piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的功能改進(jìn)及在哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用

1、遺傳 Hereditas (Beijing) 2014 年 10 月, 36(10): 965973 HYPERLINK / 綜 述piggyBac 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的功能改進(jìn)及在哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用錢秋杰，車家倩，葉露鵬，鐘伯雄浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州 310058摘要: piggyBac (PB)轉(zhuǎn)座系統(tǒng)具有轉(zhuǎn)座效率高、刪除精確、半隨機(jī)插入和攜帶片段較大等優(yōu)點(diǎn)。但是作為一種 轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的工具，特別是在哺乳動(dòng)物個(gè)體水平的轉(zhuǎn)基因方面，還需要提高其轉(zhuǎn)基因效率，并降低外源基因隨 機(jī)插入對(duì)內(nèi)源基因破壞的風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái)的研究結(jié)果顯示，PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)得到了進(jìn)一步改進(jìn)：采用 PB 轉(zhuǎn)座酶與 DNA 特異性結(jié)合蛋白融合

2、而構(gòu)成的融合型轉(zhuǎn)座酶，表現(xiàn)出外源片段有插入到染色體靶向位點(diǎn)的傾向；采用突 變體篩選的方法提高了 PB 轉(zhuǎn)座酶的活性，獲得了只具有切除活性而沒(méi)有插入活性的新型 PB 轉(zhuǎn)座酶；采用 PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)與細(xì)菌人工染色體(Bacterial artificial chromosomes, BAC)載體聯(lián)合使攜帶的外源片段長(zhǎng)度提高到了 207 kb。改進(jìn)后的 PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在基因組研究、基因治療、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells, iPSCs) 誘導(dǎo)及其分化方面發(fā)揮了較大的作用。文章對(duì) PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的最新研究進(jìn)展和應(yīng)用前景進(jìn)行了綜述。關(guān)鍵詞: piggyBac；轉(zhuǎn)

3、基因；靶向插入；轉(zhuǎn)座The improvement and application of piggyBac transposon system in mammalsQiujie Qian, Jiaqian Che, Lupeng Ye, Boxiong ZhongCollege of Animal Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, ChinaAbstract: The piggyBac (PB) transposon system is a useful genomic engineering tool due to its high

4、 transposition efficiency, precise excision, semi-random insertion and large cargo capacity. But, it still needs to further improve the transgenic efficiency and reduce the risk of endogenous disruption caused by the random insertion of exogenous gene, especially in transgenic experiments of individ

5、ual mammals. In recent studies, the PB transposase is fused with a DNA binding protein as a chimeric protein, which can guide the transposon to pre-designed loci. Besides, PB trans- posases obtained by mutagenesis have dramatically enhanced transposition activity and generated a novel function which

6、 is excision competent and integration defective. Furthermore, PB transposon system can carry large exogenous DNA fragments up to 207 kb when combining with the bacterial artificial chromosome vector. So far, these modified transposon systems have been widely applied in genome studies, gene therapy

7、and induced pluripotent stem cells (iPS cells). In this study, we review the latest studies on piggyBac transposon system and its application prospect.Keywords: piggyBac; transgene; target insertion; transposition收稿日期: 2014-05-27; 修回日期: 2014-08-29基金項(xiàng)目: 國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973 計(jì)劃)項(xiàng)目(編號(hào)：2012CB114601)和浙江省科技廳項(xiàng)

8、目(編號(hào)：2013C32048)資助作者簡(jiǎn)介: 錢秋杰，碩士研究生，專業(yè)方向：轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺生物反應(yīng)器。E-mail: HYPERLINK mailto: 通訊作者: 鐘伯雄，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：家蠶分子生物學(xué)。E-mail: HYPERLINK mailto:bxzhong bxzhong DOI: 10.3724/SP.J.1005.2014.0965網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間: 2014-9-17 17:23:03URL: HYPERLINK /kcms/detail/11.1913.R.20140917.1723.002.html /kcms/detail/11.1913.R.2014091

9、7.1723.002.html轉(zhuǎn)座子(Transposon)又稱跳躍基因，是能夠在基 因組上移動(dòng)的 DNA 片段，由美國(guó)女科學(xué)家 Barbara McClintock 最早在 1951 年提出1，并因此在 1983 年獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)及生理學(xué)獎(jiǎng)。轉(zhuǎn)座子分為 DNA 轉(zhuǎn) 座子 (DNA transposon) 和 逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座 子 (Retrotran- sposon)兩大類，前者以“剪切粘貼”(cut-paste)的 方式將 DNA 片段從原始基因位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到新的基因 位點(diǎn)，后者是將 RNA 經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成 DNA 后 再插入到新的基因位點(diǎn)。大量的物種基因組測(cè)序結(jié) 果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)座子在生物進(jìn)化過(guò)程中

