藥物活性篩選實驗

1、SANYO三洋泰州安康OLYMPUSOLYMPUS元儀盧湘儀上海一，恒PerkinElmerHettichHDL梅特勒-托利多優(yōu)普ThermoBio-RadBio-RadBio-RadBio-RadIKA實驗計劃 實驗目的：采用HEK293/a 1D-AR/Ga 16細胞模型，通過鈣流實驗評價關黃柏的四個血中 移行成分小檗堿、黃柏內(nèi)酯、黃柏酮及木蘭堿對 a1D型腎上腺素能受體的阻滯作用，表征 成分的抗前列腺炎潛在活性；在22RV1人前列腺癌細胞上，通過MTT及相關分子生物學分 析評價以上四種血中移行成分的治療前列腺癌活性。第一章關黃柏血中移行成分抗前列腺炎活性評價1實驗材料1.1儀器與試劑1.

2、1.1實驗儀器：CO2培養(yǎng)箱紫外消毒柜倒置熒光顯微鏡倒置顯微鏡超微量分光光度計離心機干燥箱熒光讀板儀低溫離心機生物安全柜電子分析天平超純水機離心機（?。╇娪緝x電泳成像儀熒光PCR儀梯度PCR儀磁力攪拌器立式蒸汽壓力滅菌器上海博訊水浴鍋IKA流式細胞儀默克密理博1.1.2實驗材料：HEK293/a 1D-AR/Ga 16 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，22RV1 人前列腺癌細胞(ATCC)，ABT-594和 RJR2403 陽性化合物(腎上腺素、咖啡因？)，96-孔黑邊透明底 Greiner plate( pClear/ClearBottom),Milliporeviacount reagent，DMEM 高糖培

3、養(yǎng)液(Applichem，Germany),HBSS( Hyclone, USA),臺盼藍(Sigma，USA)，RPIM-1640(HyClone),FBS,Antibiotics，DMSO, Trypsin-EDTA， HEPES，MTT,Fluo-4 AM免洗鈣流檢測試劑盒，乙醇其它試劑均為分析純級。2方法2.1細胞株培養(yǎng)細胞的復蘇培養(yǎng)從-80C中取出凍存管，立即投入37水浴,并不斷的搖動，使之迅速融化。 將溶解的細胞凍存管取出，用酒精消毒后打開，吸出溶有細胞的凍存液，加入事先裝好培養(yǎng)液(37C預熱，810倍體積)離心管內(nèi),稍微吹打混勻，然后1000rpm 5min,去除上清,加入適量

4、培養(yǎng)液，吹打成細胞懸液，以1x105/mL密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，在37C、5%CO2及飽 和濕度下培養(yǎng)于含有10%FBS的DMEM (High glucose)培養(yǎng)液中，同時加入400 p g/mL G418。消化細胞使用含0.05%EDTA的Trypsin溶液。2.2細胞的傳代HEK293/a 1D-AR/Ga 16細胞48h換液1次，細胞長至60%70%融合時，用0.25%胰酶消 化12min，將培養(yǎng)瓶再用手掌輕輕敲打使細胞脫壁、懸浮、分散，為使細胞進一步分散可 用吹打管輕輕吹打幾次，獲得細胞懸液，然后加入倍量的培養(yǎng)基，溫和混勻，吸管分裝混合 液，傳代擴增細胞。并凍存細胞備用，凍存

5、細胞使用含10%DMSO或甘油、1020%小牛 血清的凍存培養(yǎng)液。2.3細胞形態(tài)的觀察在倒置顯微鏡下觀察并記錄細胞的生長情況及形態(tài)特征。2.4細胞的計數(shù)常規(guī)消化細胞，待細胞變圓、脫壁并浮起，加入少量培養(yǎng)基離心，再用milliporeviacount按 比例重懸并吹打制成細胞懸液。預熱guava流式細胞儀，進行流式細胞儀的細胞計數(shù)分析。2.5細胞的貼壁率指數(shù)生長期的細胞，以0.25%胰酶消化成單細胞懸液，計數(shù)后分別接種于12個25cm2培養(yǎng) 瓶中，每兩小時隨機取出3瓶細胞，吸除培養(yǎng)基及未貼壁細胞，加入胰消化酶消化、計數(shù)已 貼壁細胞，取其平均值，按照公式：貼壁率(%)=(已貼壁細胞數(shù)/接種細胞數(shù))

6、X100%，計算 貼壁率。2.6生長曲線細胞生長曲線是測定細胞絕對生長數(shù)的常用方法，也是判定細胞活力的重要指標，是培養(yǎng)細 胞生物學特性的基本參數(shù)之一。一般細胞傳代之后，經(jīng)過短暫的懸浮然后貼壁，隨后度過長 短不同的潛伏期，即進入大量分裂的指數(shù)生長期。在細胞達到飽和密度后，停止生長，進入 平頂期，然后退化衰亡。為了準確描述整個過程中細胞數(shù)目的動態(tài)變化，典型的生長曲線可 分為生長緩慢的潛伏期，斜率較大的指數(shù)生長期，呈平臺狀的平頂期及退化衰亡4個部分。 以存活細胞數(shù)(萬/mL)對培養(yǎng)時間(h或d)作圖，即得生長曲線。取指數(shù)生長期的細胞用胰酶 消化制成單細胞懸液，以1x104/孔接種于24孔板，每孔加入

