聚合酶鏈反應(yīng)

1、聚合酶鏈反應(yīng)（一）PCR技術(shù)（聚合酶鏈反應(yīng)） 原理：PCR技術(shù)實(shí)際上是DNA體外擴(kuò)增技術(shù)，其原理為： 以提取的DNA為模板，在94解鏈變性后提供單鏈DNA模板（模板變性） 將特定設(shè)計(jì)的與待擴(kuò)增DNA模板兩端序列互補(bǔ)的兩個(gè)引物（短鏈互補(bǔ)DNA引物）經(jīng)低溫退火使引物與模板DNA互補(bǔ)結(jié)合（模板與引物退火連接） 在PCR反應(yīng)中，在Taq酶（DNA聚合酶）作用下，使加入的游離單核苷酸（dNTPs）由引物5 3方向按堿基配對(duì)原則，沿DNA模板形成兩條互補(bǔ)DNA鏈。（引物沿模板互補(bǔ)延伸）如圖 新合成的DNA鏈又可作為下一輪PCR反應(yīng)的模板，這種經(jīng)熱變性-復(fù)性-延伸的過(guò)程就是一個(gè)PCR循環(huán)，經(jīng)反復(fù)多次循環(huán)可產(chǎn)

2、生2n的指數(shù)擴(kuò)增，使微量模板達(dá)可見(jiàn)量用于實(shí)驗(yàn)。 其引物設(shè)計(jì)、 PCR反應(yīng)條件、儀器穩(wěn)定性、技術(shù)性強(qiáng)，對(duì)環(huán)境要求嚴(yán)，以防假陽(yáng)性產(chǎn)生。1PCR種類(lèi)：種類(lèi)多、用途多而廣泛，列舉常用法 逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）：又稱(chēng)RNA-PCR 先將從細(xì)胞總提取的總RNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA（序列用mRNA）以提供PCR模板。然后以cDNA為模板在互補(bǔ)的兩個(gè)引物的引導(dǎo)下，在Taq酶作用下，將加入的dNTPs按堿基配對(duì)原則，沿cDNA 模板擴(kuò)增DNA（見(jiàn)上圖） 優(yōu)點(diǎn)：只需少量mRNA 模板cDNA cDNA中已不含內(nèi)含子 對(duì)構(gòu)建cDNA文庫(kù)非常有利 錨定PCR：當(dāng)mRNA cDNA后，用末端轉(zhuǎn)移酶在c

3、DNA3末端加上poly(dG)作錨位，然后用帶有酶切位點(diǎn)的poly(dC)作錨定引物 ，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 優(yōu)點(diǎn)：可克隆和擴(kuò)增未知的DNA/RNA、基因序列，便于組裝，免受基因兩端序列限制。2反向PCR：能將位于已知基因序列兩側(cè)的未知序列（轉(zhuǎn)座子、插入序列、易位整合的插入基因）擴(kuò)增獲得。 方法：選擇已知序列內(nèi)部沒(méi)有該酶切位點(diǎn)的內(nèi)切酶，對(duì)DNA進(jìn)行酶切，經(jīng)環(huán)化后，將環(huán)化分子用與已知序列兩端的互補(bǔ)反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可獲大量的未知DNA片段，進(jìn)一步測(cè)序。（圖） 反向PCR 對(duì)研究轉(zhuǎn)座子、反轉(zhuǎn)錄病毒插入序列以及所有可以整合或轉(zhuǎn)位到基因組（已知序列）中的插入序列DNA片段（如原癌基因）。3隨機(jī)引物

4、PCR 以合成一系列不同隨機(jī)排列的寡核苷酸鏈（通常為10聚體）為引物，對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳，EB染色顯條，分析DNA多態(tài)性。 此法可通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段多態(tài)性，可分析基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性，被命名為隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA(RAPD)。 RAPD可用于基因組指紋圖的構(gòu)建，可應(yīng)用于系統(tǒng)進(jìn)化研究、物種鑒定和親緣關(guān)系分析，法醫(yī)可用來(lái)作親子鑒定。4單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR（SSCP） 不同腫瘤由于單鏈DNA分子中因單一核苷酸不同，其DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象有差異。 PCR產(chǎn)物電泳后的DNA遷移率不同，其電泳條帶上有差異。通過(guò)比較DNA的電泳類(lèi)型，即可測(cè)出基因

