生物技術(shù)制藥

1、第五章動(dòng)物細(xì)胞制藥1本章主要內(nèi)容第一節(jié) 概述第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和生理特點(diǎn)第三節(jié) 生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和培養(yǎng)第四節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)第五節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品的純化和質(zhì)量要求第六節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞制藥的前景2第一節(jié) 概述1665年英國物理學(xué)家虎克用自制的顯微鏡發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞，實(shí)際上是死細(xì)胞留下的細(xì)胞壁，不久，荷蘭科學(xué)家列文虎克才真正觀察到了細(xì)胞。從此認(rèn)為細(xì)胞是一切動(dòng)植物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單元。1838年德國的植物學(xué)家施萊登和動(dòng)物學(xué)家施旺共同創(chuàng)立了細(xì)胞學(xué)說。3細(xì)胞學(xué)說所有生物都是由一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞組成的；細(xì)胞是生命的基本單位；新細(xì)胞是由原有細(xì)胞分裂而來的。4細(xì)胞培養(yǎng)是將細(xì)胞從機(jī)體取出，在體外模擬機(jī)體體內(nèi)生理

2、條件進(jìn)行培養(yǎng)，使之生存和生長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)已有近百年歷史了。隨著細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)和基因工程等一系列學(xué)科和技術(shù)的發(fā)展，逐漸形成了細(xì)胞工程學(xué)。5細(xì)胞工程是以細(xì)胞為單位，按人們的意志，應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等理論和技術(shù)，有目的地進(jìn)行精心操作，使細(xì)胞的某些遺傳特性發(fā)生改變，從而達(dá)到改良或產(chǎn)生新品種的目的，以及使細(xì)胞增加或重新獲得產(chǎn)生某種特定產(chǎn)物的能力，從而在離體條件下進(jìn)行大量培養(yǎng)、增殖，并提取出對(duì)人類有用的產(chǎn)品。6第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和生理特點(diǎn)一、動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)動(dòng)物細(xì)胞屬于真核細(xì)胞，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分化精確，不同細(xì)胞執(zhí)行不同的功能，例如神經(jīng)細(xì)胞具有很長(zhǎng)的分支，很多的纖維，以便接受和傳遞刺激

3、，紅細(xì)胞呈扁圓盤狀，增大其接觸面等。但細(xì)胞在離體培養(yǎng)時(shí)形態(tài)會(huì)發(fā)生變化，根據(jù)不同的需要將離體培養(yǎng)的細(xì)胞分為三類：貼壁依賴型、貼壁非依賴型和兼性貼壁型。71、貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)必須要有給以貼附的支持物表面，細(xì)胞依靠自身分泌的或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長(zhǎng)和繁殖。8910112、懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)，如淋巴細(xì)胞等。3、兼性貼壁細(xì)胞根據(jù)生長(zhǎng)條件的不同可貼壁也可懸浮生長(zhǎng)，中國地鼠卵巢細(xì)胞。1213動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞生產(chǎn)藥物的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：多半可分泌到細(xì)胞外，提取純化方便，蛋白質(zhì)經(jīng)糖基化修飾后與天然產(chǎn)物更一致，適合于臨床應(yīng)用。缺點(diǎn)：培養(yǎng)條件要求高、成本高、產(chǎn)量低。

4、14第三節(jié) 生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和培養(yǎng)一、要求最初要求生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞必須是原代細(xì)胞，以后放寬至二倍體細(xì)胞即可，即使是經(jīng)過多次傳代也可用，但是非二倍體細(xì)胞是絕對(duì)禁止使用的，因?yàn)閾?dān)心異倍體細(xì)胞的核酸會(huì)影響到人的正常染色體，有致癌的危險(xiǎn)。由于二倍體細(xì)胞傳代不會(huì)超過50代，所以使用受到限制。后來發(fā)現(xiàn)異倍體也可使用，并未對(duì)機(jī)體產(chǎn)生影響，并且可無限使用，對(duì)工業(yè)生產(chǎn)帶來了極大的方便。15二、獲得原代細(xì)胞、已建立的二倍體細(xì)胞系及可無限傳代的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。1、原代細(xì)胞直接取自動(dòng)物組織、器官，經(jīng)過粉碎、消化后獲得的細(xì)胞懸液。需大量動(dòng)物，費(fèi)錢費(fèi)勞力。162、二倍體細(xì)胞原代細(xì)胞經(jīng)過傳代、篩選和克隆，從而從多種細(xì)胞成分的

5、組織中挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株。特點(diǎn)：二倍體；有明顯的貼壁和接觸抑制特性；有限的增殖能力；無致瘤性。173、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系通過轉(zhuǎn)化形成，變成了異倍體，有無限增殖能力。轉(zhuǎn)化可自發(fā)，在傳代過程中自己轉(zhuǎn)變成可無限增殖的細(xì)胞；也可人為轉(zhuǎn)化，采用某些試劑處理，或從動(dòng)物的腫瘤組織中建立的細(xì)胞系。優(yōu)點(diǎn)：無限傳代、倍增時(shí)間短、對(duì)培養(yǎng)條件和生長(zhǎng)因子的要求低，適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。18三、生產(chǎn)常用動(dòng)物細(xì)胞的特性WI-38：人二倍體細(xì)胞系，成纖維細(xì)胞，能產(chǎn)生膠原，倍增時(shí)間為24小時(shí)，有限壽命50代，用于制備疫苗。MRC-5：人二倍體細(xì)胞系，成纖維細(xì)胞，有限壽命42-46代，用于制備疫苗。CHO-K1：從中