10、具有重要作用2。 轉(zhuǎn)座子在哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用得益于由魚類改造而來(lái) 的“睡美人”轉(zhuǎn)座子(Sleeping Beauty)的應(yīng)用3，由 此掀起了哺乳動(dòng)物利用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的研究熱潮46。 但是“睡美人”轉(zhuǎn)座子存在過(guò)量抑制效應(yīng)和攜帶片 段偏小(5 kb 左右)等缺陷7,8，使其在轉(zhuǎn)基因應(yīng)用上 受到限制。piggyBac(PB)轉(zhuǎn)座子首次在鱗翅目昆蟲粉紋夜 蛾(Trichoplusia ni)細(xì)胞系 TN-368 中發(fā)現(xiàn)9。之后， 在地中海果蠅(Ceratitis capitata)、黑腹果蠅(Dro- sophila melanogaster)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)和家 蠶(Bombyx

11、 mori L.)等昆蟲中利用 PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)均取 得了轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的成功1013。研究證明 PB 轉(zhuǎn)座子 是一個(gè)廣譜的轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，可以在多種生物中實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn) 座，其中包括酵母(Schizosaccharomyces pombe)14,15、 真渦蟲(Girardia tigrina)16、斑馬魚(Danio rerio)17、 雞18、牛19,20、豬21,22和水稻23等等。PB 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是以“剪切粘貼”機(jī)制進(jìn)行轉(zhuǎn) 座，即轉(zhuǎn)座酶切割 PB 轉(zhuǎn)座子兩端反向重復(fù)序列 (Inverse terminator repeats, ITR)末端的 TTAA 序列， 將轉(zhuǎn)座子從原始基因座切下來(lái)，然后插入到基因

12、組 新的 TTAA 位點(diǎn)上。最早應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的 PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)是二元系統(tǒng)24，即采用外源基因替換 PB 轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶基因，把轉(zhuǎn)座酶基因構(gòu)建到另一個(gè) 兩端沒(méi)有 ITR 或 ITR 被破壞了的表達(dá)質(zhì)粒中。近年 來(lái)也有實(shí)驗(yàn)應(yīng)用一元系統(tǒng)，即將轉(zhuǎn)座酶基因序列調(diào) 整到同一質(zhì)粒的 PB 轉(zhuǎn)座子 ITR 序列的外側(cè)25。這 兩種系統(tǒng)都能使轉(zhuǎn)座片段和轉(zhuǎn)座酶基因在轉(zhuǎn)座后成 功分離，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座片段插入基因組后不再轉(zhuǎn)座，達(dá) 到穩(wěn)定遺傳的目的。PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)具有多方面的優(yōu)勢(shì)，轉(zhuǎn)座效率高26是 PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)能夠被普遍應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的重 要原因之一。能夠攜帶較大的外源 DNA 片段的能力 是該系統(tǒng)的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)轉(zhuǎn)

13、座片段在 14 kb 以內(nèi) 時(shí)，轉(zhuǎn)座效率不會(huì)顯著下降26,27。PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)還具 有半隨機(jī)(semi-random)插入的特點(diǎn)，即轉(zhuǎn)座片段具 有插入到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上下游附近以及基因內(nèi)含子 區(qū)域處的 TTAA 位點(diǎn)的偏好性28，這使得 PB 系統(tǒng) 有利于癌基因捕獲和增強(qiáng)子捕獲29,30。PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在 轉(zhuǎn)座片段被切除后不會(huì)在原位點(diǎn)留下印跡(footprint)， 基因組可以實(shí)現(xiàn)切除后精確修復(fù)31,32，在可逆轉(zhuǎn)基 因的應(yīng)用中具有重要作用。PB 轉(zhuǎn)座酶可塑性高，通 過(guò)與其它功能蛋白融合或改變轉(zhuǎn)座酶的功能區(qū)域， 不僅能夠改變轉(zhuǎn)座酶的活性和作用方式，也可以提 高外源基因轉(zhuǎn)座的靶向性3335。PB

14、轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物中同樣也具有高效轉(zhuǎn) 座活性26以及其他特性，使得該系統(tǒng)在基因組研究、 基因治療、干細(xì)胞誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后分化等研究領(lǐng)域獲 得了廣泛的應(yīng)用33,3644。1piggyBac 轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)制PB 轉(zhuǎn)座子 5端和 3端各有一個(gè)不對(duì)稱的末端重 復(fù)結(jié)構(gòu)域(Terminal repeat domain, TRD)，即都包含 13 bp 和 19 bp 的反向末端重復(fù)序列，不同的是 5端 和 3端的間隔序列分別為 3 bp 和 31 bp，中間是 2374 bp 的內(nèi)部結(jié)構(gòu)域(Internal domain, ID)45,46。PB 轉(zhuǎn)座酶在轉(zhuǎn)座片段末端 TTAA 與 GGG 之間的 T-G

