肌等。心肌是比較容易培養(yǎng)和生長的組織，可應用多種方法進行培養(yǎng)，如懸滴培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法等。主要是取心室肌培養(yǎng)，消化別離方法與前相同。 (三)

13、各種骨細胞別離培養(yǎng)包括軟骨細胞別離培養(yǎng)、成骨細胞別離培養(yǎng)和破骨細胞別離培養(yǎng)等。1、軟骨細胞別離培養(yǎng)軟骨分為生長部和休止部，其中生長部軟骨細胞在體外培養(yǎng)條件下代謝較活潑，具有形成軟骨基質(zhì)的功能和成骨細胞的某些特性。軟骨細胞埋藏于致密的糖蛋白軟骨基質(zhì)中，必須經(jīng)過一系列酶消化,才能獲得少量細胞，在呈弱堿性并增加Mg+濃度的培養(yǎng)液中易于生長 。操作要點是：切碎軟骨組織，用透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶和膠原酶消化兩遍以除去基質(zhì)，再用膠原酶長時間消化，收集細胞，按常規(guī)貼壁單層細胞培養(yǎng)法，培養(yǎng)于弱堿性的F12培養(yǎng)液中。 體外培養(yǎng)的軟骨細胞，很像上皮樣細胞，可形成具有折光性的細胞外基質(zhì)，經(jīng)甲苯胺蘭染色呈異染性。細胞組

14、織化學染色：軟骨細胞可以特異性合成葡萄糖胺聚糖(GAG),型和型膠原，并具有堿性磷酸酶活性(免疫組化陽性)，也可用定量法測出其含量。 2、成骨細胞別離培養(yǎng)骨細胞是一種終末化的細胞，埋藏于骨基質(zhì)中，從皮質(zhì)骨中別離培養(yǎng)骨細胞至今未見報導，只是在胎鼠或雞胚顱骨細胞培養(yǎng)時見到少量星狀細胞，呈花邊樣網(wǎng)狀結構。在某些激素(如甲狀旁腺素)的作用下或無血清培養(yǎng)中，這些細胞可變?yōu)閳A形，二羥基維生素D3可以刺激某些成骨樣細胞變?yōu)樾菭睢９羌毎梢院统晒羌毎黄饛奶ナ蠡螂u胚顱蓋骨上別離出來，也可由體外培養(yǎng)的成骨細胞分化而來，陽性的細胞剛別離時為圓形，貼壁生長變?yōu)樾切?，具有胞漿突起，數(shù)日后胞突連成網(wǎng)狀，使星形細胞相互連

15、接，不依賴于細胞外基質(zhì)。 成骨細胞包繞在硬組織中，致使處理困難，用骨組織塊法、酶消化法、骨膜組織法、骨髓培養(yǎng)法以及薄層骨片經(jīng)EDTA處理，并經(jīng)膠原酶消化，均可別離培養(yǎng)出成骨細胞，體外培養(yǎng)的成骨細胞保持有骨組織細胞的某些特性。3、破骨細胞別離培養(yǎng)破骨細胞的研究說明，脾臟和骨髓中單個核細胞可以互相融合形成多核的破骨細胞，隨血流到達破骨細胞活動活潑的部位，在新生動物的長骨內(nèi)面反復沖洗或用膠原酶消化，新生動物的顱蓋骨都可獲得破骨細胞，用骨髓培養(yǎng)法也可使單個核細胞分化為破骨細胞。(四) 骨髓細胞的別離培養(yǎng)骨髓可分為造血干/祖細胞和基質(zhì)細胞兩類，均可在體外進行培養(yǎng)，擴增和開展細胞定向分化的研究。骨髓基質(zhì)細

16、胞在骨髓中可為造血干/祖細胞提供微環(huán)境，可分泌許多種細胞因子，對造血干/祖細胞的分化起著獨特的支持作用。此外，骨髓基質(zhì)細胞還與成骨效應密切相關，目前認為骨髓基質(zhì)細胞有內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、網(wǎng)狀細胞、脂肪細胞或骨細胞和破骨細胞等，因此，對開展成骨效應、成骨細胞分化和上述各類細胞的別離、鑒定及其功能的實驗研究，已引起科研人員和臨床醫(yī)生的極大興趣。體外大量擴增骨髓基質(zhì)細胞應用于臨床治療骨不連及軟骨缺損具有廣闊的應用前景。 1、骨髓細胞來源新生動物及胚胎骨的骨髓，人和胎兒的骨髓，成人取自術后骨，胎兒取自流產(chǎn)胎兒骨的骨髓或臨床上抽骨髓檢查時剩余的骨髓或自愿供骨髓者。2、骨髓細胞的別離培養(yǎng)骨髓中的細胞，一

17、類為不能貼壁、在培養(yǎng)基中懸浮生長的造血干/祖細胞、淋巴細胞、紅細胞，另一類為能緩慢貼壁生長的骨髓基質(zhì)細胞，這兩類細胞不僅形態(tài)上有明顯差異，而且別離培養(yǎng)方法、條件以及功能應用性研究也有所不同。 體外培養(yǎng)的骨髓細胞中紅系集落形成單位CFUE體外培養(yǎng)的骨髓細胞中單核巨噬細胞集落形成單位CFUGM 培養(yǎng)4d的骨髓基質(zhì)細胞伸展生長、呈長菱形肌樣外觀培養(yǎng)1周的骨髓基質(zhì)肌樣細胞網(wǎng)狀 懸浮生長的造血干/祖細胞，假設在骨髓培養(yǎng)的細胞中參加不同細胞因子，如G-CSF或M-CSF或EPO，同時均參加IL-3、IL-6，在軟瓊脂和甲基纖維素半固體培養(yǎng)基的24孔板中可形成不同的集落，這種試驗既可用于測定細胞因子的效價，