7、1mL培養(yǎng)基。每天隨機取3 孔，計數(shù)每孔細胞的數(shù)目并計算平均值。連續(xù)計數(shù)10d，繪制細胞生長曲線?；虿捎门_盼藍計數(shù)法：取不同時間段生長的原代小鼠肝細胞，用胰酶消化，用新培養(yǎng)基制成細胞懸液后計數(shù)根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果，以單位細胞數(shù)(細胞數(shù)/mL)為縱坐標，以時間為橫坐標繪制生長曲線。MTT檢測法：細胞接種在96孔板上，200ul/孔,培養(yǎng)基代替細胞懸液做為空白對照。加入0.1 mL MTT于37C孵育4 h。使MTT還原為藍紫色甲贊結(jié)晶。加入150ul/孑L的DMSO,搖床上低速震蕩15min，使藍色的結(jié)晶充分溶解后，在酶標儀上在OD值490nm處檢測計算細胞成活率，繪制細胞生長曲線。2.7細胞形態(tài)觀

8、察并記錄利用倒置相差顯微鏡觀察生長過程中細胞的形態(tài)，并拍照記錄。2.8鈣流實驗配體門控離子通道受體是繼G蛋白偶聯(lián)受體和核激素受體家族之后的又一重要的受體靶標。 建立基于配體門控離子通道受體介導的鈣流變化的藥物篩選模型，將細胞與Ca2+敏感的 熒光探針(Fluo-4)共同孵育，使用陽性化合物(ABT- 5 9 4 )來激動Flu。一4標記細胞，通過加入被測化合物后熒光讀板儀檢測到的鈣流變化，觀察被篩選化合物激動或拮抗鈣流反應的能力，篩選出對a 1D-AR起拮抗作用的藥物2.8.1鈣流反應緩沖液配制HEPES 10 mmol/L, NaCl 5 mmol/L, KCl 5 mmol/L, CaCl

9、 mmol/L,N-methyl-D-glucamine 140 mmol/L, glucose 10 mmol/L，室溫下調(diào) pH 值到 7.4。2.8.2細胞內(nèi)鈣流的檢測方法待細胞融合度達70%-90%時，收集于直徑10 cm的細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的 HEK293/a 1D-AR/Ga 16 細胞，加入 Fluo-4 5 p mol/L 和 2.5 mmol/L Probenecid，室溫下避光孵育 30 分鐘后，使用鈣流反應緩沖液洗滌2遍。以80 p l/孔接種到96孔黑邊透明底的Greiner 板中，細胞密度約6X104/o使用PE熒光讀板儀，加入一定濃度的化合物溶液20 p L/孔，在激

10、發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長525 nm下檢測熒光強度120秒。2.8.3數(shù)據(jù)采集與處理取鈣流曲線的峰值讀數(shù)來量化該點化合物的鈣流反應。數(shù)據(jù)的非線性回歸擬合及作圖采用 GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.，San Diego, CA, USA)軟件。同時可以利用熒光顯 微鏡拍照記錄?；衔镆种坡视嬎愎剑夯衔镆种坡?(ABT-594引發(fā)的峰值讀數(shù)一各化合物引發(fā)的峰值讀麴/ABT-594引發(fā)的峰值讀數(shù)X100%第二章關黃柏血中移形成分抗前列腺癌活性評價1實驗材料1.2儀器與試劑1.1.1實驗儀器：CO2培養(yǎng)箱SANYO三洋紫外消毒柜泰州安康倒置熒光顯微

11、鏡OLYMPUS倒置顯微鏡OLYMPUS超微量分光光度計元儀離心機盧湘儀干燥箱上海一，恒熒光讀板儀PerkinElmer低溫離心機Hettich生物安全柜HDL電子分析天平梅特勒-托利多超純水機優(yōu)普離心機（?。㏕hermo電泳儀Bio-Rad電泳成像儀Bio-Rad熒光PCR儀Bio-Rad梯度PCR儀Bio-Rad磁力攪拌器IKA立式烝汽壓力火菌器上海博訊水浴鍋IKA流式細胞儀默克密理博1.1.2實驗材料：HEK293/a 1D-AR/Ga 16 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，22RV1 人前列腺癌細胞(ATCC)，ABT-594和 RJR2403 陽性化合物，96-孔黑邊透明底 Greiner plate(

