常用培養(yǎng)基的制備、滅菌與消毒

1、實(shí)驗(yàn)一、常用培養(yǎng)基的制備、滅菌與消毒營(yíng)養(yǎng)：從外部環(huán)境攝取其生命活動(dòng)所必需的能量和物質(zhì)，滿足生長(zhǎng)和繁殖需要的一種生理過(guò)程。是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生命活動(dòng)的起點(diǎn)。營(yíng)養(yǎng)物：具有營(yíng)養(yǎng)功能的物質(zhì)。也包括光能。提供生物的結(jié)構(gòu)物質(zhì)、能量、代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)和良好的生理環(huán)境。營(yíng)養(yǎng)要素：碳源、氮源、能源、生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽和水培養(yǎng)基：人工配制、適合微生物生長(zhǎng)繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的混合養(yǎng)料。要求：應(yīng)具備6大營(yíng)養(yǎng)要素；物質(zhì)比例合適；必須滅菌。 1選用和設(shè)計(jì)培養(yǎng)基的原則、方法及制備過(guò)程：原則：目的明確 、營(yíng)養(yǎng)協(xié)調(diào)、經(jīng)濟(jì)節(jié)約 物理化學(xué)條件適宜方法：生態(tài)模擬、查閱文獻(xiàn) 精心設(shè)計(jì)、試驗(yàn)比較 步驟：稱量、熔化、調(diào)PH、過(guò)濾、分裝、

2、加塞、包扎、滅菌、冷卻、無(wú)菌檢查 2培養(yǎng)基種類：一、按成分的不同分 天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基二、按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分 固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基三、按培養(yǎng)基用途 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基 加富培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基3消毒與滅菌消毒：消滅病原菌和有害微生物的營(yíng)養(yǎng)體滅菌：殺滅一切微生物的營(yíng)養(yǎng)體，芽胞和孢子。 方法：一、物理的方法：加熱、過(guò)濾、輻射二、化學(xué)的方法：用化學(xué)試劑抑制或殺滅微生物。主要破壞細(xì)菌代謝機(jī)能。如重金屬離子，磺胺類藥物及抗生素等。 4加熱法：干熱法：火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌。1、火焰灼燒適用于接種環(huán)、接種針和金屬用具如鑷子等，試管口和瓶口，涂布用玻璃棒。2、熱空氣滅

3、菌利用高溫干燥空氣（160170C）加熱滅菌12h，適用于玻璃器皿和培養(yǎng)皿等。原理加熱使蛋白質(zhì)變性，與水的含量有關(guān)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞含水量越大，凝固越快。3、注意事項(xiàng)： 1）培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品不能用此法； 2）溫度控制在180； 3）物品不能太擠； 4）溫度降至70時(shí)才開箱門。 5濕熱法 ：原理：因?yàn)闈駸嶂芯w吸水，蛋白質(zhì)容易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低；濕熱的蒸氣有潛熱存在。所以效果比同溫度下干熱好。 高壓蒸汽滅菌法：1、設(shè)備：高壓滅菌鍋2、時(shí)間長(zhǎng)短根據(jù)滅菌物品的種類和數(shù)量不同有所變化。3、適用于培養(yǎng)基、工作服、橡膠物品等的滅菌，也可用于玻璃器皿的滅菌。4、注意事項(xiàng)： 1）

4、冷空氣徹底排除；2）加水；3）壓力降為“0”時(shí)方可打開。 6 常壓蒸汽滅菌： 對(duì)于不宜用高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基，含糖培養(yǎng)基等可采用此法。徹底滅菌則采用間歇滅菌方法。 煮沸滅菌法： 適用注射器和解剖器皿，時(shí)間1015min， 超高溫殺菌 135-150C和2-8s對(duì)牛乳和其它液態(tài)食品。 優(yōu)點(diǎn) ：保持食品價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)成分。7 過(guò)濾除菌： 原理：介質(zhì)在有壓力時(shí)阻隔微生物。 適用范圍：許多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法。 設(shè)備：蔡氏過(guò)濾器，濾膜過(guò)濾器。 優(yōu)缺點(diǎn)：不破壞培養(yǎng)基成分，只適用少量濾液。需 大量無(wú)菌空氣以及凈化工作臺(tái)。 注意事項(xiàng)：1、壓力適當(dāng)； 2、無(wú)菌條件下進(jìn)行； 3

