酶工程第十節(jié)酶和現(xiàn)代生命科學(xué)

1、關(guān)于酶工程第十節(jié)酶與現(xiàn)代生命科學(xué)第一張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 一、酶是分子生物學(xué)研究的重要工具 酶是分子生物學(xué)研究的重要工具。特別是限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)提供了特異剪切DNA的工具,促進(jìn)了DNA重組技術(shù)誕生,推動(dòng)了基因工程發(fā)展,成為分子生物學(xué)研究的不可缺少的工具. Hind 的識(shí)別序列和切割位點(diǎn) 5 - GTPy PU AC - 3 3 - CAPU Py TG - 5 第二張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 限制性內(nèi)切酶在基因工程中的應(yīng)用 基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、遺傳工程，或重組體DNA技術(shù)。它是根據(jù)人們預(yù)先設(shè)想，采用酶學(xué)的

2、方法，將目的基因（所需要的基因）重組到一個(gè)適宜的載體上組成重組子，再將重組子轉(zhuǎn)化到適當(dāng)受體細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增表達(dá)，以達(dá)到改造生物細(xì)胞的目的的技術(shù)。 基因工程的整個(gè)過程由工程菌（細(xì)胞）的設(shè)計(jì)構(gòu)建和基因產(chǎn)物的生產(chǎn)兩大部分組成。前者主要在實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行，其單元操作過程如下：第三張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第四張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 基因工程的單元操作過程如下：（1）從供體細(xì)胞中分離出基因組DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶分別將外源DNA（包括外源基因或目的基因）和載體分子切開。 （2）用DNA連接酶將含有外源基因的DNA片段接到 載體分子上，形成DNA重組分子。（3）借助于細(xì)胞

3、轉(zhuǎn)化手段將DNA重組分子導(dǎo)入受 體細(xì)胞中。（4）短時(shí)間培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以擴(kuò)增DNA重組分子 或使其整含到受體細(xì)胞的基因組中。（5）篩選和鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，獲得使外源基因高 效穩(wěn)定表達(dá)的基因工程菌或細(xì)胞。 第五張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 關(guān)于限制性內(nèi)切酶 Restriction endonueleases 限制性核酸內(nèi)切酶簡(jiǎn)稱限制性內(nèi)切酶，是一類能識(shí)別雙鏈DNA中特定核苷酸序列并具有專一切割位點(diǎn)的脫氧核糖核酸水解酶。 主要存在于細(xì)菌、霉菌中，至今已分離到1000種以上，搞清識(shí)別序列的有300種以上。第六張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 有關(guān)限制性內(nèi)切酶發(fā)現(xiàn)的幾個(gè)重要實(shí)驗(yàn) 50

4、年代初，Luria和Human在研究T4噬菌體感染作用、Bertani和Weigle在研究和P2噬菌體與宿主細(xì)胞關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌內(nèi)限制與修飾現(xiàn)象。 發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌內(nèi)存在限制修飾系統(tǒng)，在這兩個(gè)系統(tǒng)中包括限制酶和修飾酶。限制酶能識(shí)別并降解與自身無關(guān)的外源DNA，而修飾酶則可通過甲基化修飾自身DNA，免被限制酶降解。 第七張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月Bertani和Weigle大腸桿菌噬菌體感染實(shí)驗(yàn)Bertani和Weigle在探索和P2噬菌體與宿主細(xì)胞關(guān)系時(shí)，均提出了噬菌體感染大腸桿菌后，宿主細(xì)胞對(duì)入侵的噬菌體DNA表現(xiàn)有特異的限制作用。 CEcoli.CEcoli.CEcoli.K1

5、2大量繁殖受到抑制第八張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月Meselson和Yuan實(shí)驗(yàn)噬菌體 K12和 C的DNA分別與由K12菌體制備的細(xì)胞抽提物保溫，并藉蔗糖密度梯度離心觀察兩種DNA沉降速度的變化。 K12 DNA C DNA加入K12菌體制備的細(xì)胞抽提物蔗糖密度梯度離心第九張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 實(shí)驗(yàn)表明，這種限制的本質(zhì)是宿主細(xì)胞K12中存在有能使外來DNA( CDNA)有限降解的核酸水解酶。 此后，又進(jìn)一步證實(shí)了大腸桿菌K12中的修飾體系即為甲基化酶，該酶修飾了 K12 DNA上的特異部位，使其不被限制體系的酶切割。結(jié)論表明：第十張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作

