實驗乙酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白

1、生物化學實驗之實驗四 乙酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白 1【實驗目的】 學習乙酸纖維素薄膜電泳的原理，掌握有關操作技術。【實驗原理】 電泳:帶電粒子在電場的作用下，向著與其電性相反的方向泳動的現象。 由于被分離物質所帶電荷的性質、數量和分子的大小以及形狀不同，在同一電場作用下其移動方向和移動速度也不同，即它們的電泳遷移率（）不同。因此，經過一定時間電泳后即可被2分離開來。利用此性質，將混合物中各組分進行分離分析的方法稱為電泳法。 影響電泳遷移率的外界因素：電場強度、溶液的pH值、溶液的離子強度和電滲現象。 影響電泳遷移率的內在因素：質點所帶凈電荷的量、質點的大小和形狀。 3血清蛋白 組分蛋白質名

2、稱等電點（pI）相對分子質量白蛋白1球蛋白2球蛋白球蛋白球蛋白4.85.065.065.126.857.569000200000300000900001500001560003000004 血清中各主要蛋白質的等電點均低于pH8.6，在該緩沖液中均帶負電荷，在電場中向正極移動。 以醋酸纖維素薄膜為支持物，正常人血清在pH8.6的緩沖體系中電泳，染色后可顯示5條主要區(qū)帶。其中清蛋白的泳動速度最快，其余依次為1-、2-、-及-球蛋白。 5【實驗材料與試劑】（一）醋酸纖維薄膜（28 cm）、電泳儀、電泳槽、點樣器（蓋玻片）、載玻片、培養(yǎng)皿、鑷子（二）新鮮血清、巴比妥/鈉緩沖液（pH8.6， 離子強度

3、0.07）、染色液（氨基黑10B）、漂洗液 6【實驗步驟】 1. 薄膜的處理 將醋酸纖維薄膜置于盛有巴比妥/鈉緩沖液的平皿中，浸泡30 min以上。 用鑷子取出浸透的薄膜，夾在兩層粗濾紙內吸去多余的緩沖液，然后平鋪在載玻片上（無光澤面朝上）。7 用毛細管取一滴血清，滴在另一 載玻片上，用蓋玻片的一側邊在血清上均勻蘸一下，再輕輕印在薄膜點樣處片刻，使血清滲透到薄膜內，形成均勻的直線。2. 點樣83. 電泳 將薄膜平貼在電泳槽支架上，點樣端在陰極。兩端用已浸透緩沖液的紗布壓住（引橋）。9 蓋上電泳槽蓋，使薄膜平衡10 min。 連接電源、電極線。10 通電，調節(jié)電壓至100 V，電流強度為0.40

4、.6 mA/cm膜寬度，電泳時間約45 60 min 。114. 染色 電泳完畢后將薄膜取下, 放在氨基黑10B染色液中浸泡5 10min。5. 漂洗 將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中漂洗數次，直至背景藍色脫盡，條帶清晰為止，可得到色帶清晰的電泳圖譜 。+-12【注意事項】 1. 市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片，薄膜的選擇與浸潤是電泳成敗的關鍵之一。若浸透后的薄膜色澤均勻，深淺一致，則可用于電泳 。 2. 醋酸纖維素薄膜電泳常選用pH8.6巴比妥巴比妥鈉緩沖液，其濃度為0.050.09 mol/L。選擇何種濃度與樣品和薄膜的厚薄有關。13 3. 點樣時，應將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免引起樣品擴散。但不宜太干，否則樣品不易進入膜內，造成點樣起始點參差不齊，影響分離效果 。 4. 點樣時，點樣不要過多，恰到好處，動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。14 5. 放薄膜的時候要注意放平，與紗布充分接觸，但不要接觸點樣端 。 6.