15、進(jìn)行單鏈切割(nick)，產(chǎn)生 3-OH；通過(guò) 3-OH 攻擊 互補(bǔ)鏈的 TTAA 形成短暫的發(fā)卡結(jié)構(gòu)(hairpin)，將轉(zhuǎn) 座片段從基因組上切割出來(lái)；形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)座 片段在轉(zhuǎn)座酶的作用下，再次被單切，產(chǎn)生 TTAA 的粘性末端；最后，又以 3-OH 進(jìn)攻靶位點(diǎn)的 TTAA， 將目的基因插入到靶位點(diǎn)47。但是將 5和 3端 TRD 同時(shí)都用 3端 TRD 或 5端 TRD 代替時(shí)，并不能產(chǎn) 生轉(zhuǎn)座現(xiàn)象38，這說(shuō)明轉(zhuǎn)座酶在將目的片段轉(zhuǎn)座到 新的基因位點(diǎn)時(shí)需要左右臂相互配合。在供體質(zhì)粒 轉(zhuǎn)座到受體質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)中，PB 轉(zhuǎn)座臂需要的最短 ID 序列是 55 bp48，而在供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)座到受體基因組實(shí)

16、 驗(yàn)中，5和 3端最短 ID 序列長(zhǎng)度組合分別為 311 bp 和 235 bp49或 333 bp 和 179 bp50，暗示轉(zhuǎn)座臂與轉(zhuǎn) 座酶之間的親和力會(huì)影響 PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的轉(zhuǎn)座效率。酶的功能是由結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)決定的。以轉(zhuǎn)座的 方式來(lái)看， PB 轉(zhuǎn)座酶 應(yīng)該至少包 含結(jié)合結(jié)構(gòu) 域 (Binding domain)、催化結(jié)構(gòu)域(Catalytic domain)和 核定位信號(hào)(Nuclear localization signals)，可能還存 在轉(zhuǎn)座酶之間作用的功能域。已有研究表明，PB 轉(zhuǎn) 座酶的核定位信號(hào)存在于轉(zhuǎn)座酶 C 端第 551571 氨 基酸之間51。DDE 重組酶具有結(jié)合鎂離

17、子的催化核 心域 DDE 結(jié)構(gòu)域，而結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和突變篩選都顯示 PB 轉(zhuǎn)座酶的第 268、346、447 個(gè)天冬氨酸(D)也具 有類似 DDE 結(jié)構(gòu)域的功能47,52，該結(jié)構(gòu)域附近的其 他保守氨基酸與轉(zhuǎn)座酶的切割和插入功能有關(guān)，將 第 372 位精氨酸殘基與第 375 位賴氨酸殘基突變成 丙氨酸后，獲得的 PB 轉(zhuǎn)座酶只有剪切功能而喪失了 插入功能53。通過(guò)氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，PB 轉(zhuǎn)座酶 存在幾個(gè)氨基酸保守性比較豐富的區(qū)域52，這些保 守區(qū)域很可能是轉(zhuǎn)座酶的功能區(qū)域。用染色質(zhì)免疫 沉淀實(shí)驗(yàn)(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)證實(shí) PB 轉(zhuǎn)座酶 在無(wú)轉(zhuǎn)座臂

18、的情況下， 也可以結(jié)合 到 TTAA 序列35。以上研究結(jié)果表明，PB 轉(zhuǎn)座酶具有 多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，深入地理解轉(zhuǎn)座酶的這些結(jié)構(gòu)域 在轉(zhuǎn)座功能上的作用，將有利于對(duì) PB 轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行改 造，提高轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)座活性，改善靶向轉(zhuǎn)座的能力。2piggyBac 轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座效率的改善轉(zhuǎn)基因效率是影響轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在基因組研究、 哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因、基因治療等領(lǐng)域應(yīng)用的關(guān)鍵因素。 病毒載體因其插入效率高而廣泛應(yīng)用于前期的哺乳 動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究中，但是因?yàn)槠鋽y帶片段小、易引 起癌變、外源基因易沉默等缺陷，使得該系統(tǒng)在應(yīng) 用上受到了限制。PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)已經(jīng)被證明能夠在人 HEK 293 細(xì)胞和小鼠胚胎干細(xì)胞中，將外源基因轉(zhuǎn)

