色譜方法驗(yàn)證審評(píng)指南

1、色譜方法通常用于原料、藥物、藥物制劑和生物體液中化合物的定性和定量。涉及的成分包括 手性的或非手性的藥物、過(guò)程雜質(zhì)、殘留溶媒、附加劑如防腐劑、分解產(chǎn)物、從容器和密閉包 裝或制造過(guò)程中帶入的可提取和可過(guò)濾的雜質(zhì)、植物藥中的農(nóng)藥和代謝物等。試驗(yàn)方法的目的是得到可信賴的和準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，無(wú)論是用于驗(yàn)收、出廠、穩(wěn)定性或藥物動(dòng)力學(xué) 研究。得到的數(shù)據(jù)用于藥品開(kāi)發(fā)或批準(zhǔn)后的定性和定量，試驗(yàn)包括原料的驗(yàn)收、藥物和藥物制 劑的出廠、過(guò)程檢驗(yàn)（In- process testing）的質(zhì)量保證和失效期的建立。方法的驗(yàn)證是由藥品的開(kāi)發(fā)者或使用者來(lái)檢驗(yàn)其方法是否達(dá)到預(yù)期的可靠性、準(zhǔn)確度和精密度 的過(guò)程。得到的數(shù)據(jù)成為方法

2、的驗(yàn)證資料的一部分交給CDER.。方法的驗(yàn)證對(duì)于完成機(jī)構(gòu)滿足檔案要求不是一次性的，開(kāi)發(fā)者和使用者都應(yīng)驗(yàn)證其方法的耐用 度或耐久性（ruggedness or robustness.），其他的分析者、用其它相當(dāng)?shù)膬x器，在其它的 日期或地點(diǎn)，在藥品生產(chǎn)期限（有效期）全過(guò)程，方法都應(yīng)能夠重現(xiàn)。如果產(chǎn)生數(shù)據(jù)的方法是可 靠的，那么所得到的驗(yàn)收、出廠、穩(wěn)定性或藥物動(dòng)力學(xué)的數(shù)據(jù)就是可信賴的。驗(yàn)證的過(guò)程和方 法的設(shè)計(jì)應(yīng)在開(kāi)發(fā)過(guò)程中重要的數(shù)據(jù)產(chǎn)生之前，如果方法改變了，還應(yīng)該再驗(yàn)證。色譜是一種技術(shù)，通過(guò)該技術(shù)，樣品中的組分載入液相或氣相中，通過(guò)在固定相上由吸附一解 吸附來(lái)完成。高效液相色譜（HPLC）HPLC分離

3、是基于在樣品在流動(dòng)相液體和固定相之間的不同分配。一般地說(shuō)HPLC大體分為以下 幾種（未考慮其重要性順序）手性液相色譜離子交換色譜離子對(duì)/親和色譜正相色譜反相色譜分子排阻色譜手性液相色譜分離光學(xué)異構(gòu)體可在手性固定相上，用衍生化試劑或在非手性固定相上用流動(dòng)相添加劑形成非 對(duì)對(duì)映體來(lái)實(shí)現(xiàn)。用作雜質(zhì)試驗(yàn)方法時(shí)，如果光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)在光學(xué)異構(gòu)體藥物之前洗脫，要 增加靈敏度。離子交換色譜分離基于荷電功能團(tuán)，樣品負(fù)離子（X -）為陰離子，樣品正離子（X + ）為陽(yáng)離子，一般用pH 程序洗脫。離子對(duì)/親和色譜分離基于與目標(biāo)樣品的專一的化學(xué)相互作用。更普遍的反相型用緩沖液和加入的對(duì)離子（與被 分離的樣品荷相反電荷

