


下載本文檔
版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶(hù)提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、十五、豬傳染性胸膜肺炎間接血凝試驗(yàn)(IHA)操作方法 本方法系用豬傳染性胸膜肺炎嗜血桿菌多血清型抗原致敏戊二醛鞣酸化處理的綿羊紅細(xì)胞作為抗原,供作間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)豬傳染性胸膜肺炎抗體之用。 (一)試驗(yàn)材料 1. 96孔V型醫(yī)用血凝板 2. 稀釋液:含1%健兔血清(5630分鐘滅活)的pH7.2 0.15M PBS液。 3. 診斷液為1%致敏血球抗原。 (二)操作步驟1滴加稀釋液:用微量移液器每孔加0.025毫升稀釋液。 2血清稀釋?zhuān)菏褂梦⒘肯♂尠粽喝”粰z豬血清,置于第1孔中,作倍比稀釋至7孔,8孔為空白對(duì)照,各孔稀釋度分別為1:2、1:4、1:8、1:16、:1:32、1:64、1:128。
2、3滴加致敏紅細(xì)胞:給被檢測(cè)血清各稀釋孔滴加嗜血桿菌致敏的綿羊紅細(xì)胞懸液25微升。置于微型振蕩器上振蕩12分鐘,置37溫箱作用2小時(shí)后判定結(jié)果。 4設(shè)對(duì)照:在同一V型板上設(shè)嗜血桿菌陽(yáng)性血清對(duì)照、陰性血清對(duì)照和稀釋液對(duì)照。在所有對(duì)照成立時(shí),方可判定結(jié)果。(三)結(jié)果判定 被檢測(cè)豬血清血凝效價(jià)大于或等于1:8(+)以上者,判為陽(yáng)性(暫定)。血凝價(jià)小于1:4(+)者為陰性。 附:玻片沉淀試驗(yàn) 該方法采用環(huán)狀沉淀試驗(yàn)的胸膜肺炎嗜血桿菌可溶性耐熱抗原和玻片凝集試驗(yàn)所用抗血清進(jìn)行快速玻片試驗(yàn)。 用途:各血清型的定型 操作方法:將用于環(huán)狀沉淀試驗(yàn)的一滴抗原與玻片上一滴血清混合,搖動(dòng),13分鐘后判定結(jié)果。 結(jié)果判
3、定:如發(fā)生肉眼可見(jiàn)的絮狀凝集者為陽(yáng)性,不凝集者為陰性。(逯忠新)豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌病聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)1 材料準(zhǔn)備:待檢組織、培養(yǎng)基 引物:預(yù)期擴(kuò)增的片段大小為610bp,由上海生物工程公司合成。 序列為,上游引物P1: 5_CCGACTTTTAAATCCGT-3 下游引物P2: 5_GAACAGTTGTTCCGCTAA-3 儀器設(shè)備有:凝膠電泳紫外線檢測(cè)儀,PCR擴(kuò)增儀,電泳儀,CO2培養(yǎng)箱2操作步驟:21 培養(yǎng)基的制備:PPLO巧克力培養(yǎng)基的制備。取35克PPLO瓊脂加熱溶于1000ml水中,121 滅菌30min,冷卻到60左右加10%(v/v)脫纖綿羊脂和1%的葡萄糖(w/v)于80
4、水浴,培養(yǎng)基顏色由紅色變?yōu)榍煽肆ι?,倒平皿?保存。22 樣品的采集:取病豬的肺組織,低溫保純。2 3 樣品的處理:采病豬的肺組織無(wú)菌接種于PPLO培養(yǎng)基,37,10% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-36h后,將菌落透明,圓潤(rùn),直徑1-2mm的菌株用刮取2個(gè)菌落洗脫于含100ml無(wú)菌水的離心管中,1000r/m離心5min,棄上清,用無(wú)菌水懸浮,渦旋后,于沸水中水浴10 min后,再放置-20凍結(jié)。凍融后10000r/min離心5min,取上清作模板。24 PCR操作程序 PCR反應(yīng)體系: 總體積50l ,5l 10倍緩沖液,3l 25 m mol/L Mgcl2, 1l 2 m mol/L dNTP
5、s,5mol/L上游引物,下游引物各3l,Taq 0.5l,模板7l,無(wú)菌水27.5l. PCR.反應(yīng)條件:于94變性3min后,進(jìn)入循環(huán)94 1 min,50 1min30s, 72 1min40s,進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后72延伸10min。PCR產(chǎn)物于4保存.2.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè):取8l.擴(kuò)增產(chǎn)物和5l DNA分子量標(biāo)準(zhǔn),加到含EB的0.8%瓊脂凝膠中,電壓為80V,電流為40-60mA,電泳15min左右,然后在紫外燈下觀察。豬2型圓環(huán)病毒聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)1 材料準(zhǔn)備:待檢組織、組織勻漿器、蛋白酶K,十二烷基磺酸鈉(SDS),苯酚、氯仿,異戊醇(分析純)、TEN緩沖液。溶液配制見(jiàn)附錄C(