6、于2022年6月1965年阿爾伯首次從理論上提出了生物體內(nèi)存在著一種具有切割基因功能的限制性內(nèi)切酶。并于1968年成功分 離出I型限制性內(nèi)切酶與修飾酶。證實(shí)在細(xì)菌內(nèi)存在兩種不同功能但又相關(guān)的酶。1970年史密斯從流感噬血桿菌d株中分離出了II型限制性內(nèi)切酶；同年內(nèi)森斯使用該酶降解獼猴腫瘤病毒SV40的DNA，首次完 成了對(duì)基因的切割，排列了酶切圖譜。從此成為分子克隆技術(shù)中不可缺少的工具酶，推動(dòng)了基因工程的發(fā)展。1978年，上述三人因?qū)ο拗菩詢?nèi)切酶的貢獻(xiàn)獲得諾貝爾獎(jiǎng)。第十一張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月阿爾伯(1929) 瑞士微生物遺傳學(xué)家 H.O.史密斯(1931) 美國(guó)分子生物學(xué)

7、家、遺傳學(xué)家 內(nèi)森斯(1928) 美國(guó)微生物遺傳學(xué)家 第十二張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 限制性內(nèi)切酶命名規(guī)則 限制酶的命名從其來源微生物的拉丁名中摘取，即由其屬名的第一個(gè)字母(大寫)與種名的第一、二兩個(gè)字母(小寫)組成酶的基本命名，若酶的產(chǎn)生菌有株系之分，則有4個(gè)或4個(gè)以上拉丁字母組成，其第四個(gè)字母之后表示株系。 如 EcoRI來源于Echerichia.coli RY13 BamHI來源于B.amyloliquefaciens第十三張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月H in d IIHaemophilus(屬名)Influenzae(種名)d(株系)羅馬數(shù)字限制性內(nèi)切

8、酶命名舉例第十四張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 限制性內(nèi)切酶分類 已發(fā)現(xiàn)的限制酶可以分為三類或稱作三型：I、II、III型。他們?cè)诿阜磻?yīng)中所需要的輔因子和切割DNA的位點(diǎn)都不相同，而且酶蛋白分子的大小和組成上也有差別。第十五張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 類別反應(yīng)必須因子專一性 活性 I型S-腺苷基蛋氨酸，ATP，Mg2+識(shí)別部位和切點(diǎn)不同，無特定切割位點(diǎn)內(nèi)切甲基化 II型Mg2+切斷識(shí)別部位或其附近的特定部位只有限制酶活性 III型ATP，Mg2+識(shí)別部位和切點(diǎn)不同，但切斷特定部位內(nèi)切甲基化限制性內(nèi)切酶分類第十六張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第十七張，PP

9、T共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 二、 II 型限制性內(nèi)切酶的特性 II型限制酶的識(shí)別特異性 回文識(shí)別序列 II型限制酶的識(shí)別序列大多是具有 雙重對(duì)稱結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu),或稱回文序列 (Palindromic Sequence)第十八張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 非典型回文識(shí)別序列 回文識(shí)別序列被一至幾個(gè)其他核苷酸（N）所間隔，得到的是非典型的雙軸對(duì)稱性序列。 Bgl I GCCNNNNNGGCMst II CCTNAGG第十九張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 非回文識(shí)別序列 也有些限制酶識(shí)別序列非回文結(jié)構(gòu)，切割位點(diǎn)在距識(shí)別序列5至13個(gè)bp處。5 GACGCNNNNN 33