12、pClear/Clear Bottom),Milliporeviacount reagent， DMEM 高糖培養(yǎng)液(Applichem，Germany),HBSS( Hyclone, USA),臺盼藍(Sigma，USA)， RPIM-1640(HyClone),FBS,Antibiotics，DMSO，Trypsin-EDTA，HEPES，MTT,Fluo-4 AM免洗鈣流檢測試劑盒，乙醇其它試劑均為分析純級。2方法2.1細胞株培養(yǎng)細胞的復蘇培養(yǎng)從-80C中取出凍存管，立即投入37水浴,并不斷的搖動，使之迅速融化。將溶解的細胞凍存管取出，用酒精消毒后打開，吸出溶有細胞的凍存液，加入事先裝好

13、培養(yǎng)液（37C預熱，810倍體積）離心管內(nèi),稍微吹打混勻，然后1000rpm 5min，去除上清,加入適量 培養(yǎng)液，吹打成細胞懸液，以1x105/mL密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，在37C、5%CO2及飽 和濕度下培養(yǎng)于含有10%FBS的RPIM-1640培養(yǎng)液中。消化細胞使用含0.05%EDTA的 Trypsin 溶液。2.2細胞的傳代22RV1人前列腺癌細胞長至60%70%融合時，用0.25%胰酶消化12min,將培養(yǎng)瓶再用 手掌輕輕敲打使細胞脫壁、懸浮、分散，為使細胞進一步分散可用吹打管輕輕吹打幾次，獲 得細胞懸液，然后加入倍量的培養(yǎng)基，溫和混勻，吸管分裝混合液，傳代擴增細胞。并凍存 細

14、胞備用，凍存細胞使用含10%DMSO或甘油、1020%小牛血清的凍存培養(yǎng)液。2.3細胞形態(tài)的觀察在倒置顯微鏡下觀察并記錄細胞的生長情況及形態(tài)特征。2.4細胞的計數(shù)常規(guī)消化細胞，待細胞變圓、脫壁并浮起，加入少量培養(yǎng)基離心，再用milliporeviacount按 比例重懸并吹打制成細胞懸液。預熱guava流式細胞儀，進行流式細胞儀的細胞計數(shù)分析。2.5細胞的貼壁率指數(shù)生長期的細胞，以0.25%胰酶消化成單細胞懸液，計數(shù)后分別接種于12個25cm2培養(yǎng) 瓶中，每兩小時隨機取出3瓶細胞，吸除培養(yǎng)基及未貼壁細胞，加入胰消化酶消化、計數(shù)已 貼壁細胞，取其平均值，按照公式：貼壁率（%）=（已貼壁細胞數(shù)/接

15、種細胞數(shù)）X100%，計算 貼壁率。2.6生長曲線細胞生長曲線是測定細胞絕對生長數(shù)的常用方法，也是判定細胞活力的重要指標，是培養(yǎng)細 胞生物學特性的基本參數(shù)之一。一般細胞傳代之后，經(jīng)過短暫的懸浮然后貼壁，隨后度過長 短不同的潛伏期，即進入大量分裂的指數(shù)生長期。在細胞達到飽和密度后，停止生長，進入 平頂期，然后退化衰亡。為了準確描述整個過程中細胞數(shù)目的動態(tài)變化，典型的生長曲線可 分為生長緩慢的潛伏期，斜率較大的指數(shù)生長期，呈平臺狀的平頂期及退化衰亡4個部分。 以存活細胞數(shù)（萬/mL）對培養(yǎng)時間（h或d）作圖，即得生長曲線。取指數(shù)生長期的細胞用胰酶 消化制成單細胞懸液，以1x104/孔接種于24孔板

16、，每孔加入1mL培養(yǎng)基。每天隨機取3 孔，計數(shù)每孔細胞的數(shù)目并計算平均值。連續(xù)計數(shù)10d，繪制細胞生長曲線?；虿捎门_盼藍計數(shù)法：（1）取不同時間段生長的原代小鼠肝細胞，用胰酶消化，用新培養(yǎng)基制成細胞懸液后計數(shù)（2）根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果，以單位細胞數(shù)（細胞數(shù)/mL）為縱坐標，以時間為橫坐標繪制生長曲線。MTT檢測法：（1）細胞接種在96孔板上，200ul/孔,培養(yǎng)基代替細胞懸液做為空白對照。（2）加入0.1 mL MTT于37C孵育4 h。使MTT還原為藍紫色甲贊結(jié)晶。（3）加入150ul/孑L的DMSO,搖床上低速震蕩15min，使藍色的結(jié)晶充分溶解后，在酶標儀上在OD值490nm處檢測（4）計算細胞成活率，繪制細胞生長曲線。2.7細胞形態(tài)觀察并記錄利用倒置相差顯微鏡觀察生長過程中細胞的形態(tài)，并拍照記錄。2.8 CCK8、MTT檢測關黃柏血中移行成分抗前列腺癌活性2.8.1.收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。2.8.2.5%CO2, 37C孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平