6、國地鼠卵巢中分離的上皮樣細(xì)胞，用于構(gòu)建工程菌。19BHK-21：從地鼠幼鼠的腎臟中分離。成纖維樣細(xì)胞，用于構(gòu)建工程菌，可生產(chǎn)疫苗。Vero：從非洲綠猴腎中分離，貼壁依賴的成纖維細(xì)胞，用于制備疫苗。Namalwa：從淋巴瘤病人分離，生產(chǎn)干擾素。SP2/0-Ag14：從抗羊紅細(xì)胞活性的小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞系融合獲得，生產(chǎn)單克隆抗體。20四、 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法（一）細(xì)胞分離1、離心分離法； 2、消化分離法（二）細(xì)胞計(jì)數(shù)（三）細(xì)胞傳代（四）細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇21第四節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)分批培養(yǎng)半連續(xù)培養(yǎng)灌流式培養(yǎng)22分批培養(yǎng)將細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性加入反應(yīng)器內(nèi)，待培養(yǎng)結(jié)束后，放出培養(yǎng)液，進(jìn)行提取

7、。2324半連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，每間隔一段時(shí)間取出部分培養(yǎng)物，再加入同樣數(shù)量的新鮮培養(yǎng)基。25灌流培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)基加入反應(yīng)器后，在產(chǎn)物形成過程中，不斷取出培養(yǎng)基同時(shí)不斷補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基。26灌流培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)1、細(xì)胞可處于穩(wěn)定良好的環(huán)境中，營(yíng)養(yǎng)條件好、有害代謝廢物濃度低；2、可極大地提高細(xì)胞密度；3、產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時(shí)間短，可及時(shí)分離出產(chǎn)品并在低溫下保存，有利于產(chǎn)品質(zhì)量的提高；4、培養(yǎng)基的比消耗率低，產(chǎn)品質(zhì)量高，成本降低。27第五節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品的純化方法和質(zhì)量要求一、動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品常用的純化方法1、離心純化的早期階段，用以去除細(xì)胞、細(xì)胞碎片或其他較大的雜質(zhì)。常在低溫下進(jìn)行。2、離子交

8、換層析根據(jù)各種蛋白質(zhì)所帶的電荷性質(zhì)不同進(jìn)行分離。283、凝膠過濾根據(jù)各種蛋白質(zhì)分子量大小的差異進(jìn)行分離。4、親和層析根據(jù)特異性結(jié)合的性質(zhì)，如酶和底物，抗原和抗體。5、鹽析和有機(jī)溶劑沉淀6、透析7、高壓液相層析29二、動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品的質(zhì)量要求1、對(duì)工程細(xì)胞的要求歷史資料：來源、動(dòng)物年齡和性別、細(xì)胞分離的方法和所用的培養(yǎng)基。細(xì)胞特性資料：形態(tài)、生長(zhǎng)特征、細(xì)胞抗原、染色體等。無污染：細(xì)菌、真菌、支原體和各種病毒。302、對(duì)生產(chǎn)工藝的要求廠房條件符合國家規(guī)定，所用的一切原料、試劑都必須質(zhì)量穩(wěn)定可靠。在細(xì)胞培養(yǎng)中盡可能少用或不用小牛血清，必須用時(shí)需嚴(yán)格挑選，以防病毒和支原體污染。純化過程要低溫進(jìn)行。純化后

9、的產(chǎn)品需經(jīng)嚴(yán)格質(zhì)量檢測(cè)，合格后才可分裝。313、對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量要求純度生物活性比活性穩(wěn)定性臨床前的安全性和有效性評(píng)價(jià)臨床試驗(yàn)的安全性和有效性評(píng)價(jià)32（一）提高產(chǎn)量、降低成本和改進(jìn)質(zhì)量方面的研究提高產(chǎn)量：即提高細(xì)胞表達(dá)的水平，選用合適的載體、宿主和表達(dá)方式。降低成本：需要改進(jìn)培養(yǎng)基配方，盡可能采用廉價(jià)原料，開發(fā)化學(xué)限定培養(yǎng)基，同時(shí)還應(yīng)從改變細(xì)胞代謝途徑著手。改進(jìn)質(zhì)量：主要是糖基化質(zhì)量問題，選用合適宿主、改變細(xì)胞的某些酶基因、改進(jìn)控制培養(yǎng)條件使產(chǎn)物正確糖基化。第六節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞制藥前景33（二）培養(yǎng)方式的選擇懸浮、貼壁、兼性分批、灌流馴化細(xì)胞改變?cè)瓉碣N壁、依賴血清的生長(zhǎng)特性。34（三）發(fā)酵過程的控制發(fā)酵過程的影響因素很多：攪拌、溶氧、pH、溫度、細(xì)胞代謝物中有害物質(zhì)的累積等等。使細(xì)胞處于半饑餓狀態(tài)可延長(zhǎng)培養(yǎng)周期；提高滲透壓可提