5、、防止?jié)B透現(xiàn)象。 8 輻射滅菌： 原理：紫外線波長(zhǎng)在200300nm，具有殺菌作用，以265-266殺菌力強(qiáng)。此段波長(zhǎng)易被細(xì)胞中核酸吸收；可產(chǎn)生臭氧和過(guò)氧化氫。殺菌效力與強(qiáng)度和時(shí)間的乘積成正比。 缺點(diǎn)：穿透力不大。距照射物1.2m為宜。 應(yīng)用：無(wú)菌室，醫(yī)院。 注意事項(xiàng)：對(duì)眼睛和皮膚有刺激作用。 射線滅菌：r射線，穿透力強(qiáng)，適用于堆積物品的滅菌。 9 化學(xué)藥品滅菌： 原理：應(yīng)用化學(xué)制劑破壞細(xì)菌代謝機(jī)能。 殺菌劑如重金屬離子； 抑菌劑如磺胺類及多數(shù)抗生素。 注意：與藥品的濃度高低，時(shí)間長(zhǎng)短，微生物種類以及微生物所處的環(huán)境有關(guān)。 常用化學(xué)殺菌劑有：乙醇、醋酸、石碳酸 福爾馬林、升汞、高錳酸鉀、新潔爾

6、滅等10 實(shí)驗(yàn)二、微生物的分離、純化及培養(yǎng)技術(shù) 分離與純化：從混雜的微生物群體中獲得只含某一種或某一株微生物的過(guò)程。 為什么要進(jìn)行純培養(yǎng)：平板上的單一菌落并不一定保證是一種菌。 常用的分離、純化方法： 單細(xì)胞挑取法 稀釋涂布平板法 稀釋混合平板法 平板劃線法 11稀釋涂布平板法 ：原理： 步驟： 1、倒平板： 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，高氏I號(hào)培養(yǎng)基，查氏培養(yǎng)基冷卻至55-60時(shí)，混勻后倒平板，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒4皿，高氏I號(hào)培養(yǎng)基和查氏培養(yǎng)基各倒3皿。 2、制備污水稀釋液：10g土樣，加入90ml無(wú)菌水中，在三角瓶中振搖20min。取0.5ml 加入盛有4.5ml無(wú)菌水的試管中，以此類推，制成不

7、同稀釋度。 3、涂布：將上述每種培養(yǎng)基平板底面標(biāo)記稀釋度，然后用無(wú)菌吸管從最后三種稀釋度，即10-4、10-5和10-6的試管中吸取0.1ml對(duì)號(hào)放入平板上，用玻棒涂布。 4、培養(yǎng)：高氏I號(hào)和查氏倒置培養(yǎng)于28培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5days，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基在37培養(yǎng)1-2days。 5、挑菌落：轉(zhuǎn)至斜面，檢查是否一致，保存。 1213 平板劃線法： 1、倒平板，標(biāo)記培養(yǎng)基名稱，編號(hào)和實(shí)驗(yàn)日期。 2、劃線方法 稀釋混合平板法 ： 1、先加菌 2、倒平板時(shí)注意培養(yǎng)基溫度 3、混合均勻14微生物培養(yǎng)技術(shù)1、斜面接種2、液體培養(yǎng)基接種3、穿刺接種4、將已接種的斜面、半固體和液體培養(yǎng) 基放置培養(yǎng)箱中

8、培養(yǎng)5、將生長(zhǎng)好的菌種用牛皮紙包好，置4冰箱中保存。15 實(shí)驗(yàn)三、菌種保藏 幾種常用的保藏方法： 1、傳代培養(yǎng)法 保藏的菌種通過(guò)斜面、穿刺或皰肉培養(yǎng)基（用于厭氧細(xì)菌）培養(yǎng)好后，置4C冰箱中存放，定期進(jìn)行傳代培養(yǎng)、再存放。 可用膠塞代替棉塞或在斜面上覆蓋一層無(wú)菌液體石蠟來(lái)進(jìn)一步延長(zhǎng)保存期。 2、載體法 使生長(zhǎng)合適的微生物吸附在一定的載體上進(jìn)行干燥。 常用的載體有土壤、砂土、硅膠、明膠、麩皮、磁珠和濾紙片等。16 3、懸液法 將細(xì)菌、酵母菌細(xì)胞懸浮在一定的溶液中保存。 溶液包括蒸餾水、糖溶液、磷酸緩沖液、食鹽水等。 4、冷凍法 使菌種始終存放在低溫環(huán)境下的保藏方法。包括低溫法和液氮法。 此法關(guān)鍵是