4、）分離。分離受pH、離子強(qiáng)度、溫度、濃度和共存的有機(jī)溶劑類型的影 響。親和色譜，一般用于大分子，使用配合體（共價(jià)結(jié)合在固體基質(zhì)上的生物活性分子），與 其同類的抗原（分析介質(zhì)）反應(yīng)，生成可逆轉(zhuǎn)的復(fù)合物，通過(guò)改變緩沖條件洗脫。正相色譜正相色譜為用有機(jī)溶劑為流動(dòng)相和極性的固定相。此時(shí)較小極性的組分比較大極性組分更快地 洗脫。反相色譜報(bào)給CDER的最通常的實(shí)驗(yàn)方法是反相HPLC方法，最通常用紫外檢測(cè)器。反相色譜，一種鍵合相的色譜技術(shù)，用水作基本溶劑，選擇性也受溶劑強(qiáng)度、柱溫和pH的影 響，一般來(lái)說(shuō)較大極性比較小極性組分洗脫更快。紫外檢測(cè)器可以用于所有色譜，這類檢測(cè)器要注意的是燈老化后的靈敏度降低，其靈

5、敏度因（儀器）的設(shè)計(jì)和/或者制造廠家的不同有小的變異。需要指出，用紫外檢檢測(cè)器和反相HPLC組 合得到的色譜圖不一定能真實(shí)的反映事實(shí)，原因是：極性比目標(biāo)化合物大得多的化合物可能被掩蓋（在溶劑前沿或死體積時(shí)同時(shí)洗脫）。極性比目標(biāo)化合物小得多的化合物洗脫出來(lái)晚，甚至保留在柱上。紫外吸收系數(shù)較低和最大吸收不同的化合物在檢測(cè)相對(duì)較低濃度的目標(biāo)分析物時(shí)不能被檢 出，因?yàn)橥ǔＶ挥幸粋€(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)。排阻色譜也叫凝膠滲漉（permeation）或?yàn)V過(guò)，分離基于化合物分子大小或水動(dòng)力學(xué)（hydrodynamic）容 積。比多孔柱填料孔徑大得多的分子最先洗脫，小分子進(jìn)入孔隙洗脫晚，其余的洗脫速率取決 于其分子的相對(duì)大

6、小。氣相色譜（GC）氣相色譜基于揮發(fā)性樣品由作為流動(dòng)相的載氣運(yùn)載，通過(guò)色譜柱內(nèi)的固定相時(shí)發(fā)生吸附和解吸 附過(guò)程進(jìn)行分離。通常氣相色譜分析的樣品是低分子量化合物，這些化合物是易揮發(fā)的和高溫時(shí)穩(wěn)定的。在這一 方面，藥物和藥物制劑中的殘留溶劑適于氣相色譜分析。生成化學(xué)衍生物可達(dá)到易揮發(fā)和熱穩(wěn) 定的目的。常用的檢測(cè)器是用于含碳化合物的火焰離子化檢測(cè)器（FID），用于鹵代化合物的電子捕獲式 檢測(cè)器（ECD），用于含硫和含磷化合物的火焰光度檢測(cè)器（FPD），以及用于含氮或磷化合物 的氮磷檢測(cè)器（NPD）。氣相色譜也能實(shí)現(xiàn)手性分離。填充柱迅速被毛細(xì)管取代來(lái)改進(jìn)分離度 和分析時(shí)間，在氣相色譜上分析物位置與HP

7、LC 一樣，用保留時(shí)間（Rt）表示。薄層色譜（TLC）薄層色譜是一種最簡(jiǎn)便普通的色譜技術(shù)，分離基于在一端浸于溶劑混合物（流動(dòng)相）中的薄層 板（固定相）上點(diǎn)的樣品移動(dòng)進(jìn)行分離，整個(gè)系統(tǒng)在密封的缸中進(jìn)行。對(duì)于本身沒(méi)有顏色的化合物，檢出技術(shù)包括熒光、紫外和噴霧顯色劑（通用的和專一的）。分析物在薄層板上的位置用Rf值來(lái)表示，Rf值為化合物的移動(dòng)距離與溶劑前沿的比值。三種方法，氣相、液相和薄層中，薄層色譜是最普通的試驗(yàn)方法，因?yàn)楸影迳纤械慕M分都 可用適宜的檢測(cè)技術(shù)檢出。然而通常不如HPLC那么準(zhǔn)確和靈敏。雖然選用適宜的檢測(cè)技術(shù)， TLC法能見(jiàn)到分析的“全圖”（whole picture），但比HPL