19、座到宿主基因組內(nèi)，轉(zhuǎn)基因效率較高，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性 細(xì)胞數(shù)/轉(zhuǎn)染前細(xì)胞總數(shù)的比率約為 10426。在小鼠胚胎干細(xì)胞中，將昆蟲源 PB 轉(zhuǎn)座酶的基 因序列密碼子優(yōu)化成小鼠偏好的密碼子，可以使轉(zhuǎn) 座效率提高 20 倍36,38；在人胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，PB 轉(zhuǎn)座酶基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后，轉(zhuǎn)座效率提高了 10 倍 左右，使轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率達(dá)到 5%左右，把 5端轉(zhuǎn)座臂 的反向末端重復(fù)序列 ITR 的第 53 位堿基 T 轉(zhuǎn)換為 C(T53C)，第 136 位的堿基 C 轉(zhuǎn)換為 T(C136T)，不僅能夠使轉(zhuǎn)座效率進(jìn)一步提高 59%，而且能夠使攜 帶的轉(zhuǎn)座片段長(zhǎng)度增加到 18 kb36，為插入大片段外 源基因提供了有

20、效方法。對(duì)密碼子優(yōu)化后的 PB 轉(zhuǎn)座 酶基因序列隨機(jī)突變后，在酵母中篩選到 18 個(gè)極度 活躍的 PB 轉(zhuǎn)座酶突變體，其中的 5 個(gè)突 變體 (I30V/G165S 、 S103P 、 M282V 、 S509G/N570S 和N538K)被證實(shí)在小鼠胚胎干細(xì)胞中也具有相似或 更高的轉(zhuǎn)座效率，并且進(jìn)一步通過(guò)突變體之間的組 合找到了一個(gè) 7 個(gè)氨基酸發(fā)生突變、轉(zhuǎn)座活性最高 的突變體 hyperactive piggyBac(mPB7)，其插入活性 和切除活性比突變前的轉(zhuǎn)座酶分別提高了 9 倍和 17 倍54。將昆蟲源 PB 轉(zhuǎn)座酶(iPB)突變了 7 個(gè)氨基酸 殘基的 PB 轉(zhuǎn)座酶(iPB7)，

21、與密碼子優(yōu)化的 PB 轉(zhuǎn)座 酶(mPB)相比，不僅在人肝細(xì)胞(Huh-7 cell)中的轉(zhuǎn)基 因效率提高了 2 倍，使陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占轉(zhuǎn)染前細(xì)胞總 數(shù)的 0.22%左右，而且能夠使外源基因在小鼠肝臟 內(nèi)的表達(dá)量也增加 2 倍55。在 HEK293 細(xì)胞中直接 比較 iPB、iPB7、mPB 和 mPB7 4 個(gè) PB 轉(zhuǎn)座酶發(fā)現(xiàn)， 經(jīng)密碼子優(yōu)化后的 PB 轉(zhuǎn)座酶表達(dá)量比不經(jīng)密碼子 優(yōu)化的轉(zhuǎn)座酶高出 10 倍，同時(shí)也發(fā)現(xiàn) PB7 轉(zhuǎn)座酶在 低劑量情況下相對(duì)于突變前的 PB 轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)座效率 優(yōu)勢(shì)更加明顯56。但是，iPB7 轉(zhuǎn)座酶在果蠅和埃及 伊蚊中轉(zhuǎn)座效果并不令人滿意，雖然 iPB7 在果蠅細(xì) 胞中

22、轉(zhuǎn)基因效率達(dá)到了 3.14103，相對(duì)于原始 PB 轉(zhuǎn)座效率 (1.14103)有所提高，但是在個(gè)體水平轉(zhuǎn) 基因?qū)嶒?yàn)中，iPB7 轉(zhuǎn)座酶導(dǎo)致 80%左右的果蠅發(fā)生 了不育的現(xiàn)象57。PB 轉(zhuǎn)座酶末端與某些外源肽段連接后的融合 蛋白也能提高 PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的轉(zhuǎn)座效率。GFP、His tag、 Myc tag 和 HIV-TAT(HIV-1 transactivator of tran- scription protein)通過(guò)不同的組合與 PB 轉(zhuǎn)座酶融合 后獲得了兩個(gè)重組轉(zhuǎn)座酶 TPLGMH 和 ThyPLGMH， 在人 HEK293 細(xì) 胞的轉(zhuǎn)基因 實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)座 效率比 Myc-tagged