6、標(biāo)準(zhǔn)的附錄)引物:擴(kuò)增偽狂犬病病毒基因中1093-1586bp之間494bp基因片段,由上海生物工程公司合成。序列為, 上游引物P1: 5-CAC GGA TAT TGT AGT CCT GGT-3 下游引物P2: 5-GAC AGT ATA TCC GAA GGT GCG G-3 儀器設(shè)備有:凝膠電泳紫外線檢測(cè)儀, PCR擴(kuò)增儀,電泳儀2操作步驟:2.1 樣品的采集:采集病豬的淋巴結(jié)、肺臟置-20 2.2 樣品處理 所采病料經(jīng)組織研磨器充分研磨,按1:5用TEN緩沖液懸浮收集于離心管內(nèi),-70反復(fù)凍融3次,7000r/min離心5min。取上清液472.5l,加入25l 10SDS和2.5l
7、的20mg/ml 蛋白酶K,50水浴搖床上放置2h后加入等量的飽和酚500l,渦旋20s。離心取上清液,加等量的酚:氯仿:異戍醇(25:24:1)抽提一次,再用氯仿:異戍醇(24:1)抽提一次,最后用乙醇沉淀,真空抽干后加入20l雙蒸水溶解,-20貯存?zhèn)溆谩?.3. PCR的操作程序PCR反應(yīng)體系為:總體積50l,含有50m mol/L KCl,10m mol/L Tris-HCl(pH 9.0),0.1Triton X-100,100mol/L dNTPs,5mol/L引物,2 m mol/L MgCl2,及0.5U Taq酶,1l模板DNA。常用的反應(yīng)體系組成如下 10緩沖液 5.0l 15mM MgCl2 3.0 l dNTPs 1.0 l 引物 各2.5l Taq聚合酶 0.5l DNA模板 1.0l 滅菌去離子水 34.5l 擴(kuò)増條件為:94變
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶(hù)所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫(kù)網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶(hù)上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶(hù)上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶(hù)因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 二零二五年度投資理財(cái)代理服務(wù)合同
- 二零二五年度吊車(chē)安全操作規(guī)程制定及執(zhí)行合同
- 二零二五年度冬季勞務(wù)掃雪環(huán)境保護(hù)協(xié)議
- 2025年度正規(guī)貨車(chē)駕駛員勞動(dòng)合同及貨運(yùn)業(yè)務(wù)操作規(guī)范合同
- 二零二五年度扶貧項(xiàng)目風(fēng)險(xiǎn)防范與應(yīng)急處理合作協(xié)議
- 二零二五年度合同糾紛賠償調(diào)解服務(wù)協(xié)議
- 二零二五年度名人房產(chǎn)銷(xiāo)售代理合同范本
- 2025年度智能制造股權(quán)抵押貸款合同
- 2025年度電子商務(wù)平臺(tái)合作解除終止范本
- 二零二五年度企業(yè)勞動(dòng)合同解除與離職員工就業(yè)援助服務(wù)協(xié)議
- 2024綠化養(yǎng)護(hù)作業(yè)指導(dǎo)書(shū)
- 2023年12月大學(xué)英語(yǔ)4級(jí)真題(第三套)
- 創(chuàng)傷失血性休克中國(guó)急診專(zhuān)家共識(shí)(2023)解讀課件
- (完整版)幕墻施工方案
- 鋼結(jié)構(gòu)工程廠房、辦公樓施工組織設(shè)計(jì)方案
- 24年追覓在線測(cè)評(píng)28題及答案
- 醫(yī)學(xué)教材 超聲引導(dǎo)下乳腺真空微創(chuàng)旋切(VABB)
- 2024年鐵路線路工(高級(jí)技師)技能鑒定理論考試題庫(kù)(含答案)
- 工程造價(jià)預(yù)算書(shū)
- 終止授權(quán)代理協(xié)議書(shū)模板
- 修建水壩施工合同模板
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論