8、C分析變異較大。.參考標(biāo)準(zhǔn)品（對(duì)照品）參考標(biāo)準(zhǔn)品為經(jīng)充分鑒定的高純度化合物，色譜方法更大程度上依賴參考標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)提供準(zhǔn)確的 數(shù)據(jù)。因而參考標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量和純度是很重要的，有二類參考標(biāo)準(zhǔn)品，化學(xué)的和放射性的。后 者應(yīng)考慮放射標(biāo)記純度和化學(xué)純度。按照提交方法驗(yàn)證的樣品和分析數(shù)據(jù)，指南中的二類化學(xué)參考標(biāo)準(zhǔn)品如下：-USP / NF參考標(biāo)準(zhǔn)品，不需要鑒定。-非總目錄標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用合理方法制備，并經(jīng)充分鑒定，以保證其鑒別、含量、質(zhì)量和純度 達(dá)到最高。應(yīng)該指出-大多數(shù)USP / NF參考標(biāo)準(zhǔn)品未標(biāo)示化合物純度。-對(duì)非USP參考標(biāo)準(zhǔn)品，提出純度的校正數(shù)應(yīng)包括在試驗(yàn)方法的計(jì)算中。-提供的參考標(biāo)準(zhǔn)品中沒(méi)有以下雜質(zhì)，諸

9、如合成過(guò)程的結(jié)構(gòu)相似的雜質(zhì)和其它的過(guò)程雜質(zhì)， 如重金屬、殘留溶劑、水分（結(jié)合的和非結(jié)合的）、植物來(lái)源制劑中的農(nóng)藥和分解產(chǎn)物等。-如果在方法中規(guī)定，用前參考標(biāo)準(zhǔn)品要干燥除去殘留溶劑、非結(jié)合水分和有時(shí)是結(jié)合水（取決于干燥條件），對(duì)易潮解的化合物總是包括干燥步驟的。但另一方面干燥可能導(dǎo)致結(jié)晶 水的損失或引起熱敏感化合物的降解。色譜方法用外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。外標(biāo)法當(dāng)參考標(biāo)準(zhǔn)品與樣品在不同的色譜圖上進(jìn)行分析時(shí)，用外標(biāo)法。定量基于樣品的峰面積/高 （HPLC或GC）或強(qiáng)度（TLC）與分析對(duì)象、參考標(biāo)準(zhǔn)品的比值。更適合用外標(biāo)法的樣品如下：樣品具有單一的目標(biāo)濃度和狹窄的濃度范圍，例如驗(yàn)收和出廠檢驗(yàn)。簡(jiǎn)便的

10、樣品制備操作。增加走基線的時(shí)間，為檢測(cè)可能的額外峰，如雜質(zhì)試驗(yàn)。內(nèi)標(biāo)法加入一種已知純度并且在分析中不產(chǎn)生干擾的化合物至樣品混合液中，定量基于被分析的化合 物與內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)比值與參考標(biāo)準(zhǔn)品得到的比值進(jìn)行比較。這一方法很少用于TLC。更適合用內(nèi)標(biāo)法的樣品如下：復(fù)雜的樣品制備過(guò)程，如多次提取。低濃度的樣品（靈敏度是確定的），如藥代動(dòng)力學(xué)的研究。在樣品分析中預(yù)計(jì)是很寬的濃度范圍，如藥物動(dòng)力學(xué)研究。雖然CDER不規(guī)定方法應(yīng)該用內(nèi)標(biāo)或外標(biāo)法用于定量，但一般的看法是用于驗(yàn)收、穩(wěn)定性和TLC用外標(biāo)法，對(duì)生物體液和GC用內(nèi)標(biāo)法。工作濃度為方法中規(guī)定的被分析對(duì)象的目標(biāo)濃度。保持樣品濃度與標(biāo)準(zhǔn)的濃度相近可以改善方 法