23、PB 轉(zhuǎn)座酶分別提高了 9 倍和 7 倍，在 iPS 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中也提高了 4 倍；而且不同組合的重組轉(zhuǎn) 座酶在不同類型細(xì)胞中效率也有不同，在 HEK293、 CHO 和 C17.2 細(xì)胞中最高的轉(zhuǎn)座效率分別為 1.1%、 4.5%和 9.9%58。HIV-TAT 蛋白含有一段能夠引導(dǎo) 整個(gè)蛋白進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的信號(hào)肽59,60，該信號(hào)肽與 PB 轉(zhuǎn)座酶融合后能夠引導(dǎo)轉(zhuǎn)座酶在細(xì)胞核聚集，從而提高了轉(zhuǎn)座效率61。3 piggyBac 轉(zhuǎn)座子靶向插入的改造PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)介導(dǎo)的外源片段轉(zhuǎn)基因只能識(shí)別 基因組中 TTAA 四堿基序列，具有很大的隨機(jī)性， 一旦轉(zhuǎn)座片段插入到內(nèi)源基因啟動(dòng)子附近或者基因 內(nèi)部，就

24、可能引發(fā)基因沉默、癌基因表達(dá)等。而且 PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)具有插入位點(diǎn)偏好性，插入位點(diǎn)分析結(jié) 果顯示近一半的轉(zhuǎn)座子片段插入到已注釋的基因上 面28,62，因此插入片段可能干擾機(jī)體本身的內(nèi)源基 因表達(dá)，影響正常的生長(zhǎng)發(fā)育。改變 PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)插 入位點(diǎn)的偏好性，甚至靶向插入到基因組特定位點(diǎn)， 將有助于基因組研究，也是基因治療的必要條件。GAL4(Galactose regulated upstream promoter element) 能夠?qū)Ｒ恍缘刈R(shí)別 UAS(Upstream activator sequences) 序列，激活下游基因表達(dá)。GAL4 之所以能夠?qū)Ｒ坏刈R(shí)別 UAS 序列是因?yàn)?GA

25、L4 上有特異識(shí)別并結(jié)合 DNA 序列的 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain, DBD)，如果利用 GAL4 的 DBD 序列與 PB 轉(zhuǎn)座酶 融合形成融合蛋白，那么轉(zhuǎn)座酶就可以在 DBD 引導(dǎo) 下在含 UAS 序列的特 異位點(diǎn)發(fā) 生 轉(zhuǎn)座。 GAL4- piggyBac 在埃及伊蚊細(xì)胞供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)座到受體質(zhì)粒 實(shí)驗(yàn)中表明，有 67%的轉(zhuǎn)座片段插入到預(yù)先設(shè)定的 UAS 序列附近的 TTAA 位置33，在人 HEK293 細(xì)胞 供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)座到基因組實(shí)驗(yàn)中，有 24%的轉(zhuǎn)座片段 插入到 UAS 附近的區(qū)域63。但是，GAL4-piggyBac 的靶向插入需要在基因組上有 UAS

26、 序列，而一般情 況下靶位點(diǎn)附近不存在 UAS 序列，GAL4-piggyBac 融合蛋白依然不能滿足自主選擇插入位點(diǎn)的要求。 腺關(guān)聯(lián)病毒(Adeno-associated virus)的 Rep 蛋白 能特異性結(jié)合到 Rep 識(shí)別序列(Rep recognition se- quences, RRSs)，單純地將該 Rep 蛋白與 PB 轉(zhuǎn)座酶 融合后并不能使 PB 轉(zhuǎn)座片段特異性插入到基因組 RRSs 序列附近。將 RRSs 序列預(yù)先插入到 PB 轉(zhuǎn)座 片段上，雖然不能達(dá)到靶向插入的目的，但是在一定程度上改變了 PB 轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的偏好性64。 鋅指蛋白(Zinc finger prot

27、ein, ZFP)和轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因 子 (Transcription activator-like effector, TALE)能夠自主設(shè)計(jì)，具有特異性地識(shí)別和結(jié)合到 對(duì)應(yīng) 序列 的 能 力 65,66 ， 理論上 ZFP-piggyBac 和TALE-piggyBac 融合蛋白可以利用靶向作用將轉(zhuǎn)座 酶帶到目的位點(diǎn)附近，實(shí)現(xiàn)目的基因靶向插入。將 改造過(guò)的 Checkpoint kinase-2 (細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶 2，CHK2)-ZFP 與 PB 轉(zhuǎn)座酶融合后，和供體轉(zhuǎn)座片 段一起導(dǎo)入到人 HEK293 細(xì)胞內(nèi)，但是轉(zhuǎn)座片段并 沒(méi)有靶向插入到基因組上 ZFP 識(shí)別位點(diǎn)附近；進(jìn)一 步通

