D熒光素體外操作手冊(cè)

1、注：以下翻譯僅供參考，最終使用者請(qǐng)以英文原文說(shuō)明書為準(zhǔn)！D-熒光素體外操作手冊(cè)介紹熒光素是一種常用的熒光素酶表達(dá)的活體成像生物發(fā)光報(bào)告子。以ATP和Mg2+作為輔因子，有氧條件下熒火蟲熒光素酶與水溶性底物反應(yīng)發(fā)出一種特有的黃綠色發(fā)射光，在37C活體內(nèi)轉(zhuǎn)換為紅光。該反應(yīng)通過(guò)消耗ATP來(lái)指示是否存在能量或生命的存在。由于螢火蟲熒光素酶的超靈敏性，快速和易于使用的體系，在研究基因表達(dá)方面螢火蟲熒光素酶是最常用的報(bào)告基因之一。熒光素酶被用來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)菌，培養(yǎng)細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物或動(dòng)物的啟動(dòng)子活性反應(yīng)。熒光素酶是一個(gè)61kDa大小的蛋白，它的活性形式是單體，且不需要其它的加工修飾。通過(guò)催化熒光素的氧化羧化作用，

2、螢火蟲熒光素酶會(huì)產(chǎn)生已知的生物發(fā)光中最高效的反應(yīng)之一。熒光素酶活性用來(lái)描述與啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件相聯(lián)的基因調(diào)控。通過(guò)優(yōu)化，化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的光和調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄活性之間存在直接相關(guān)性。對(duì)于體外報(bào)告系統(tǒng)熒光素酶活性的檢測(cè)，此手冊(cè)將提供一個(gè)簡(jiǎn)單的，經(jīng)濟(jì)可靠的方法。TranslationGQI【的*inwresOLuciferin(Substrate)LuciferaseEnzymePromoterLucileira&eExpressiion=PramioterAetivity/GOGActivityLifihtGeneExpressionSystemTranslationGQI【的*inwresOLu

3、ciferin(Substrate)LuciferaseEnzymePromoterLucileira&eExpressiion=PramioterAetivity/GOGActivityLifihtGeneExpressionSystemPromoterActivitySystemTranscription|Lysedcolls之前我們建議用pH7.8的緩沖液，并且所有試劑在室溫下預(yù)熱。為充分反應(yīng)，我們建議在分析緩沖液中加入過(guò)量的ATP和Mg2+。當(dāng)熒光素加入到熒光素酶樣品中，會(huì)看到瞬間閃光在0.3-0.5秒內(nèi)達(dá)到峰值強(qiáng)度。這光將隨著半衰期0.5-1.0分鐘左右很快消失。但是初始如果在分析b

4、uffer中加入輔酶A,將能阻止快速反應(yīng)延長(zhǎng)半衰期至2-5分鐘。如果在反應(yīng)混合液中后加輔酶A，將促進(jìn)額外的，次級(jí)發(fā)光(Fraga,2008)。iCKK)Th#klnctleprofileofLuclfervwwhhhighmlMtrateconcentrationsiCKK)Th#klnctleprofileofLuclfervwwhhhighmlMtrateconcentrations(1B0|iMATP,0|jMLucifertn)鼻ndthevffpciof嶺0胡CoAtifter1minute“a取日H.Firefly4umiiresceAhisliCHrlcalpcripeclilv

5、earKlIrecentdevplopmerrti-P/ioccJchrfPJceJicwpcrr,7iL在GoldBio,我們建議用以YuichiOba,etal.(2003)為基礎(chǔ)的熒光素酶分析buffers：-100mMTris-HCl(pH7.8)-5mMMgCl2-250uMCoA-150uMATP(Fraga,2008)-150ug/mld-Luciferin(啟維益成)一些研究者在分析buffer中也加入其它成份，比如DTT或EDTA(Steghans,1998)。根據(jù)您具體需要可以適當(dāng)調(diào)整分析buffer。為得到最佳結(jié)果，根據(jù)您具體細(xì)胞我們建議先做一個(gè)動(dòng)力學(xué)曲線的初步測(cè)試。產(chǎn)品