11、的準(zhǔn)確性。建議如果參考標(biāo)準(zhǔn)品的純度校正因子已知，那么在計(jì)算中應(yīng)該包括。在方法中要規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的工作濃度。2005-2-13 8:24:00 IP:60.55.40.250主題：RE:分享色譜方法驗(yàn)證審評(píng)指南（轉(zhuǎn)貼）查看該用戶在資料中心上傳的資料個(gè)人資料給他留言帖子合集回復(fù)引用維護(hù).藥物和藥物制劑HPLC驗(yàn)證的參數(shù)雖然許多種HPLC都可采用，但最普遍上報(bào)的方法都是用紫外檢測(cè)器的反相HPLC法，以此作為 驗(yàn)證參數(shù)的例子。這一方法驗(yàn)證的規(guī)定可以擴(kuò)展到其它檢測(cè)器和其它色譜。對(duì)于驗(yàn)收、出廠或 穩(wěn)定性試驗(yàn)，準(zhǔn)確性應(yīng)最佳化，因?yàn)橐砻鲗?shí)測(cè)值和真值的差異是最為關(guān)注的。準(zhǔn)確性準(zhǔn)確性是衡量測(cè)量實(shí)驗(yàn)值和真值的接

12、近程度。推薦藥物和藥物制劑的準(zhǔn)確性研究在標(biāo)示量的 80%、100% 和 120% 的水平上來(lái)進(jìn)行的，這與 “The Guideline for Submitting Samples and Analytical Data for method Validation ”的規(guī)定是一致的。對(duì)于藥物制劑，準(zhǔn)確性試驗(yàn)通常是將已知量的藥物按重量或體積（溶于稀釋劑）以分析對(duì) 象檢測(cè)濃度的線性范圍量加到空白處方內(nèi)來(lái)完成的。對(duì)于液體制劑，這是真實(shí)的回收率；而對(duì) 于諸如片劑、栓劑、透皮吸收制劑等，這不能檢測(cè)稀釋劑中的賦形劑與活性成分間可能產(chǎn)生的 作用。實(shí)際上要做一個(gè)已知活性藥物量的單個(gè)劑量單位（single un

13、it）來(lái)進(jìn)行回收試驗(yàn)是困 難的。準(zhǔn)確性試驗(yàn)評(píng)價(jià)在賦形劑存在時(shí)，在分析藥物制劑的色譜條件下，試驗(yàn)方法的專屬性。 但這只是樣品制備過(guò)程和色譜過(guò)程中的回收率，而不是制造過(guò)程的影響。在每個(gè)推薦檢測(cè)濃度重復(fù)進(jìn)樣，其重復(fù)進(jìn)樣的RSD提供了分析方法的變動(dòng)性，或是試驗(yàn)方法的 精密程度。重復(fù)性的均值以標(biāo)示量的來(lái)表示，這表明試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確程度。建議回收試驗(yàn)在每個(gè)水平上（標(biāo)示量的80%、100%和120%）至少做3份，均數(shù)用來(lái)估計(jì)準(zhǔn)確性的， RSD是估計(jì)樣品分析精密度的。檢出限和定量限這些限度通常用于藥物和藥物制劑中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。限度的規(guī)定連同藥物和藥物制劑出廠和 穩(wěn)定性有關(guān)的調(diào)整雜質(zhì)量的方法一起要上報(bào)。檢出限度

