細(xì)胞培養(yǎng)1細(xì)胞結(jié)構(gòu)、成分和培養(yǎng)技術(shù)

1、細(xì)胞培養(yǎng)1細(xì)胞結(jié)構(gòu)、成分和培養(yǎng)技術(shù)一、細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)（一）概念：細(xì)胞是一切生命活動(dòng)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位。一般認(rèn)為：1 細(xì)胞是由膜包圍的原生質(zhì)（Protoplasm）團(tuán)，通過(guò)質(zhì)膜與周圍環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)和信息交流。2 細(xì)胞是構(gòu)成有機(jī)體的基本單位，具有自我復(fù)制的功能，是有機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)。3 細(xì)胞是代謝與功能的基本單位，具有一套完整的代謝和調(diào)節(jié)體系。4 細(xì)胞是遺傳的基本單位，具有發(fā)育的全能性 。 （二） 細(xì)胞結(jié)構(gòu)-總覽 細(xì)胞是現(xiàn)代生物體最基本的結(jié)構(gòu)單位。DNA中儲(chǔ)存著細(xì)胞結(jié)構(gòu)和作用信息，細(xì)胞有一套完善的機(jī)制來(lái)建構(gòu)自身、發(fā)揮功能，從而維持自身活性，其中包括產(chǎn)生兩個(gè)子細(xì)胞的細(xì)胞分裂（有絲分裂）作用； 是包

2、裹著核仁的雙層膜結(jié)構(gòu)，上面有很多復(fù)雜封閉結(jié)構(gòu)的氣孔。核膜也與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相連。內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 是膜物質(zhì)，是蛋白質(zhì)合成場(chǎng)所。 粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上覆蓋著核糖體，粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中生成的蛋白質(zhì)被運(yùn)輸?shù)狡交瑑?nèi)質(zhì)網(wǎng),平滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上無(wú)核糖體。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是膜物質(zhì)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中生成的蛋白質(zhì)被運(yùn)輸?shù)狡交瑑?nèi)質(zhì)網(wǎng),平滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上沒(méi)有核糖體。中心體是微管的起源，微管構(gòu)成細(xì)胞骨架為細(xì)胞制造能量，線粒體中含有酶，參與制造高能量分子，（如，ATP，三磷酸腺苷）ATP是細(xì)胞中常見(jiàn)的能源物質(zhì)，例如，ATP提供能源物質(zhì)給馬達(dá)蛋白主要是一層脂質(zhì)雙分子膜，包圍細(xì)胞，使之與外界隔絕。同時(shí)，細(xì)胞膜也包含很多通道，物質(zhì)交換在這里發(fā)生。細(xì)胞膜也包含連接結(jié)構(gòu)，將相鄰細(xì)胞緊密連接起

3、來(lái)Golgi body transforms and packs proteins and other substances produced in the ER.核仁 包含著用DNA（脫氧核糖核酸）記錄的細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能信息。（三）動(dòng)物、植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu) 二、細(xì)胞的化學(xué)成分 組成細(xì)胞的基本元素是：O、C、H、N、Si、K、Ca、P、Mg，其中O、C、H、N四種元素占90%以上。細(xì)胞的化學(xué)元素可分為兩大類：無(wú)機(jī)物和有機(jī)物。在無(wú)機(jī)物中，水是最主要的成分，約占細(xì)胞物質(zhì)總含量的75%-80%。二、細(xì)胞的化學(xué)成分1 水與無(wú)機(jī)鹽水是原生質(zhì)最基礎(chǔ)的物質(zhì)。無(wú)機(jī)鹽。2 細(xì)胞的有機(jī)分子蛋白質(zhì)核酸糖類脂類3 酶與生物催

4、化劑酶RNA催化劑三、細(xì)胞培養(yǎng)基本概念 細(xì)胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)取出組織摹擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度及酸堿度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使其生長(zhǎng)繁殖，并維持其基本結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物為單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群。細(xì)胞體外培養(yǎng)的三個(gè)層次：組織培養(yǎng)（Tissue Culture）細(xì)胞培養(yǎng)（Cell Culture）器官培養(yǎng)（organ Culture）以上三個(gè)層次的培養(yǎng)，又可統(tǒng)稱為體外培養(yǎng)（In Vitro）.體外培養(yǎng)包括：細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)。 四、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法1 靜止培養(yǎng)： 應(yīng)用細(xì)胞管、多孔板、羅氏瓶等；培養(yǎng)時(shí)靜止不動(dòng)。注意以下幾點(diǎn):培養(yǎng)量一般不要超過(guò)總體記得1/3，液體厚度不要