6、具體信息D-熒光素鉀鹽4，5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylicacidpotassiumsaltKCHNOS117232分子量：318.42g/molD-熒光素鈉鹽4，5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylicacidsodiumsaltNaC11H7N2O3S2.H2O分子量：320.32g/mol儲(chǔ)存：-20C避光保存。材料D-LuciferinsaltforGoldBioLuciferinStockSolution(GLSS

7、)熒光素鉀鹽(啟維益成,G156410)熒光素鈉鹽(啟維益成,G156411)GoldBioLuciferaseAssayBuffer(TMCA)Tris-HCl,pH7.8MgCl2CoenzymeA(CoA)(hydrate)ATP(disodiumsalthydrate)GLSS(GoldBioluciferinStockSolution)PBS(不含Ca2+或Mg2+)細(xì)胞裂解buffer熒光素酶(對(duì)照)GoldBio熒光素儲(chǔ)備液(GLSS)的制備用分子生物學(xué)級(jí)水配成15mg/ml(100X)熒光素儲(chǔ)備液a.為最佳結(jié)果，熒光素儲(chǔ)備液最好現(xiàn)配現(xiàn)用，但如果分成小份儲(chǔ)存在-80C可最長(zhǎng)保存一

8、個(gè)月。在熒光素酶熒光分析中熒光素底物的終濃度應(yīng)該是：150ug/ml(471uM熒光素鉀鹽或468uM熒光素鈉鹽)GoldBio熒光素酶分析buffer(TMCA)制備與TMCA混合之前用分子生物學(xué)級(jí)水制備所有試劑儲(chǔ)備液制備500mMMgCl2(100X)溶液稱取476.05mg(95.21g/mol)的MgC溶于10ml水中。溶液儲(chǔ)存于室溫。制備25mMCoA(100X)溶液稱取191.88mg(767.53g/mol)輔酶A并溶于10ml水中。用5-10ml水先預(yù)濕0.2um濾膜。通過(guò)預(yù)濕的濾膜濾滅100X輔酶A并存于-20Co制備15mMATP(100X)溶液a.稱取82.67mg(55

9、1.14g/mol)ATP并溶于10ml水中。b.存于-20C。制備400mMTris-HCI,pH7.8（4X）buffer稱取4.85g（121.14g/mol）Tris堿并溶于85ml水中。用1M的HCl調(diào)pH到7.8然后定容到100ml。室溫下制備新鮮的2XTMCA工作液計(jì)算出實(shí)驗(yàn)所需要的TMCA,然后用水混合所有的成份到2X工作濃度（在熒光素酶分析buffer中隨后稀釋到1X）比如：1mlTMCA（2X）：500ulTris-HCl（4X儲(chǔ)備液）20ulMgCl2（100X儲(chǔ)備液）20ulCoA（100X儲(chǔ)備液）20ulATP（100X儲(chǔ)備液）用水定容至1ml。如果必要可同時(shí)另加其它

10、成份（比如DTT,EDTA）。GoIdBio細(xì)胞裂解buffers為滿足客戶需求Goldbio最近提供一系列裂解buffers。下面的buffers如果您有什么問題請(qǐng)聯(lián)系我們獲取更多的信息。細(xì)菌細(xì)胞裂解buffer（啟維益成，G176415/G156285）哺乳動(dòng)物細(xì)胞裂解buffer（啟維益成，G176416）組織培養(yǎng)裂解buffer（啟維益成，G156287）酵母裂解buffer（啟維益成，G156286/G176417）為熒光素酶提取之細(xì)胞裂解制備貼壁細(xì)胞（單層）vs.非貼壁（懸浮細(xì)胞）培養(yǎng)對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)有兩個(gè)基本體系，一個(gè)是單層培養(yǎng)（貼壁的），一個(gè)是懸浮培養(yǎng)（非貼壁的）。大部分動(dòng)物來(lái)源的