14、是樣品中分析對(duì)象在實(shí)驗(yàn)條件下可被檢出的最低限度，但不要求定量。定量限度是樣 品中分析對(duì)象在實(shí)驗(yàn)條件下，以可接受的精密度和準(zhǔn)確性定量測(cè)定的最低濃度。使用UV檢測(cè)器時(shí)，保證低濃度化合物的檢測(cè)精密度是困難的，這是由于檢測(cè)器的燈隨著壽命 的延長(zhǎng)可能逐漸減小其靈敏度，不同檢測(cè)器制造廠家的躁聲水平也不同。在低濃度時(shí)，保證每 次試驗(yàn)方法能達(dá)到檢出限度和定量限度是必要的。指定的雜質(zhì)無(wú)對(duì)照品，但是又要保證檢出 限，額外峰可能不出現(xiàn)或出現(xiàn)。對(duì)評(píng)價(jià)額外峰檢出的可行的粗糙方法是用以分析對(duì)象峰面積的 百分比的要求作為檢出限。例如檢出限要求分析對(duì)象峰面積50000的0.01%，那么給出面積 計(jì)數(shù)為5,則不能檢出。雖然US

15、P表示檢出限和定量限分別用躁聲水平的2或3和10倍表示，但這一概念不是很實(shí)際 的。在方法研究階段，用不同的檢測(cè)器分析樣品時(shí)，檢測(cè)器的躁聲水平是不同的。在定量限水 平的試驗(yàn)方法中使用對(duì)照品（由申報(bào)者提供）能保證雜質(zhì)可被檢出和被定量。檢測(cè)器靈敏度因型號(hào)和制造廠家的不同而異，見(jiàn)表1。用二種商用檢測(cè)器分析一種化合物，這 些數(shù)據(jù)不應(yīng)作為二種檢測(cè)器靈敏度預(yù)期的比例。在設(shè)定這些限度時(shí)，因?yàn)檫€有起部分作用的其 它參數(shù)，如燈和柱的壽命，但它們是不知道的。表1二種商用檢測(cè)器的檢出靈敏度限度比較檢測(cè)器1檢測(cè)器2定量限度0.21% 0.07%檢出限度0.16% 0.05%人們應(yīng)該注意，基線躁聲不應(yīng)解釋為額外峰。如果樣

16、品的稀釋劑與流動(dòng)相所用的溶劑不同（比 例或類型），亦可能在死體積處見(jiàn)到波動(dòng)。如果有目標(biāo)化合物的參考標(biāo)準(zhǔn)品，那么要使用接近定量限的或按規(guī)定配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液。記錄沒(méi) 有參考標(biāo)準(zhǔn)品的雜質(zhì)峰時(shí)，推薦使用藥物的稀釋液作為參考標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后對(duì)方法要進(jìn)行校 正，測(cè)定的高低濃度都要在藥物檢出線性范圍內(nèi)，否則用相同色譜圖下面積或峰高的表示是 有偏差的。應(yīng)該注意得到的用面積計(jì)數(shù)的額外峰不能被認(rèn)為是取決于該化合物UV吸收系數(shù)或 吸收度的檢出響應(yīng)。建議分析重現(xiàn)性和進(jìn)樣重現(xiàn)性數(shù)據(jù)應(yīng)在定量限度范圍內(nèi)。在試驗(yàn)方法的定量限的濃度處，用一外加的參考標(biāo)準(zhǔn)溶液。線性符合比耳定律的可檢出的線性范圍取決于被分析化合物和所用的檢測(cè)器。工作

17、樣品的濃度和準(zhǔn) 確性試驗(yàn)樣品的濃度應(yīng)在線性范圍內(nèi)。圖1和2表明UV響應(yīng)和濃度的（a）線性和非線性關(guān)系。有一點(diǎn)應(yīng)該注意，當(dāng)記錄雜質(zhì)峰時(shí) （用母體藥物的面積表示），如果使用非線性的濃度曲線部分，觀察到的雜質(zhì)可能不是理論 計(jì)數(shù)的真實(shí)反映。另外，僅當(dāng)雜質(zhì)和母體化合物的吸收系數(shù)或吸收度值相同時(shí)才能得到真實(shí)的 量。雜質(zhì)參考標(biāo)準(zhǔn)品通常是必需的。建議檢測(cè)的線性范圍取決于試驗(yàn)方法的目的，用于含量測(cè)定方法的推薦范圍為不得過(guò)土 20%，以峰 面積%計(jì)的測(cè)定雜質(zhì)的范圍是目標(biāo)濃度的+20%，低至藥物或雜質(zhì)的定量限。在大多數(shù)情況下， 回歸系數(shù)要0.999,截距和斜率應(yīng)標(biāo)明。精密度精密度為在相同分析條件下的一組測(cè)量值相互接