10、 CTGCGNNNNNNNNNN 5例：Hgn I GACGC第二十張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 有些限制酶可識(shí)別多重序列。如：Hind II，識(shí)別序列為GTPyPuAC，可識(shí)別三種序列。GTPyPuACGTCAACGTCGACGTTAACGTTGAC嘌呤（Purine）嘧啶（Pyrimidine）類似的內(nèi)切酶還有 Acc I 、Ava I 、Ban I 、Hae I 等，它們的特異性低于單一識(shí)別序列的酶。第二十一張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 識(shí)別序列的長(zhǎng)度與剪切頻率 大部分II型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列長(zhǎng)度為4-8個(gè)核苷酸。識(shí)別長(zhǎng)度決定了剪切DNA的頻率（1/4n，

11、n為識(shí)別的長(zhǎng)度）。識(shí)別長(zhǎng)度愈長(zhǎng)，則切點(diǎn)少、產(chǎn)生片段少而長(zhǎng)度長(zhǎng)，酶特異性高。第二十二張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 限制酶的切割特異性和酶切片段的末端結(jié)構(gòu) 切割位點(diǎn)專一 作為工具酶的限制性內(nèi)切酶有固定的切割位點(diǎn)； 產(chǎn)物具有特定的末端結(jié)構(gòu) 當(dāng)一個(gè)DNA分子被限制酶切開后形成兩個(gè)末端，全部產(chǎn)物具有相同的末端結(jié)構(gòu)。即一種限制性內(nèi)切酶切割任何DNA只產(chǎn)生一種固定形式的末端結(jié)構(gòu)，在DNA連接酶的作用下，磷酸二酯鍵可以修復(fù)而成為一個(gè)重組的DNA分子；而不同限制酶則形成不同末端結(jié)構(gòu)。5 - G3 - CTTAA +AATTC - 3 G - 55 - GAATTC - 33 - CTTAAG -

12、5 DNA連接酶5 - GAATTC - 33 - CTTAAG - 5第二十三張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 任何一種限制酶切割DNA鏈時(shí)，總是水解核苷酸 3、5-磷酸雙酯鍵的3位磷酸酯鍵，使產(chǎn)物的5端帶磷 酸單酯基團(tuán)，而3為游離羥基。 由于切割位點(diǎn)不同，所有的限制酶可產(chǎn)生兩類末端結(jié)構(gòu) 平末端（Blunt End）指酶切片段為齊頭末端結(jié)構(gòu) 。 粘性末端（Cohesive End）酶切后DNA片段末端帶有 1-4個(gè)核苷酸殘基長(zhǎng)度的單鏈結(jié)構(gòu) ，而片段 兩端突出的單鏈具有互補(bǔ)的序列。 粘性末端又可分為 5-粘性末端與 3-粘性末端。 5 NOH 3 5PO4N 3第二十四張，PPT共五

13、十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十五張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月粘性末端3-粘性末端5-粘性末端平末端 5 - GAATTC - 3 3 - CTTAAG - 5 EcoR I 5 -G AATTC - 33 -CTTAA G - 5 5 - CTGCAG - 3 3 - GACGTC - 5 Pst I5 - CTGCA G - 33 - G ACGTC - 5 5 - CCCGGG - 3 3 - GGGCCC - 5 Sma I5 - CCC GGG - 33 - GGG CCC - 5第二十六張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 有沒有例外？ （1）相同的限制性內(nèi)切

14、酶不總是產(chǎn)生匹配的片段A） 含多重識(shí)別序列的限制酶 如 Hind II 在順序GTPyPuAC 剪切，可產(chǎn)生3種不同 類型片段，互相連接的可能性為 1/3。B） 含非典型識(shí)別序列的限制酶 如 EcoN I 在順序CCTNNNNNAGC 剪切，N可以是任何核 苷酸，由于N的隨意性，往往會(huì)產(chǎn)生不廣泛匹配的片段。C） 在次理想條件下，限制酶表現(xiàn)出星狀活性，影響正常匹配。第二十七張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 （2）不同的限制性內(nèi)切酶有時(shí)可以產(chǎn)生匹配的片段 例： BamH I GGATCCBcl I TGATCABgl II AGATCT 這類能產(chǎn)生相同粘性末端而識(shí)別特異性不同的限制酶稱作