11、細(xì)胞都是貼壁依賴型（造血干細(xì)胞或相似細(xì)胞系除外）并且需要有一個(gè)適合的能夠輕易地使細(xì)胞附著的培養(yǎng)器皿（經(jīng)常被稱為細(xì)胞培養(yǎng)改性處理）。但也有很多細(xì)胞系用懸浮培養(yǎng)的方法。懸浮培養(yǎng)不需要經(jīng)過(guò)改性處理，但是培養(yǎng)基必須被攪拌來(lái)獲得充足的氣體交換從而避免細(xì)胞死亡。每天監(jiān)測(cè)懸浮細(xì)胞數(shù)量來(lái)確定細(xì)胞生長(zhǎng)情況和密度。稀釋懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)。對(duì)于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，每天用倒置顯微鏡監(jiān)測(cè)以確定細(xì)胞覆蓋。大部分貼壁細(xì)胞達(dá)到80-90%的細(xì)胞覆蓋應(yīng)繼代培養(yǎng)一次以避免營(yíng)養(yǎng)消耗和細(xì)胞死亡。貼壁細(xì)胞總是需要組織培養(yǎng)器皿改性處理來(lái)獲得適當(dāng)?shù)母街蜕L(zhǎng)。根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)目的也可以用玻璃器皿代替一次性塑料培養(yǎng)板，但是保證所有的去污劑殘

12、留被清除是必須的，并且使用之前應(yīng)該被滅菌。不同的細(xì)胞系貼壁程度是不同的，但大部分情況下，用胰蛋白酶（或其它的蛋白酶）來(lái)釋放細(xì)胞。有些細(xì)胞系可能不適合用蛋白酶（比如當(dāng)?shù)鞍酌笇?duì)細(xì)胞是有害的或當(dāng)它們是感興趣的膜標(biāo)志物或受體）。為了易于從培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿上分離細(xì)胞，細(xì)胞刮應(yīng)帶一部分體積的懸浮培養(yǎng)基帶進(jìn)細(xì)胞。為分離貼壁細(xì)胞：（依據(jù)-分子生物學(xué)，vol.290:基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)手冊(cè)）從已經(jīng)達(dá)到理想的細(xì)胞覆蓋的培養(yǎng)皿中吸出培養(yǎng)基，用2-3mlRTPBS（不含Ca2+或Mg2+）洗單層細(xì)胞以洗去所有生長(zhǎng)培養(yǎng)基殘留物。吸出PBS然后加入3-4mlRT胰蛋白酶-EDTA（T/E）。37C孵育3-5分鐘。用倒置相差顯微鏡

13、監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物生長(zhǎng)進(jìn)展。細(xì)胞一旦分離下來(lái)，轉(zhuǎn)移含6-7ml培養(yǎng)基（包含足夠的血清抑制胰蛋白酶活性）的細(xì)胞到離心管中進(jìn)行離心。為了從培養(yǎng)皿中獲得所有細(xì)胞，用5ml的細(xì)胞/培養(yǎng)基混合物沖洗培養(yǎng)皿一到兩次然后把懸浮細(xì)胞液加入初始的用胰蛋白酶處理的細(xì)胞中。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并繼續(xù)裂解步驟。Note：細(xì)胞裂解之前應(yīng)該被離心并沖洗（參看下面）真核細(xì)胞裂解（哺乳動(dòng)物或酵母）（改編自GoldBio的哺乳動(dòng)物細(xì)胞裂解buffer手冊(cè)或酵母/真菌細(xì)胞裂解buffer手冊(cè)）使用之前配制：根據(jù)應(yīng)用，可能加入DTT和EDTAo制備適量的細(xì)胞裂解buffer（哺乳動(dòng)物或酵母）加入DTT和EDTA使終濃度為5mM。如

14、果體系中的二價(jià)金屬離子是反應(yīng)必要的，則不加EDTA，而是用合適的二價(jià)鹽使終濃度成為5mMo蛋白酶抑制劑在提取過(guò)程中如果蛋白酶的活性需要被抑制，可加入蛋白酶抑制劑來(lái)抑止蛋白酶活性（參看ProBlockGold哺乳動(dòng)物蛋白酶抑制劑，啟維益成，G156290,或ProBlockGold酵母/真菌蛋白酶抑制劑，啟維益成，G156292）o哺乳動(dòng)物細(xì)胞在200-500Xg條件下離心5分鐘，移取并棄上清液。對(duì)于貼壁細(xì)胞，從培養(yǎng)板上刮或分離細(xì)胞（參看上面：“分離貼壁細(xì)胞”，離心并棄上清。用5-10mlPBS（不含Ca2+或Mg2+）洗細(xì)胞，然后移去上清，輕輕拍打離心管壁讓細(xì)胞變得松弛，再用5-10mlPBS