5、的點(diǎn)突變、插入、缺失突變等。 此時(shí)若用Southern印跡雜交更為精確。其他PCR技術(shù) 差異顯示RT-PCR：復(fù)雜、引物多、費(fèi)用大、操作技術(shù)要求高、假陽(yáng)性高，不常用。 俘獲PCR：技術(shù)復(fù)雜，不常用。5核酸分子雜交 Southern blot（又稱(chēng)Southern印跡雜交） 提取基因組DNA，經(jīng)酶切后電泳分離，將分離定位在凝膠上不同分子量DNA條帶，用堿變性處理，使雙鏈拆開(kāi)，再如圖轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用標(biāo)記的目的DNA探針進(jìn)行同源DNA雜交。帶有核素標(biāo)記的DNA探針結(jié)合后，經(jīng)洗滌仍留在膜上，經(jīng)X-光片顯影定影，根據(jù)標(biāo)記信號(hào)，證實(shí)基因組DNA靶分子上是否含有目的基因探針的基因片段。 方法：虹吸印

6、跡法：利用毛細(xì)管虹吸作用將凝膠上DNA片段轉(zhuǎn)移到膜片上，轉(zhuǎn)移時(shí)間長(zhǎng)，需過(guò)夜或在1218h之間，探針與膜雜交。 真空轉(zhuǎn)移法：采用抽真空技術(shù)將凝膠上緩沖液引流至下槽中，可快速將凝膠上DNA片段轉(zhuǎn)移到膜片上。方法凝膠在下，膜片在上，方法凝膠在上，膜片在下。如圖 6Northern-blot（又稱(chēng)Northern印跡雜交） Sorthern雜交樣品是DNA，而Northern雜交樣品是RNA。 RNA樣品的變性、電泳轉(zhuǎn)移方法與Southern雜交法相同，其標(biāo)記的雜交探針可以是DNA，也可以用RNA特異探針。 本法可從RNA水平研究基因的表達(dá)。斑點(diǎn)雜交 是Sorthern-blot 法衍生而來(lái)的快速、簡(jiǎn)

7、便的鑒定微量DNA樣品的技術(shù)。 可直接將樣品DNA點(diǎn)于硝酸纖維素膜上，固定后先預(yù)雜交，再用核素標(biāo)記的特異探針在密封袋中進(jìn)行雜交，有斑點(diǎn)產(chǎn)生者為陽(yáng)性。還可根據(jù)斑點(diǎn)大小，進(jìn)行相對(duì)定量分析。 具有快速、簡(jiǎn)便、只需微量樣品、反應(yīng)體積小、無(wú)需轉(zhuǎn)膜及其相關(guān)設(shè)備。 缺點(diǎn)：難于確定被測(cè)基因片段的分子位置。7原位雜交：用標(biāo)記已知DNA序列的探針，使其與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交。此法因基因組DNA各基因位置未發(fā)生改變，故稱(chēng)原位雜交。 有兩種方法： 核素標(biāo)記的DNA探針滴在細(xì)胞涂片或組織切片上，43作用18h。經(jīng)洗滌干燥后，涂核4乳膠，于4自顯影，定影，Giemsa染色。計(jì)算鏡下的銀色顆粒數(shù)。也可用圖像儀進(jìn)行灰度分析，可定點(diǎn)、定量分析。 地高辛標(biāo)記DNA探針的原位雜交 方法與上述基本相同，只是探針不用核素標(biāo)記該用地高辛標(biāo)記，雜交后經(jīng)洗滌再加入酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，作用20min洗滌，并用EDTA液終止反應(yīng)，再加入相應(yīng)底物顯色，鏡檢。891011感謝您的瀏覽需要相關(guān)抗體試劑的可以訪問(wèn)Fantibody全球抗體搜索引擎:fantibody全球抗體搜索引擎是一個(gè)供公共檢索的抗體數(shù)據(jù)庫(kù)，其抗體信息數(shù)據(jù)來(lái)源于全球范圍的研究機(jī)構(gòu)與商業(yè)公司。該引擎由商品化抗體數(shù)據(jù)庫(kù)與抗體應(yīng)用評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫(kù)兩部分組成，以幫