9、要克服細(xì)胞的冷凍損傷。注意控制降溫速率及保護(hù)劑的使用。 5、真空干燥法 這類方法包括冷凍真空干燥法和L干燥法。 冷凍真空干燥法是將要保藏的微生物樣品先經(jīng)低溫預(yù)凍，然后在低溫狀態(tài)下進(jìn)行減壓干燥。 L-干燥法則不需要低溫預(yù)凍樣品，只是使樣品維持在1020C范圍內(nèi)進(jìn)行真空干燥。17 操作方法 1、斜面保藏法 將菌種轉(zhuǎn)接在適宜固體斜面培養(yǎng)基上，待其充分生長(zhǎng)后，用牛皮紙將棉塞部分包扎好（棉塞換成膠塞效果更好），置4C冰箱中包藏。 保藏時(shí)間依微生物的種類而定。霉菌、放線菌及芽孢菌保存24個(gè)月移種一次，酵母菌間隔兩個(gè)月，普通細(xì)菌一個(gè)月，假單胞菌兩周傳代一次。 此法優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、使用方便，缺點(diǎn)是保藏時(shí)間短、

10、易被污染。18 2、液體石蠟保藏法 將無(wú)菌石蠟加在已長(zhǎng)好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1CM為準(zhǔn)，使菌種與空氣隔絕。 將試管直立，置低溫或室溫下保存。 此法實(shí)用且效果較好。霉菌、放線菌、芽孢菌可保藏兩年以上，酵母菌可保藏12年，普通細(xì)菌也可保藏1年左右。 3、穿刺保藏法 按穿刺接種方式培養(yǎng)菌種，菌種長(zhǎng)好后用膠塞封嚴(yán)，置4冰箱存放。19 4、砂土管保藏法 （1）河砂處理 取河砂若干加入鹽酸10% ，加熱煮沸30min除去有機(jī)機(jī)質(zhì)。倒去鹽酸溶液，用自來(lái)水沖洗至中性，最后一次用蒸鎦水沖洗，烘干后用40目篩子過(guò)篩，棄去粗顆粒，備用。（）土壤處理 取非耕作層不含腐殖質(zhì)的痩黃土或紅土，加自來(lái)水浸泡洗滌數(shù)

11、次，直至中性。烘干后碾碎，用100目篩子過(guò)篩，粗顆粒部分丟掉。 (3)砂土混合 處理妥當(dāng)?shù)暮由芭c土壤按3：1的比例摻合(或根據(jù)需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均勻后，裝入10 x100mm的小試管或安瓿管中，每管分裝1g左右，塞上棉塞，進(jìn)行滅菌(通常采用間歇滅菌2-3次)，最后烘干。 20 (4)無(wú)菌檢查 每10支砂土管隨機(jī)抽1支，將砂土倒入肉湯培養(yǎng)基中，30培養(yǎng)40h，若發(fā)現(xiàn)有微生物生長(zhǎng)，所有砂土管則需重新滅菌，再作無(wú)菌試驗(yàn)，直至證明無(wú)菌后方可使 用。 (5)菌懸液的制備 取生長(zhǎng)健壯的新鮮斜面菌種，加入2-3ml無(wú)菌水(每18x180mm 的試管斜面菌種)，用接種環(huán)輕輕將菌苔洗下，制成

12、菌懸液。 (6)分裝樣品 每支砂土管(注明標(biāo)記后)加入05ml菌懸液(剛剛使砂土潤(rùn)濕為宜)， 用接種針拌勻。 (7)干燥 將裝有菌懸液的砂土管放入干燥器內(nèi)，干燥器底部盛有干燥劑。用真空泵抽干水分后火焰封口(也可用橡皮塞或棉塞塞住試管口)。 (8)保存 置4冰箱或室溫干燥處，每隔一定的時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)。此法多用于產(chǎn)芽孢的細(xì)菌、產(chǎn)生孢子的霉菌和放線菌。在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛、 效果較好，可保存幾年時(shí)間，但對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞效果不佳。215、冷凍真空干燥法 （1）凍干管的準(zhǔn)備：中性硬制玻璃，烘干，滅菌。 （2）菌種培養(yǎng)：細(xì)菌芽孢脫落；放，霉孢子豐滿。 （3）保護(hù)劑的配制：配制，滅菌，檢查 （4）菌懸液的制備