5、超過(guò)1cm.若用普通溫箱培養(yǎng)，必須蓋緊蓋子或塞緊橡皮塞。若用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，則不要蓋緊瓶塞，并將CO2濃度控制在5%。一般2d換一次液，細(xì)胞長(zhǎng)成單層要及時(shí)分種傳代。四、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法2 施轉(zhuǎn)培養(yǎng) 應(yīng)用轉(zhuǎn)瓶，并放置在轉(zhuǎn)床上培養(yǎng)。為了增加培養(yǎng)細(xì)胞面積，可以在轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)加入多層同心圈。3 懸浮培養(yǎng) 它適應(yīng)于一切能在懸浮條件下生長(zhǎng)增殖的細(xì)胞，即貼附依賴性細(xì)胞。用于該類細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)備結(jié)構(gòu)基本與培養(yǎng)細(xì)菌的相同，用于細(xì)胞培養(yǎng)的稱為生物反應(yīng)器。四、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法4 微載體培養(yǎng) 它適于一切貼附依賴性細(xì)胞，即貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)，用葡聚糖制成微粒，即微載體培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的新技術(shù)。5 微載體在低速攪拌時(shí)就可以懸浮。6 微

6、載體培養(yǎng)的傳代和擴(kuò)大培養(yǎng)。7 微載體的再生利用。 為了降低載體的消耗，有些類型的微載體還可以再生利用。四、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法8 巨載體和微囊培養(yǎng) 將細(xì)胞包埋在凝膠體或微囊內(nèi)，也叫包埋體。由于有的凝膠載體制備的較大，直徑在23mm，因此又稱為巨載體培養(yǎng)。9 多孔微球培養(yǎng) 它把微載體和巨載體兩者優(yōu)點(diǎn)結(jié)合在一起，細(xì)胞既可附著在載體表面，又可以滲入載體較大的孔隙而生長(zhǎng)在在體內(nèi)。四、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法10 中空纖維培養(yǎng) 該培養(yǎng)器模擬機(jī)體的毛細(xì)血管系統(tǒng)，有數(shù)百至數(shù)千根中空纖維集束組成。該纖維的材料為聚砜丙烯聚物，纖維壁厚5075um,成多孔性。內(nèi)層有超濾膜，內(nèi)腔用以灌流充以氧氣的培養(yǎng)，外腔用以培養(yǎng)細(xì)胞。11

7、灌流培養(yǎng) 過(guò)濾培養(yǎng)法，它的特點(diǎn)是在培養(yǎng)過(guò)程中，不斷的灌流補(bǔ)充新的培養(yǎng)基，同時(shí)不斷地排出已消耗的培養(yǎng)基及細(xì)胞代謝過(guò)程中新生的有害物質(zhì)，這樣就可以大大的培養(yǎng)密度，提高細(xì)胞的產(chǎn)量。五、細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境1 無(wú)污染環(huán)境 培養(yǎng)環(huán)境無(wú)毒和無(wú)菌是保證細(xì)胞生存的首要條件，當(dāng)細(xì)胞放置在體外培養(yǎng)時(shí)，與體內(nèi)相比細(xì)胞丟失了對(duì)微生物和有毒物的防御能力。一但被污染或自身代謝物質(zhì)積累等，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此在進(jìn)行培養(yǎng)中，保持細(xì)胞生存環(huán)境無(wú)污染，代謝物及時(shí)消除等是維持細(xì)胞生存的基本條件。2 恒定的溫度 維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長(zhǎng)，必須有恒定的適宜溫度。人體細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)溫度36.50.5,偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會(huì)受到影響，甚

8、至死亡。五、細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境3 氣體環(huán)境 氣體是細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生供給細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的能量和合成細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的各種成分，如三大營(yíng)養(yǎng)素：蛋白質(zhì)、糖類、脂類。二氧化碳既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需成分，它在細(xì)胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的PH值。大多數(shù)的細(xì)胞的適宜PH值是7.27.4。五、細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境4 細(xì)胞培養(yǎng)基 培養(yǎng)基既是培養(yǎng)細(xì)胞中供給細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和促使細(xì)胞生殖、增值的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的生存環(huán)境。培養(yǎng)基的種類：（1） 合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞所需物質(zhì)的種類和數(shù)量嚴(yán)格配制而成的。內(nèi)含碳水化合物、氨基酸、

9、脂類、無(wú)機(jī)鹽、維生素、微量元素和細(xì)胞生長(zhǎng)因子等。五、細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境無(wú)機(jī)鹽 CaCl2、KCl、MgSO4、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4對(duì)調(diào)解細(xì)胞滲透壓、某些酸的活性及溶質(zhì)的酸堿度都是必要的。氨基酸 頡氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、組氨酸、酪氨酸、精氨酸、胱氨酸，它們都是細(xì)胞用以合成蛋白質(zhì)的必然原料。維生素 維生素是維持細(xì)胞的一種生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞中大多數(shù)形成酸的輔基或輔酶，對(duì)細(xì)胞的代謝有重大影響。碳水化合物 碳水化合物使細(xì)胞生命的能量來(lái)源，有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分，幾乎所有的培養(yǎng)基都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境（2）天然培養(yǎng)基