15、同尾限制酶（Isocaudarner）。同尾限制酶產(chǎn)生的DNA片段可借DNA連接酶互相重組，但新產(chǎn)生的雜合序列將不再被原有的限制酶所識(shí)別。 5 - G GATCT - 3 DNA 5 - GGATCT - 3 3 - CCTAG A - 5 連接酶 3 - CCTAGA - 5 (BamH I 片段) (Bgl II 片段) (產(chǎn)生雜合識(shí)別序列) 第二十八張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 酶反應(yīng)條件 按手冊(cè)或商品說明書 反應(yīng)緩沖液：根據(jù)不同酶使用高、中或低鹽緩沖液。 常用的緩沖液選擇 Tris-Hcl 。同時(shí)還 要加入 Mgcl2 和 2-巰基乙醇。 反應(yīng)溫度： 一般限制性內(nèi)切酶的反

16、應(yīng)溫度是 37c。 酶活性單位： 1個(gè)酶活性單位是指一種酶在其最適宜的 反應(yīng)條件下，1小時(shí)使 1g 噬菌體DNA 底物完全水解的酶量。但由于許多因素可 影響內(nèi)切酶的水解反應(yīng)和用量，實(shí)際用量 需比所需用量多加一倍左右。第二十九張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 第二活性 在次理想條件下,一些限制性內(nèi)切酶的特異型會(huì)被降低,只有部分正常識(shí)別位置被識(shí)別,此稱為第二活性（Secondary Activity），也稱星號(hào)活性（Star Activity），加以“ *”表示，如 EcoR I*。酶的第二活性將引起底物DNA鏈上切口增多，酶解片斷變小，造成特異性降低。例：理想條件下 （PH=7.5）

17、EcoR I GAATTC 次理想條件下 （PH=8.5） EcoR I * AATT次理想條件：通常包括不適合的離子強(qiáng)度、過高的PH、 二價(jià)金屬離子的替換、較高的甘油濃度等。第三十張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 限制酶的保質(zhì)期 一般是在檢定日以后的一年內(nèi)，但幾乎所有的限制酶在超過保質(zhì)期后都不會(huì)急劇失活, 因此購入后即使是經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間保存的酶, 也完全可以使用，但這些酶在使用前最好再測(cè)一次活性。另外，保存酶時(shí)即便讓其凍結(jié)，大部分酶也不會(huì)急劇失活。 第三十一張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月EcoRI第三十二張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月PstI第三十三張，PPT共

18、五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月SmaI return第三十四張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 研究酶的理化性質(zhì)及其作用原理，對(duì)于闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)和規(guī)律具有十分重要的意義（包括酶的結(jié)構(gòu)功能、酶與代謝調(diào)節(jié)、酶與生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、進(jìn)化、疾病等） 。 從酶分子水平去探討酶與生命活動(dòng)、與代謝調(diào)節(jié)、與疾病、生長(zhǎng)發(fā)育等等的關(guān)系，對(duì)闡明某些生命活動(dòng)的本質(zhì)和規(guī)律，無疑也具有十分重要的意義。 二、酶是生命科學(xué)研究的重要對(duì)象第三十五張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 同功酶同工酶(isoenzyme)是指催化的化學(xué)反應(yīng)相同，而酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)乃至免疫學(xué)性質(zhì)不同的一組酶,存在于生物的同一

19、種屬或同一個(gè)體的不同組織、甚至同一組織或細(xì)胞中。目前已發(fā)現(xiàn)有150多種酶具有同工酶，如6-磷酸葡萄糖脫氫酶、乳酸脫氫酶、酸性和堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酸磷酸激酶、核糖核酸酶、過氧化酶和膽堿酯酶等。其中，發(fā)現(xiàn)最早，研究最多的是乳酸脫氫酶（LDH）同工酶.第三十六張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月例：LDH同工酶的兩種亞基以不同比例組成五種四聚體：LDH1(H4)、LDH2(H3M)、LDH3(H2M2)、LDH4(HM3)和LDH5(M4)。 Dogfish LDH M4結(jié)構(gòu)圖 第三十七張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 同功酶與物種進(jìn)化 同工酶是生物進(jìn)化過程中為適