13、：2-3ml保護(hù)劑 （5）分裝樣品：菌懸液每管0.2ml （6）預(yù)凍：程序控溫儀降溫 （7）冷凍真空干燥：-50下抽真空 （8）取出樣品：輕敲松散即達(dá)標(biāo) （9）第二次干燥： （10）熔封 （11）存活性檢測(cè)：抽取一管進(jìn)行存活性檢查 （12）保存：4保存22實(shí)驗(yàn)三1、細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)觀察（簡(jiǎn)單染色）一、目的要求觀察細(xì)菌的菌落特征掌握簡(jiǎn)單染色法在油鏡下觀察細(xì)菌個(gè)體的形態(tài)學(xué)習(xí)環(huán)境中微生物的檢查方法，并加深對(duì)微生物分布廣泛性的認(rèn)識(shí)23二、基本原理形態(tài)觀察主要包括群體的形態(tài)和個(gè)體的形態(tài)觀察。細(xì)菌的基本形態(tài)主要分為球菌、桿菌、螺旋菌三大類，近年還發(fā)現(xiàn)星狀和四方形細(xì)菌等。細(xì)菌形態(tài)受培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基成分、濃度

14、、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等發(fā)生變化。細(xì)菌菌落大多表面光滑濕潤(rùn)，有光澤，一般菌落較小，質(zhì)地顏色均勻，同培養(yǎng)基結(jié)合不緊密。菌落特征與組成菌落的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)狀況、排列方式、好氣性和運(yùn)動(dòng)性直接相關(guān)。細(xì)菌個(gè)體微小，較透明，必須染色方可呈現(xiàn)。根據(jù)細(xì)菌個(gè)體形態(tài)觀察的不同要求，可將染色分為3種類型：簡(jiǎn)單染色、鑒別染色、特殊染色。24簡(jiǎn)單染色法原理細(xì)菌在中性的環(huán)境中帶負(fù)電荷，用堿性染料（解離時(shí)帶正電荷）如美蘭、結(jié)晶紫等進(jìn)行染色。實(shí)驗(yàn)三2：放線菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察一、目的要求掌握放線菌形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察的方法觀察放線菌的菌落特征、個(gè)體形態(tài)及其繁殖方式。二、原理放線菌菌落在培養(yǎng)基上著生牢固，與基質(zhì)結(jié)合緊密，難以用接種針挑取。放

15、線菌細(xì)胞一般呈分枝無(wú)隔的絲狀，菌絲體分為在培養(yǎng)基內(nèi)部的基內(nèi)菌絲和伸出培養(yǎng)基表面的氣生菌絲。氣生菌絲上部分化成孢子絲，呈螺旋狀、波浪狀或分枝狀。菌絲呈各種顏色，有的能分泌水溶性色素到培養(yǎng)基內(nèi)。孢子絲長(zhǎng)出孢子，孢子形狀各異。由于孢子的存在使菌落表面呈干粉狀。25三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（一）菌落形態(tài)觀察及菌苔特征的觀察觀察放線菌菌落表面形狀、大小、顏色、邊緣以及有無(wú)色素分泌；并用接種環(huán)挑取菌落，注意在培養(yǎng)基上的著生的緊密情況。區(qū)別基內(nèi)菌絲、氣生菌絲及孢子絲的著生部位。（二）個(gè)體形態(tài)特征觀察可直接觀察，也可置于載片上觀察。注意放線菌菌絲直徑的大小，孢子絲的形狀。（三）孢子形態(tài)觀察用印片法（四）用插片法觀察放線菌形態(tài)26實(shí)驗(yàn)三3：霉菌的形態(tài)觀察一、目的要求觀察霉菌菌落特征掌握霉菌的制片方法觀察霉菌個(gè)體形態(tài)及各種無(wú)性孢子及有性孢子的形態(tài)二、基本原理霉菌是由交織在一起的菌絲體構(gòu)成。菌絲呈管狀，有的有橫隔將菌絲分割為多細(xì)胞（如青霉、曲霉），有的菌絲沒有橫隔（如毛霉、根霉）。菌絲直徑比一般細(xì)菌和放線菌菌絲大幾倍到幾十倍。菌落形態(tài)較大，質(zhì)地疏松，顏色各異，有絲狀、絨毛狀或蜘蛛網(wǎng)狀的菌絲體。將菌絲體放在水中易變形，將其置于乳酸石