5電泳質(zhì)粒-紫外測DNA

1、第一步，先把天然胰島素拆成A、B兩條鏈， 再把它們重新合成為胰島素；第二步，用人工合成的鏈同天然的A鏈相連接；第三步，把人工合成的鏈與人工合成的B鏈相結(jié)合。 前排右起：陸德培、邢其毅、施溥濤，后排右起：季愛雪、李崇熙、葉蘊(yùn)華、湯卡羅 電泳：重組質(zhì)粒的酶切鑒定紫外分光光度法檢測DNA含量實驗五質(zhì)粒DNA電泳的上樣安排：同組的未切的質(zhì)粒混合液和組內(nèi)各人的酶切后的質(zhì)粒相鄰上樣9l 酶切產(chǎn)物+3l loading buffer8-9l 質(zhì)粒+3l loading buffer基因工程誕生的技術(shù)突破 限制性內(nèi)切酶（restriction enzymes）1970年H.O. Smith等分離出第一種限制性

2、核酸內(nèi)切酶。 Werner Arber 理論預(yù)見限制酶Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片斷Hamilton O. Smith 得到第一個限制酶1978年Nobel生理或醫(yī)學(xué)獎限制性核酸內(nèi)切酶 是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列（48bp），并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶來源：原核生物功能：自我保護(hù)細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系） pUC119圖譜重組質(zhì)粒BamH IHind III雙酶切電泳檢測5-G G A T C C-33-C C T A G G-5BamH I5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5 Hind III電

3、泳結(jié)果：M：Marker1：酶切樣品12：酶切樣品23：酶切樣品34：未酶切質(zhì)粒M3211Kb200bp100bp2Kb5Kb600bp400bp4酶切結(jié)果紫外分光光度法檢測DNA分光光度技術(shù)是利用物質(zhì)特有的吸收光譜對其進(jìn)行定性、定量分析的實驗技術(shù)。分光光度技術(shù)752型分光光度計特點 靈敏度高：測定下限可達(dá)105106mol/L, 準(zhǔn)確度能夠滿足微量組分的測定要求： 相對誤差25 （12）操作簡便快速應(yīng)用廣泛 吸光光度法是基于被測物質(zhì)的分子對光具有選擇性吸收的特性而建立起來的分析方法。光學(xué)光譜區(qū)遠(yuǎn)紫外近紫外可見近紅外中紅外 遠(yuǎn)紅外（真空紫外）10nm200nm200nm 380nm380nm

4、780nm780 nm 2.5 m2.5 m 50 m50 m 300 m氫燈 復(fù)合光(陽光及鎢燈)發(fā)射光譜紅 橙 黃 綠 青 藍(lán) 紫單色光三棱鏡可見光分光光度計光源紫外分光光度計光源有關(guān)光學(xué)原理吸收光譜 在光源和棱鏡之間放上某種物質(zhì)的溶液，光源發(fā)射光譜中某些波長的光因溶液吸收而消失，這種被溶液吸收后的光譜稱為該溶液的吸收光譜。苯和甲苯在環(huán)己烷中的吸收光譜苯(254nm)甲苯(262nm)A230 250 270 DNA的吸收峰光吸收基本定律: Lambert-Beer定律A=lg(I0/It)=kbcItI0bdxII-dIs朗伯定律(1760) A=lg(I0/It)=k1b比爾定律(18

5、52)A=lg(I0/It)=k2c吸光度介質(zhì)厚度(cm)Lambert-Beer定律 A或DK C L 吸光度 摩爾消光系數(shù) 吸收物質(zhì)的光徑（cm） 溶液濃度（mol/L） dsDNA=50(OD260) 稀釋倍數(shù)（單位為g /ml） 分光光度計的基本部件1. 光源分光光度計上常用的光源有兩種： 近紫外光區(qū) 可見光區(qū) 鎢絲燈 近紅外光 紫外光區(qū)氫燈、氘燈 光電2. 單色器單色器是把混合光波分解為單一波長光的裝置。 棱鏡光波通過棱鏡時，不同波長的光折射率不同，折射率與波長成負(fù)相關(guān)。 衍射光柵在石英或玻璃的表面刻劃許多平行線，通過光的干涉和衍射，形成光譜。入射狹縫準(zhǔn)直透鏡棱鏡聚焦透鏡出射狹縫白光

6、紅紫12800 600 500400吸收池（或稱比色杯、比色皿、比色池）一般由玻璃或石英制成注意：a. 與光束垂直；b. 規(guī)格相同；c. 清潔5. 檢測器光電，并逐級放大6. 測量裝置電流表、記錄器和數(shù)字示值讀數(shù)單元 吸光度與濃度的關(guān)系 A = bc 吸光度光源檢測器 吸光度光源檢測器b 吸光度光源檢測器b0.000.220.42確定空白對照，調(diào)試紫外分光光度計“調(diào)0，調(diào)100”以待測樣品的“溶劑”作為空白對照，在波長260nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計讀數(shù)至“0”確定稀釋倍數(shù)：取待測的DNA溶液，加入比色杯，讀取260nm 的吸收值若度數(shù)不在0-1之間，則需進(jìn)行相應(yīng)比例的稀釋（用蒸餾水或TE），并記錄稀釋倍數(shù)實驗操作（調(diào)試分光光度計，確定DNA樣品的稀釋倍數(shù)）確定待測DNA的260nm 的吸收值。 260nm 讀數(shù)用于計算樣品中核酸的濃度：OD260值為1相當(dāng)于約50g /ml雙鏈DNA公式： dsDNA=50(OD260) 稀釋倍數(shù) （單位為g /ml）測定280nm的吸收值。 按相同方法測定280nm的吸收