15、來(lái)回吸吐進(jìn)行重懸。再次離心。移取并棄去PBS洗液。在剩余的PBS洗液中輕輕吸吐重懸細(xì)胞。加入哺乳動(dòng)物裂解buffer懸起細(xì)胞。每10ml生長(zhǎng)良好的懸浮培養(yǎng)物，加大約1ml哺乳動(dòng)物裂解buffer?；蛘撸好?.05g濕的細(xì)胞加1ml哺乳動(dòng)物裂解buffero獲得濃縮的細(xì)胞提取物，減少哺乳動(dòng)物細(xì)胞裂解buffero這種情況下，凍融一次可確保細(xì)胞完全裂解。用移液槍頭混勻細(xì)胞直到成為勻一的懸浮液為止。在冰上孵育15-30min。不時(shí)地翻轉(zhuǎn)混勻懸浮液以便裂解充分。注意：凍融步驟并不是裂解所必須的。一次或兩次凍融對(duì)細(xì)胞是沒有傷害的，但可以確保細(xì)胞完全裂解。在冷凍離心機(jī)里20,000Xg離心懸浮液30分鐘，

16、收集上清液并分析。注意：細(xì)胞殘留物中可能含有核膜結(jié)合蛋白，這可能需要不同的去去污劑來(lái)進(jìn)一步提取。酵母200-500Xg離心酵母細(xì)胞（ODg1.5-2.0）5-10分鐘，在等體積的酵母懸浮buffer中600懸浮細(xì)胞。每100ul酵母懸浮細(xì)胞加1ulB-巰基乙醇。輕輕地吸吐細(xì)胞懸浮液直到成勻一狀。在4C下孵育5分鐘。再輕輕地吸出懸浮細(xì)胞。加入Zymolyaseo（裂解酶）輕彈以混勻溶液。每100ul細(xì)胞懸浮液加入10ul裂解酶,輕輕地混勻。37C孵育30-60分鐘，取25ul懸浮液與1ml酵母裂解buffer混勻，然后讀取ODonn800的吸光度值。孵育結(jié)束，1,500Xg離心5分鐘，小心棄上清

17、，留原生質(zhì)球在離心管中?？蛇x擇：加5-10ul酵母懸浮buffer到原生質(zhì)球中，輕拍離心管重懸菌體。按照上面的步驟離心然后棄上清。裂解：在適當(dāng)體積的酵母裂解buffer（菌體體積的2-3倍）中懸浮酵母菌體。輕輕吸吐菌體來(lái)回幾次。冰上孵育30分鐘并不時(shí)地翻轉(zhuǎn)。在37C下孵育1-3分鐘或短暫超聲步驟可能更有助于裂解。對(duì)于剪切基因組DNA來(lái)說(shuō)超聲是必要的。請(qǐng)注意：對(duì)酵母菌體得率，越多的酵母裂解buffer，細(xì)胞裂解的越好。20,000Xg4C離心30分鐘，收集裂解物，下游分析備用。注意：額外的酵母裂解buffer可另購(gòu)作下游分析用。比如色譜分析或透析等。Zymolyaseo是KirinBrewery