20、應(yīng)愈趨復(fù)雜的代謝而引起的一種分子進(jìn)化，以適應(yīng)不同組織或不同細(xì)胞器在代謝上的不同需要. 同功酶在各器官和組織中的分布不同。這樣就可以根據(jù)同工酶酶譜差異并配合其它方法從分子水平探討物種進(jìn)化、遺傳變異等一些生命現(xiàn)象。第三十八張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 在正常情況下血清中同功酶譜是相對(duì)穩(wěn)定的。當(dāng)某一組織或器官發(fā)生病變時(shí)，就有某種特殊的同工酶釋放出來，引起血清中同功酶活性的改變。對(duì)病人及正常人同工酶電泳圖譜進(jìn)行比較，有助于上述器官疾病的診斷。 在臨床上已應(yīng)用同工酶做診斷指標(biāo),例如: 冠心病及冠狀動(dòng)脈血栓引起的心肌受損者血清中LDH(H4)及LDH2(MH3)含量增高; 而肝細(xì)胞受損患者血

21、清中LDH5(M4)增高。第三十九張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 同功酶與其它 同工酶的研究不僅在臨床血液病、腫瘤及其它疾病的診斷方面占有重要地位，而且在分子遺傳學(xué)、物種鑒定、法庭取證、親子鑒定、優(yōu)生優(yōu)育等領(lǐng)域中也具有廣闊的應(yīng)用前景。 第四十張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 腫瘤的酶異常 腫瘤酶異常原因：1、腫瘤過多或過少產(chǎn)生酶2、腫瘤阻塞了酶通過的導(dǎo)管系統(tǒng)3、腫瘤誘導(dǎo)酶產(chǎn)生4、細(xì)胞通透性改變使可溶性酶進(jìn)入血液循環(huán) 第四十一張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 臨床診斷還沒有單一指標(biāo)可確診癌， 所以酶測(cè)定可作為一種輔助手段，如：測(cè)定血清淀粉酶胰腺癌酸性磷酸酶前列腺癌

22、亮氨酸氨肽酶、硫酸酯酶、乳酸脫氫酶等同工酶譜變化肝癌、結(jié)腸癌、直腸癌。第四十二張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月端粒酶 端粒、端粒酶與腫瘤發(fā)生的關(guān)系是近年來腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。有研究表明,端粒酶在85%95%的惡性腫瘤組織中有陽性表達(dá),而在正常體細(xì)胞則一般為陰性。因此端粒酶抑制劑的研究為惡性腫瘤的早期診斷、預(yù)后估計(jì)及基因治療開辟了一個(gè)新的途徑。第四十三張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 端粒(telomere) 真核細(xì)胞染色體末端以 TTAGGG 6個(gè)堿基序列重復(fù)組成的DNA結(jié)構(gòu)人體細(xì)胞染色體端粒長(zhǎng)度約為515Kb,其功能在于保護(hù)染色體免受核酶降解,防止斷端融合重排或降解。

23、如果端粒長(zhǎng)度縮短到極限如4Kb以下時(shí),細(xì)胞則會(huì)喪失分裂增殖能力而發(fā)生凋亡,該過程稱為監(jiān)控點(diǎn)激活(checkpoint activation)。端?？s短被認(rèn)為是正常細(xì)胞分裂與老化的分子信號(hào),端粒被稱為細(xì)胞壽命的“分裂鐘”。第四十四張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月端粒的保護(hù)機(jī)制 在真核細(xì)胞,端粒DNA的富G鏈較富C鏈超出約1216bp,形成3端的突出單鏈結(jié)構(gòu),而端粒蛋白質(zhì)能夠特異地識(shí)別這一突出區(qū)域并與之結(jié)合,再通過進(jìn)一步的折疊、盤曲,從而形成染色體末端具有保護(hù)功能的“帽子”,在防止染色體互相融合、重組等方面都發(fā)揮著十分重要的作用 第四十五張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十六張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月端粒酶(telomerase) 依賴RNA的DNA聚合酶,其實(shí)質(zhì)是一種核