蛋白質檢測方法

1、 放射免疫技術(Radioimmunoassay technique) 放射免疫技術是把放射性同位素測定的敏感性和抗原抗體反應的特異性結合起來，在體外定量測定多種具有免疫活性物質的一項技術。 放射免疫技術是目前血清學和免疫學中最敏感的一種技術。它能檢測到毫微克水平，甚至是微微克水平。它具有專一性強，靈敏度和精確度均高等許多優(yōu)點。原理 當抗原遇到相應的抗體便形成抗原抗體復合物（AgAb Ag Ab），當用放射性同位素標記抗原再與相應的抗體結合便形成標記抗原和抗體復合物。即：Ag+AbAgAb。 當標記抗原和未標記抗原一起加入相應的抗體時則兩種抗原產(chǎn)生相互的競爭，而生成有標記抗原和抗體復合物以及非

2、標記抗原和抗體復合物。 生成標記抗原抗體復合物與非標記抗原的含量在一定的限度內(nèi)是呈反比的，所以利用這個原理去測定未知抗原或抗體。 如果Ag多則*AgAb（即結合抗原B）生成量減少，*Ag（即游離抗原F）的剩余量就多。相反，Ag少，則*AgAb生成量就多，*Ag的剩余量就少。通過檢測游離抗原F和結合抗原B，就可知未知抗原的存在與否以及含量的多少。 二、酶聯(lián)免疫吸附試驗原理 免疫酶技術(immunoenzymatic techniques) 上發(fā)展起來的一種新型免疫測定技術，ELISA過程包括：抗原吸附在固相載體上，這個過程稱為包被，加待測抗體, 再加相應酶標記抗體，生成抗原-待測抗體-酶標記抗體

3、的復合物，再與該酶的底物反應生成有色產(chǎn)物。 借助分光光度計的光吸收計算抗體的量。待測抗體的量與有色產(chǎn)物成正比。同理也可包被抗體，測定抗原含量。 ELISA最常用的四種方法：直接法測定抗原；間接法測定抗體；雙抗體夾心法測定抗原；競爭法測定抗原。（1） 直接法測定抗原A. 將抗原吸附在載體表面；B. 加酶標抗體，形成抗原抗體復合物；C. 加底物。底物的降解量抗原量。 A. 將抗原吸附于固相載體表面；B. 加抗體, 形成抗原-抗體復合物; C. 加酶標抗體；D. 加底物。 測定底物的降解量抗體量。（2）間接法測定抗體A. 將抗體吸附于固相表面; B. 加抗原，形成抗原-抗體復合物; C. 加酶標抗體

4、; E. 加底物。底物的降解量抗原量。 （3）雙抗體夾心法測定抗原A. 將抗體吸附在固相載體表面; B. 加入酶標抗原和待測抗原，競爭結合抗體； 對照只加入酶標抗原； C. 加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差未知抗原量。（4）競爭法測定抗原 蛋白質引跡（Western-blot assay） Westerb-blot assay:即將SDSPAGE電泳的高分辨能力和抗原抗體反應的特異性和敏感性的結合的方法。 SDS電泳，電泳后的凝膠，不經(jīng)染色，將蛋白帶電轉印到NC膜上，電轉印2h。轉印結束后，將NC膜于TBST中漂洗一下，加入封閉液，室溫平緩搖動1-2h或4過夜。然后棄封閉液，將膜取出，將膜轉入新的塑料袋中， 加入經(jīng)TBST稀釋(1:15)的一抗（鼠抗leptin血清）， 室溫平緩搖動1h，取出NC膜，TBST洗4次，每次5mim，將膜轉入新塑料袋中，按0.1mL-0.15mL/cm2加入經(jīng)TBST稀釋(1:5000)的二抗(兔抗鼠IgG-HRP)，室溫反應1h，TBST洗4次，每次5min，最后再用TBS漂洗2次，每次5min，除去Tween-20。 加入以0.01mol/