10、使用的最普遍的天然培養(yǎng)基是血清，如小牛血清，血清中含有多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子，促貼附因子及其多活性物質(zhì)，與合成培養(yǎng)基合用。5 細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)施和基本條件實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，如凈化條件。常用實(shí)施及設(shè)備。培養(yǎng)器皿等。六、培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài) 體外培養(yǎng)細(xì)胞根據(jù)它們?cè)谂囵B(yǎng)器皿是否能附在支持物上生長(zhǎng)特征，可分為貼附性生長(zhǎng)和懸浮性生長(zhǎng)兩大類。1 成纖維型細(xì)胞 在培養(yǎng)中的細(xì)胞及形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似時(shí)，皆可稱為成纖維細(xì)胞。本型細(xì)胞由形態(tài)與體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)相似而得名。細(xì)胞在支持物表面呈梭形或不規(guī)則三角形生長(zhǎng)，細(xì)胞中央與卵圓形核，胞質(zhì)向外伸出23厘米。六、培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)2 上皮細(xì)胞 此類型細(xì)胞在培養(yǎng)器皿支持物上生長(zhǎng)，具有扁平不規(guī)則多角形

11、特征，細(xì)胞中央有圓形核，細(xì)胞緊密相連，單層膜樣生長(zhǎng)。起源于內(nèi)、外胚層細(xì)胞，如皮膚，表皮衍生物，消化管上皮等組織細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，皆呈上皮形態(tài)生長(zhǎng)。3 游走型細(xì)胞 本型細(xì)胞在支持物上散在生長(zhǎng)，一般不連成片。細(xì)胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運(yùn)動(dòng)，速度快且不規(guī)則，如羊水細(xì)胞培養(yǎng)的早期。 七、營(yíng)養(yǎng)液配制1.HanKS液10倍濃縮液：甲液 NaCl 80g, KCl 4g, CaCl21.4g, MgSO4 2g.乙液 Na2HPO4 1.52g, KH2PO4 0.6g, 葡萄糖10g, 1%酚紅溶液16ml.甲乙液按順序分別溶于注射用水450ml中，然后將乙液加入甲液，補(bǔ)足水至1000ml，過(guò)

12、濾后加入氯仿2ml，置28保存，使用時(shí)作10倍稀釋。11615分鐘，使用前7.5%NaHCO3調(diào)PH值7.27.4。七、營(yíng)養(yǎng)液配制2 營(yíng)養(yǎng)液 0.5%乳漢液， 水解乳蛋白 5g， HanKS液 1000 ml， 完全溶解后分裝，經(jīng)116 15分鐘，28保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)為7.5%NaHCO3溶液，將PH值調(diào)到7.27.4。 3 3%谷氨酰胺溶液 L-谷氨酰胺 3 g， 注射用水 100 ml， 溶解后，濾過(guò)除菌，-20保存，使用時(shí)100 ml細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液加3%谷氨酰胺溶液1 ml。七、營(yíng)養(yǎng)液配制4 細(xì)胞分散液： 0.25%胰蛋白酶溶液 NaCl 8g, KCl 0.2g, 枸櫞酸鈉 1.12 g，

13、 磷酸二氫鈉 0.056 g， 碳酸氫鈉 1 g， 葡萄糖 1 g， 胰蛋白酶（1：250）2.5g， 注射用水加至1000 ml。放28，待胰蛋白酶完全溶解后，用0.2um的微孔濾膜或G6型玻璃器濾過(guò)除菌。分裝小瓶中，-20保存。5 7.5%NaHCO3溶液 碳酸氫鈉7.5 g， 注射用水100 ml。 用微孔或蔡氏濾器濾過(guò)除菌，分裝小瓶，凍結(jié)保存。6雙抗液 八、清潔液配制1 稀配方：重鉻酸鉀100 g，加純化水750 ml，加溫溶化，冷卻后緩緩加入濃硫酸250 ml。2 濃配方：重鉻酸鉀79 g，加純化水100 ml，加溫溶化，冷卻后緩緩加入濃硫酸1000 ml。3 注意：配制消毒液時(shí)，濃硫酸必須緩緩加入，若注入過(guò)快，易產(chǎn)生大量的熱反應(yīng)，危險(xiǎn)。九、細(xì)胞制備工藝 取10日齡SPF雞胚無(wú)菌手術(shù)取出雞胚 用 HanKS液洗3遍 去頭到入小燒杯剪碎 用HanKS液洗3遍 將剪碎的組織倒入0.25%胰酶液中 37消化40分鐘（或置入28冰箱過(guò)夜） 倒掉胰酶液 加玻璃珠分散細(xì)胞 加入營(yíng)養(yǎng)液 分裝到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)（