28、過(guò)預(yù)先在基因組上插入一段 CHK2-ZFP 識(shí)別位 點(diǎn)和富含 TTAA 的序列后，盡管 ZFP-piggyBac 轉(zhuǎn)座 酶與原始 PB 轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)基因效率類似，但是兩者在 ZFP 識(shí)別位點(diǎn)附近發(fā)生轉(zhuǎn)座的細(xì)胞數(shù)占陽(yáng)性細(xì)胞總 數(shù)分別是 43.9%和 22.50%，說(shuō)明 ZFP-piggyBac 融合 蛋白確實(shí)具有一定的靶向傾向35。TALE 相對(duì)于 ZFP 具有更大的自主設(shè)計(jì)的優(yōu)勢(shì)，可以直接在基因組上 選擇合適的位置設(shè)計(jì)結(jié)合位點(diǎn)。TALE-piggyBac 融 合轉(zhuǎn)座酶在不經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)基因改造的人 HEK293 細(xì)胞基 因組實(shí)驗(yàn)上轉(zhuǎn)基因效率達(dá)到了 11%左右，但是靶向 插入到 TALE 識(shí)別位點(diǎn)附近的效率

29、只有 0.01% 0.014%34。這個(gè)系統(tǒng)的靶向插入效率仍然很低。從 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出在插入位點(diǎn)選擇上，融合蛋白仍 然以 PB 轉(zhuǎn)座酶自身功能占主導(dǎo)，融合的 DNA 結(jié)合 蛋白靶向作用較弱。從這一點(diǎn)可以看到，進(jìn)一步認(rèn) 識(shí)和改造 PB 轉(zhuǎn)座酶，將 PB 轉(zhuǎn)座酶的催化區(qū)域與 TALE 等 DNA 特異性結(jié)合蛋白融合，從而將 PB 轉(zhuǎn) 座酶改造成在基因組任意位點(diǎn)都能靶向插入的新型 轉(zhuǎn)基因工具，是 PB 轉(zhuǎn)座酶的一個(gè)重要的研究方向。4piggyBac 轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入外源大片段基因的 能力改進(jìn)基因組上存在大量的調(diào)控元件，對(duì)基因表達(dá)有 重要的調(diào)控作用。但是受到轉(zhuǎn)基因載體片段長(zhǎng)度的 限制，很多調(diào)控元件并不能構(gòu)

30、建到載體上。細(xì)菌人 工染色體(BAC)載體能夠攜帶 300 kb 大片段 DNA67。 PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)具有轉(zhuǎn)座大片段基因的能力，聯(lián)合利用 PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)與 BAC 載體能夠進(jìn)行大片段基因轉(zhuǎn)座。 將 PB 轉(zhuǎn)座子的左右臂序列分別構(gòu)建在 BAC 載體的 目的基因片段的兩端，構(gòu)建了轉(zhuǎn)座片段長(zhǎng)度分別為 28 kb、70 kb 和 100 kb 的 3 個(gè) BAC 載體，將這些 BAC 載體分別與 mPB 轉(zhuǎn)座酶或 hypPB 轉(zhuǎn)座酶(即高 效轉(zhuǎn)座酶 mPB7)共同導(dǎo)入小鼠 ES 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)基因?qū)?驗(yàn)均獲得成功27。雖然轉(zhuǎn)座效率隨著轉(zhuǎn)座片段的長(zhǎng)度而有所下降，但即使是 100 kb 的轉(zhuǎn)座片段，經(jīng) HAT

31、( 次黃嘌呤、氨基喋 呤和胸腺嘧 啶核苷酸 ) 和 FIAU( 非阿尿苷 ) 藥物 雙篩選后， mPB 轉(zhuǎn)座 酶和 hypPB 轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)基因 陽(yáng)性率分別 達(dá)到 7% 和 29%27。PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)介導(dǎo)的 BAC 載體轉(zhuǎn)基因技術(shù) 在人 ES 細(xì)胞上也獲得成功，并且將轉(zhuǎn)座片段擴(kuò)大到 了 207 kb68,69。將含 207 kb 轉(zhuǎn)座片段的 BAC 載體 和 PB 轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒共同導(dǎo)入到 HEK293 細(xì)胞中，抗 生素篩選得到 60 個(gè)左右陽(yáng)性細(xì)胞克隆，反向 PCR 實(shí)驗(yàn)證明有 13 個(gè)細(xì)胞克隆真正含有轉(zhuǎn)座片段68。利 用原核顯微注射技術(shù)共同注射 PB 轉(zhuǎn)座酶和 BAC 載 體到小鼠受精卵中也能獲