18、Co.Ltd.的注冊(cè)商標(biāo)。細(xì)菌細(xì)胞（修改自GoldBio的細(xì)菌細(xì)胞裂解bufer操作手冊(cè)）使用前制備：根據(jù)應(yīng)用，可能加入DTT和EDTA。制備適量的細(xì)菌細(xì)胞裂解buffer加入DTT和EDTA使終濃度為5mM。如果體系中的二價(jià)金屬離子是反應(yīng)必要的，則不加EDTA，而是用合適的二價(jià)鹽使終濃度成為5mM。蛋白酶抑制劑-在提取過(guò)程中如果蛋白酶的活性需要被抑制，可加入蛋白酶抑制劑來(lái)抑止蛋白酶活性（參看ProBlockTMGold細(xì)菌蛋白酶抑制劑，啟維益成，G156289）。蛋白提取同時(shí)去除核酸1.把培養(yǎng)好的OD600為1.5-3.0的細(xì)菌細(xì)胞以200-500Xg條件下離心10分鐘，用6005-10ml

19、的細(xì)菌裂解buffer懸浮細(xì)胞（比如25ul的細(xì)胞菌體用125-250ul細(xì)菌裂解buffer）。輕輕吸吐懸浮細(xì)胞直到成均一狀。在冰上或4C孵育5分鐘。再輕輕吸出然后懸浮。旋渦振蕩包含裂解酶的冰凍懸浮液離心管。在細(xì)菌裂解buffer中第100ul細(xì)胞懸浮液加5ul裂解酶，輕輕混勻。在37C孵育懸浮細(xì)胞30-60分鐘?？蛇x擇取25ul懸浮液并與1ml細(xì)菌細(xì)胞裂解buffer混勻并讀取OD590吸光度值來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞裂解程度。孵育期間，翻轉(zhuǎn)離心管來(lái)回幾次助于細(xì)胞充分裂解。用一個(gè)小量程移液槍來(lái)回吸吐懸浮液或用一個(gè)20-gauge的注射器針頭將更有助于細(xì)胞裂解。注意額外體積的細(xì)菌裂解buffer用作下游分

20、析可另購(gòu)比如色譜分析或透析等。去除DNA-裂解期間，細(xì)胞DNA和RNA應(yīng)被分開這樣可降低裂解物的粘性。一些DNA碎片可能存在但不會(huì)干擾下游過(guò)程。然而，為完全去除核酸，在細(xì)菌裂解buffer中不要加入EDTA，完全裂解后，再加入EDTA使終濃度成為2.5mM。4C以20,000條件下離心裂解物30分鐘，并收集裂解物以備下游分析。蛋白質(zhì)提取與原生質(zhì)球形成溶菌酶污染是不可接受的。用以上細(xì)菌蛋白提取方法步驟1-4，然后：孵育之后，200-500Xg條件下離心10分鐘。小心移棄上清液，留原生質(zhì)球于離心管中?？蛇x擇在5-10ml細(xì)菌懸浮buffer中重懸原生質(zhì)球。按照上面的步驟再次離心并棄上清。裂解：在適

21、當(dāng)體積的細(xì)菌裂解buffer（2-3倍體積的原生質(zhì)球）中重懸原生質(zhì)球。重復(fù)吸吐懸浮液幾次。冰上孵育30分鐘并不時(shí)地翻轉(zhuǎn)。在37C孵育細(xì)胞1-3分鐘或短暫超聲更有助于細(xì)胞裂解。請(qǐng)注意，就原生質(zhì)球得率而言，細(xì)菌裂解buffer越多，細(xì)胞裂解的越充分。4C20,000Xg離心裂解物30分鐘并收集裂解物以備下游分析。包涵體的分離：對(duì)于分離包涵體，裂解步驟之后，4C30,000Xg離心細(xì)菌裂解物30分鐘，收集包涵體并用10倍液的細(xì)胞裂解buffer洗兩次（在buffer中懸浮并離心收集包涵體）。收集包涵體溶解并濃縮。熒光素酶標(biāo)準(zhǔn)曲線為計(jì)算樣品中熒光素酶的絕對(duì)含量（如果需要的話），根據(jù)您的光度計(jì)做光檢測(cè)的