18、近的程度。ICH定義精密度含有3個(gè)部分，即 重復(fù)性（repeatability ）組間精密度（intermediate precision ）和重現(xiàn)性（reproducibility ）。在 USP 1990，1225 頁(yè)中的耐用度（ruggedness ）具體體現(xiàn)在這一指 南的組間精密度，重現(xiàn)性和耐久性（robustness ）概念中。重復(fù)性a. 進(jìn)樣重復(fù)性靈敏度是檢出樣品中分析對(duì)象濃度小量的變化的能力。靈敏度可以通過(guò)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中的進(jìn) 樣重現(xiàn)性的規(guī)定來(lái)部分的控制。多次注射均一樣品（制備的溶液）測(cè)量的靈敏度和精密度，表明在色譜條件下測(cè)定當(dāng)天HPLC 儀器的性能。這一信息作為驗(yàn)證數(shù)據(jù)和系統(tǒng)適

19、用性試驗(yàn)的一部分。以百分變異系數(shù)（CV%）或 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）的規(guī)定來(lái)測(cè)定其分析的變異限度。值越接近人們可以期待結(jié)果更精密或 對(duì)結(jié)果的變化更靈敏。這是假設(shè)在系統(tǒng)適用性試驗(yàn)后色譜儀功能未失常的情況下的。然而要注 意這不是考慮由藥品制造和實(shí)驗(yàn)室樣品制備引起的變異。作為進(jìn)樣和R t的變異的例子，表2 提供了在進(jìn)樣過(guò)程中色譜系統(tǒng)漏液時(shí)收集的數(shù)據(jù)。四個(gè)重復(fù)的樣品分別進(jìn)樣，注意其峰面積的 變異和保留時(shí)間的漂移。從性能良好的系統(tǒng)得到的一組典型數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。表2進(jìn)樣中色譜系統(tǒng)系統(tǒng)漏液時(shí)的重復(fù)性數(shù)據(jù)樣品R t峰面積AR t峰面積A1A2 5.625.66 21556992120466 0.04 35233B

20、1B2 5.876.13 22056592288355 0.26 82696C1 C2 6.216.48 22270662265279 0.27 38213D1 D2 6.736.99 25818882602016 0.26 20128表3色譜系統(tǒng)功能正常時(shí)的進(jìn)樣重復(fù)性數(shù)據(jù)劑型N均數(shù)土 SD RSD吸入溶液 10 1993162 5029 0.25%吸入用溶液 10 1722253 6288 0.37%膠囊 10 1744320 3133 0.18%建議作為方法驗(yàn)證的一部分，建議最少10次進(jìn)樣，RSDW1%。對(duì)于藥物或藥物制劑中的活性成分出 廠和穩(wěn)定性研究，其RSDW1%。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的精密度RSD至少5次進(jìn)樣。對(duì)低濃度雜質(zhì)， 較高的變異系數(shù)可以接受。b.分析重復(fù)性分析重復(fù)性由同一分析者在相同的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行的多次測(cè)量，用RSD表示。實(shí)際上，它常常 與準(zhǔn)確性一起進(jìn)行研究，見(jiàn).A部分準(zhǔn)確性項(xiàng)下。組間精密度組間精密度以前作為持久穩(wěn)定性的一部分。該數(shù)據(jù)用來(lái)評(píng)價(jià)在與方法研究過(guò)程不同的條件下的 方法可靠性。目的是保證同樣的樣品在方法研究期后進(jìn)行分析能得到相同的結(jié)果。取根據(jù)時(shí)間和條件，方法可以在多天、多個(gè)分析工作者和多臺(tái)儀器上試驗(yàn)。良好的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)規(guī)定可以部分地保證試驗(yàn)方法的組間精密度。因此設(shè)定嚴(yán)格的但實(shí)際的 系