32、得轉(zhuǎn)基因個(gè)體70。5 piggyBac 轉(zhuǎn)座子一元轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的改進(jìn)供體質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒構(gòu)成的 PB 二元轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在細(xì)胞上能夠較好地行使轉(zhuǎn)座功能，但是在 單精子胞漿內(nèi)注射(Intracytoplasmic sperm injection,基因，需要檢測(cè)大量的分子標(biāo)記和雜交后代數(shù)目， 耗費(fèi)大量的財(cái)力和物力。轉(zhuǎn)座系統(tǒng)高效的轉(zhuǎn)座能力， 以及本身即可作為分子標(biāo)記的特點(diǎn)，使其在尋找表 型相關(guān)基因過(guò)程中能夠發(fā)揮很好的作用。PB 轉(zhuǎn)座系 統(tǒng)在遺傳學(xué)研究中的優(yōu)勢(shì)在于轉(zhuǎn)座效率高、插入位 點(diǎn)分布范圍廣以及在轉(zhuǎn)座酶存在的情況下可以進(jìn)行 自發(fā)地轉(zhuǎn)座。在含有 PB 轉(zhuǎn)座片段的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物上， 只要與含有 PB 轉(zhuǎn)座酶基因

33、的異性同種動(dòng)物交配，就 可以改變轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)73，能夠方便地進(jìn)行大規(guī) 模的功能基因篩選工作。目前，PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)已經(jīng)廣 泛應(yīng)用于功能基因的篩選7476。6.2piggyBac 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在遺傳疾病治療上的應(yīng)用基因治療的目標(biāo)是通過(guò)靶位點(diǎn)基因突變(敲除 或插入)，使得靶基因喪失功能或者重新恢復(fù)正常功 能。鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease, ZFN)57、TALE 核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,58,77ICSI)實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)座效率很低。 一個(gè)自我失活(Self-ina-TALEN)和 CRISPR(Clust

34、ered regularly interspacedctivating)質(zhì)?？梢詫?shí)現(xiàn) PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在 ICSI 中的應(yīng)short palindromic repeats, 成簇規(guī)律間隔的短回文重78,79用71，該 PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)中轉(zhuǎn)座片段序列和轉(zhuǎn)座酶基復(fù)序列 )/Cas9(CRISPR-associated) 系統(tǒng) 等技術(shù) 因序列包含在同一個(gè)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)座酶基因的啟動(dòng)子 構(gòu)建在轉(zhuǎn)座片段的 ITR 內(nèi)，而轉(zhuǎn)座酶編碼基因構(gòu)建 在轉(zhuǎn)座片段的 ITR 外，因此在轉(zhuǎn)座片段被切除后， 轉(zhuǎn)座酶編碼基因與其啟動(dòng)子被分離而失活。自我失 活 PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)質(zhì)粒還被應(yīng)用在原核顯微注射實(shí)驗(yàn) 中，相對(duì)于傳統(tǒng)的原核顯微

35、注射，轉(zhuǎn)基因效率提高 了 5 倍72。但是該系統(tǒng)中轉(zhuǎn)座片段內(nèi)含有一段啟動(dòng) 子序列，可能因?yàn)?PB 轉(zhuǎn)座片段的隨機(jī)插入，造成該 啟動(dòng)子下游基因錯(cuò)誤的表達(dá)，因而也存在一定的風(fēng) 險(xiǎn)。另一種 PB 一元轉(zhuǎn)座系統(tǒng)是將轉(zhuǎn)座片段和轉(zhuǎn)座酶 構(gòu)建在一個(gè)質(zhì)粒中，并且將轉(zhuǎn)座片段末端不含 TTAA 序列的 ITR 側(cè)翼序列構(gòu)建在轉(zhuǎn)座酶基因兩側(cè)，該系 統(tǒng)不僅具有與原始轉(zhuǎn)座酶相似的轉(zhuǎn)座效率，而且 5 端和 3端轉(zhuǎn)座臂片段分別減少至 35 bp 和 63 bp，減 小了插入到基因組上的轉(zhuǎn)座片段的長(zhǎng)度25。6 piggyBac 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的應(yīng)用前景6.1 piggyBac 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在功能基因篩選上的應(yīng)用傳統(tǒng)的正向遺傳學(xué)需要分子

36、標(biāo)記篩選表型相關(guān)的發(fā)展使得基因精確敲除成為了可能，TALEN 和CRISPR/ Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)的基因敲除治療遺傳疾病已 經(jīng)獲得成功80,81，然而插入修復(fù)仍然受到插入效率 的影響。PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)具有高效轉(zhuǎn)座、載體攜帶片段 大等優(yōu)勢(shì)，為基因插入治療提供了一種新方法。在 小鼠體細(xì)胞內(nèi)通過(guò)共同注射 PB 轉(zhuǎn)座酶載體質(zhì)粒和 含熒光素酶基因的轉(zhuǎn)座片段，能夠檢測(cè)到熒光素酶 基因穩(wěn)定插入小鼠基因組并持續(xù)表達(dá)82，對(duì)小鼠靜 脈同時(shí)注射 PB 轉(zhuǎn)座酶和外源基因的載體，同樣可以 檢測(cè)到外源基因在肝臟內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)37。但是，PB 轉(zhuǎn) 座系統(tǒng)仍然存在一些潛在的風(fēng)險(xiǎn)，主要是插入片段 的隨機(jī)性可能干擾機(jī)體正常的基因表達(dá)