18、又可檢查骨髓細胞的造血功能，同時也可從細胞中抽提總RNA，通過RT-PCR，可克隆相應的基因。此外，還可用于測定對化療藥物的敏感性和耐藥性 。這些細胞在多種細胞因子的作用下，其中的造血干細胞在體外既保持其分化潛能又大量擴增，可用于骨髓移植。 經(jīng)體外培養(yǎng)貼壁的骨髓基質(zhì)細胞，可用于細胞因子自分泌和誘導分泌能力的測試。骨髓基質(zhì)細胞能分泌多種調(diào)節(jié)免疫和造血功能的細胞因子，證明基質(zhì)細胞能支持造血、提供造血微環(huán)境，也為體外擴增干細胞用于骨髓移植提供了新技術、新方法。擴增的基質(zhì)細胞不僅可直接應用于臨床治療骨髓抑制、成骨能力障礙性疾病，而且可通過基因?qū)敕ㄩ_展基因治療的研究。五內(nèi)皮細胞的別離培養(yǎng)內(nèi)皮細胞在血管

19、內(nèi)形成單層內(nèi)外表，標本來源多為牛主動脈、牛腎上腺皮質(zhì)毛細血管、鼠腦皮質(zhì)毛細血管、人臍靜脈以及人皮膚和脂肪的毛細血管。采用血管內(nèi)注入膠原酶的灌流消化法，可使內(nèi)皮細胞別離，然后培養(yǎng)在鋪有明膠基質(zhì)的培養(yǎng)器皿中，如果標本來源是毛細血管，培養(yǎng)時需參加有絲分裂原，假設來源于大血管那么不用加。內(nèi)皮細胞易于從血管別離進行培養(yǎng)成單層，對研究內(nèi)皮細胞再生長、腫瘤促血管生長因子TAF等有很大應用價值。(六) 血液細胞別離培養(yǎng)正常血細胞在體外培養(yǎng)生長時間短，只有白血病、血友病、淋巴瘤細胞可培養(yǎng)成功并建立細胞系，但多半為EB病毒等致瘤病毒引起的轉化細胞(EBNA檢查陽性)，DMSO處理也可誘導這些細胞分化發(fā)生逆轉，轉化

20、為正常細胞。所建立的細胞系多半為單核細胞系、B淋巴細胞系、T淋巴細胞，在IL-2產(chǎn)品問世后，T細胞也可在體外建系、建株。 血細胞可從外周血中用梯度別離液通過離心分層后別離獲得，也可從脾臟、扁桃體、淋巴結中用機械法切碎過篩別離獲得淋巴細胞，從腹腔刺激后的沖洗液中可獲得多量的單核一巨噬細胞，從骨髓中可以獲得前體血細胞，并可長期培養(yǎng)生長，參加生長因子或某些物質(zhì)有利于細胞純化并促進分化和生長繁殖。 1、外周血細胞別離培養(yǎng)外周血中除紅細胞外，還有粒細胞、單核細胞和淋巴細胞及血小板等，通常是別離白細胞、淋巴細胞、血小板的重要來源。其別離方法有四種：即自然沉降法、差異沉降法、氧化別離法、Ficoll分層法。

21、Ficoll別離法 采用Ficoll和泛影葡胺配制而成的淋巴細胞別離液，通過2000r/min離心后可使血細胞以不同比重將其別離開，如別離淋巴細胞可選用比重的別離液，假設別離血小板可用比重的別離液，假設別離骨髓中的單核細胞常用比重的別離液。 外周血中淋巴細胞的別離1500rpm, 20, 30min2、淋巴器官中的淋巴細胞的別離從人脾臟、淋巴結、扁桃體或胸腺等器官中制備淋巴細胞懸液，在免疫學研究中是經(jīng)常需要的。將淋巴器官剪成碎塊，用鑷子壓擠或在金屬絲網(wǎng)上研磨，或用玻璃勻漿器研磨，制成懸液，再用Ficoll別離法別離細胞，洗滌、計數(shù)，備用。 用上述別離法所獲得的細胞、淋巴細胞，可用于白細胞粘附移

22、動試驗、轉化試驗、細胞毒試驗，同時用于細胞因子的誘生和制備，或擴增外周血造血細胞、樹突狀細胞、LAK細胞、T細胞等，供細胞移植用。3、人臍帶血細胞別離培養(yǎng)人臍帶血來源方便，臍血的血漿中富含許多高水平的造血活性物質(zhì)，具有刺激和促進骨髓造血干/祖細胞增殖、分化和再植能力，是造血生長因子的重要來源。臍血中富含類似于骨髓的造血干細胞，具有很強的自我復制和再植能力。臍血中還含有類似于骨髓的基質(zhì)細胞，對骨髓造血具有支持作用，在體外培養(yǎng)擴增中具有更大的增殖能力，是造血干細胞移植的理想來源，已被應用于許多血液病和惡性腫瘤的治療，并容易獲得骨髓造血功能的重建。目前，不少單位建立臍血庫，以不斷滿足研究和臨床應用。4、巨噬細