22、線性范圍是非常必要的。光度計(jì)在高光密度下會(huì)信號(hào)飽和。為光度計(jì)做線性范圍：1.在1X裂解buffer（或在純化熒光素酶的PBSbuffer中）中設(shè)置一系列稀釋的熒光素酶含1mg/ml的BSA（可以用細(xì)胞培養(yǎng)裂解物或純的熒光素酶）（BSA有助于熒光素酶的穩(wěn)定性）。a.為檢測(cè)背景熒光也可包括不含熒光素酶的樣品（作為陰性對(duì)照）純化的熒光素酶儲(chǔ)存液：在100mMTris-HClpH7.8/5mMMgCl2中溶解1mg熒光素酶，分成等份兒冰凍于-20C或與100%甘油混合然后儲(chǔ)存于-20C（甘油儲(chǔ)存將不會(huì)結(jié)冰）。冰凍的熒光素酶儲(chǔ)存液和熒光素酶甘油儲(chǔ)存液在-20C至少保存兩年仍有活性。加100ul2XTMC

23、A（1X終濃度）到比色皿中或96孔板中。每個(gè)樣品中加2ul100XGLSS（1X終濃度）加98ul稀釋的熒光素酶儲(chǔ)存液或裂解物到比色杯中或板子中。避光（這樣利于熒光穩(wěn)定對(duì)于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線更準(zhǔn)確）室溫下孵育5-10分鐘。為取得最佳結(jié)果，讀數(shù)之前每個(gè)樣品的孵育時(shí)間應(yīng)該一致。注：這個(gè)體積是按照加入100XGLSS,終濃度為1XTMCA來(lái)計(jì)算的，不同的總體積，要相應(yīng)地重新計(jì)算反應(yīng)混合液。用光度計(jì)記錄光密度值。產(chǎn)生熒光素酶標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出光產(chǎn)量vs.細(xì)胞數(shù)量（或vs.ug熒光素酶）。注：如果按照上述步驟沒有產(chǎn)生一個(gè)合適的線性輪廓圖，您可以調(diào)整熒光素的濃度（通常降的更低）熒光素酶熒光分析熒光素酶熒光分析很大

24、程度上依賴于光度計(jì)（是否是手動(dòng)的，單通道注射或整板讀的光度計(jì)）。關(guān)于您具體的光度計(jì)跟它的注射容量和編程指令有關(guān)（注：GLSS濃度根據(jù)不同光度計(jì)的注射體積不同需要做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整）。分析反應(yīng)混合液時(shí)，TMCA的終濃度應(yīng)該是1X。GLSS和裂解物的體積應(yīng)根據(jù)最終TMCA體積來(lái)調(diào)整。例1：手動(dòng)光度計(jì)（200ul終反應(yīng)體積）吸取100ulTMCA到一個(gè)干凈的比色杯中。吸取50-98ul裂解物到比色杯中。如果必要用水把體積定容至198ul。吸取2ulGLSS（1X終濃度）并在光度計(jì)上立即讀取數(shù)據(jù)。例2：注射光度計(jì)（單一樣品或整板）（200ul終反應(yīng)體積）吸取100ulTMCA到光度計(jì)比色杯中或96孔板的每孔

25、中（白色固體的，平底板最好）。吸取50-98ul裂解物到比色杯或孔中。如果必要用水把體積定容至198ul。需要2-5秒鐘用程序指令光度計(jì)注射GLSS后在隨后的10秒鐘檢測(cè)。Hp/s/cm/sr(G)BioluminescenceimagingofjncFeosinenumbersofhumancdiposebssuederivedstemcellsinvitro.Colourscaleb-Eirrepresentsrangeof$Egnal$rBiotumine5CenCEimagingiiproportionaltocellnumberHp/s/cm/sr(G)Bioluminescence

26、imagingofjncFeosinenumbersofhumancdiposebssuederivedstemcellsinvitro.Colourscaleb-Eirrepresentsrangeof$Egnal$rBiotumine5CenCEimagingiiproportionaltocellnumber；withanflJvalueof1.:丄；hl人J”.-.:；L.,-.P.B.-I：.：-鼻.7已甘、:.m譏：仁：1衛(wèi)ntf.*：,2l.Wim沐，tissuederivedstemcellsenhancecardi-acfurKtionafteracutemYOcardiidlirrFarction.Eurapanheartjournal,12(41,489-501,NumberofceHs/weHIODQOHObioluminescence.Archivesofbiochemistryandbiophysics,88(1)