37、或沉默基因 表達(dá)。而采用基因工程改造的與 TALE 等融合的 PB 轉(zhuǎn)座酶，具有攜帶外源片段靶向插入到自主設(shè)計(jì)的 基因位點(diǎn)的傾向，消除隨機(jī)插入帶來(lái)的安全隱患， 但是該系統(tǒng)靶向效率還很低，而且存在大量的脫靶 現(xiàn)象3335，所以很顯然有必要進(jìn)一步開發(fā) TALE 等 DNA 特異性結(jié)合蛋白與 PB 轉(zhuǎn)座酶融合的新型轉(zhuǎn)基 因?qū)嶒?yàn)元件，提高其靶向效率，只有這樣才能更好 地應(yīng)用于基因治療。6.3piggyBac 轉(zhuǎn)座子在制備誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS cell)上的應(yīng)用細(xì)胞治療已經(jīng)成為第三次醫(yī)學(xué)革命的主要手段， 人們可以通過(guò)移植干細(xì)胞，使機(jī)體組織器官獲得重 新生長(zhǎng)發(fā)育的能力。但干細(xì)胞由于道德倫理等因素 的限制

38、難以獲取，為了避免道德倫理的壓力，科學(xué) 家發(fā)現(xiàn)已分化細(xì)胞可以在 c-Myc、Klf4、Oct4 和 Sox24 個(gè)因子的調(diào)控下獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS cell)83。 PB 轉(zhuǎn)座子能夠?qū)⑼瑫r(shí)攜帶這 4 個(gè)調(diào)控因子的載體插 入到染色體上并進(jìn)行表達(dá)，誘導(dǎo)生成 iPS 細(xì)胞，這 些細(xì)胞在細(xì)胞外形、基因表達(dá)模式和表觀遺傳等方 面均與胚胎干細(xì)胞一致84。不僅如此，在干細(xì)胞分 化過(guò)程中，也能夠利用 PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的精確刪除功能 將誘導(dǎo) iPS 的因子從基因組中切除36,40,84，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞 治療前后基因組的一致性。已有研究通過(guò)突變和篩 選，獲得了只具有切除功能而無(wú)插入功能的兩個(gè)高 效 PB 轉(zhuǎn) 座酶突

39、變 體 PB7(M194V/R372A/K375A) 和 PB7(R372A/K375A/D450N)，使得 PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)介導(dǎo)的 iPS 細(xì) 胞在誘導(dǎo)分化前能夠?qū)Ｒ恍郧谐T導(dǎo)因子序列而不 發(fā)生誘導(dǎo)因子序列再次轉(zhuǎn)座到基因組上的問(wèn)題，并且 仍然保持了切除后基因組精確修復(fù)的能力66。突變 后的 PB 轉(zhuǎn)座酶使得 PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在 iPS 細(xì)胞獲得及 其分化中具有其他轉(zhuǎn)基因模式所不具備的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。7展望PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)雖然獲得了廣泛的應(yīng)用，但是對(duì)轉(zhuǎn) 座酶結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)仍然不清楚。通過(guò)生物信息學(xué)分析、 遺傳突變體篩選和晶體衍射等方式解析轉(zhuǎn)座酶的功 能區(qū)域，對(duì)提高 PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的應(yīng)用價(jià)值具有很大幫 助。在基

40、因組編輯方面可以通過(guò)改變轉(zhuǎn)座酶插入識(shí) 別位點(diǎn)(TTAA)而實(shí)現(xiàn)隨機(jī)插入，也可以與結(jié)合蛋白 (如 TALE 蛋白)融合達(dá)到基因組大片段切除和靶向 插入的目的。在遺傳學(xué)方面，既可以利用 PB 轉(zhuǎn)座子 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)加快分子育種進(jìn)程，也可以用于 捕獲功能基因。在細(xì)胞治療方面，能夠利用 PB 轉(zhuǎn)座 系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)將誘導(dǎo)因子插入到已分化的體細(xì)胞內(nèi)獲 得 iPS 細(xì)胞，再通過(guò) PB 轉(zhuǎn)座酶的切除功能將誘導(dǎo)因 子從 iPS 細(xì)胞內(nèi)切除，繼而進(jìn)一步誘導(dǎo)分化而獲得 目的細(xì)胞。上述這些內(nèi)容可以成為今后有關(guān) PB 轉(zhuǎn)座 系統(tǒng)的研究目標(biāo)。參考文獻(xiàn)1 McClintock B. Chromosome organizati

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