免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

1、關(guān)于免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)第一張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、免疫學(xué)檢驗(yàn)原理抗原-抗體反應(yīng)：指抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)、外發(fā)生高度特異性結(jié)合反應(yīng)。由于實(shí)驗(yàn)所用的抗體存在于血清中，故又稱(chēng)血清學(xué)反應(yīng)（serological reaction)應(yīng)用：用已知抗原檢測(cè)未知抗體；用已知抗體檢測(cè)未知抗原：定性或定量檢測(cè)體內(nèi)各種分子；用已知抗體檢測(cè)半抗原物質(zhì)。第二張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.特異性和交叉反應(yīng) 特異性：一種抗原通常僅能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體結(jié)合。分子基礎(chǔ)：抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補(bǔ)性。（一）抗原-抗體反應(yīng)的特點(diǎn)第三張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6

2、月交叉反應(yīng)（cross reaction）性：若兩種抗原分子有一個(gè)或數(shù)個(gè)相同（或相似）的決定基，則針對(duì)一種抗原的抗血清可與另一種抗原發(fā)生反應(yīng)。第四張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 結(jié)合價(jià)： 天然抗原分子表面一般含多種抗原決定基，可與多個(gè)抗體分子結(jié)合，為多價(jià)。單體形式的抗體分子有兩個(gè)Fab段，能結(jié)合兩個(gè)相同的抗原決定基，為兩價(jià)。2.比例性第五張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月比例合適： 若抗原、抗體的數(shù)量比例合適，抗體分子的兩個(gè)Fab段分別與兩個(gè)抗原決定基結(jié)合，相互交叉連接成網(wǎng)格狀復(fù)合體，則反應(yīng)體系中基本不存在游離的抗原或抗體，此時(shí)形成肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)物（沉淀物或凝集物）。

3、因此，確定反應(yīng)體系中抗原、抗體的最適比例十分重要。前帶現(xiàn)象（prozone）和后帶現(xiàn)象(postzone) Ab過(guò)剩和Ag過(guò)剩抗原和抗體結(jié)合是否呈現(xiàn)可見(jiàn)的反應(yīng)現(xiàn)象，與兩者的濃度和比例密切相關(guān)第六張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月前帶現(xiàn)象（prozone）和后帶現(xiàn)象(postzone)Ab過(guò)剩和Ag過(guò)剩第七張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月網(wǎng)格學(xué)說(shuō)（lattice theory）抗體過(guò)?？乖^(guò)?？贵w抗體比例合適抗原抗體第八張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 抗原-抗體反應(yīng)為分子表面的非共價(jià)結(jié)合，結(jié)合雖穩(wěn)定但可逆。在一定條件下（如低pH、高濃度鹽、凍融等），抗原-抗體

4、復(fù)合物可被解離。解離后的抗原和抗體仍保持原有理化特性和生物學(xué)活性。 根據(jù)此特點(diǎn)，可借助親和層析法純化抗原或抗體。3.可逆性第九張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4.階段性抗原抗體反應(yīng)可分為兩個(gè)階段 特異性結(jié)合階段：反應(yīng)快，不可見(jiàn)。 可見(jiàn)的反應(yīng)階段：反應(yīng)慢，出現(xiàn)凝集、沉淀和細(xì)胞溶解等現(xiàn)象。 第十張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.電解質(zhì) 抗原和抗體有對(duì)應(yīng)的極性基團(tuán)，能相互吸附并由親水性變?yōu)槭杷浴ｋ娊赓|(zhì)的存在使抗原-抗體復(fù)合物失去電荷而凝聚，出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)，故免疫學(xué)試驗(yàn)中多用生理鹽水稀釋抗原或抗體。（二）、抗原-抗體反應(yīng)的影響因素第十一張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年

5、6月2.酸堿度 抗原抗體反應(yīng)的最適pH是6-8。3.溫度最適溫度為37。有些例外，如冷凝集素在 4左右與紅細(xì)胞結(jié)合最好，20以上反而解離。第十二張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 4.抗原和抗體的性質(zhì) 抗體的特異性和親和力是決定抗原-抗體反應(yīng)的關(guān)鍵因素。 此外，抗原理化性質(zhì)、抗原決定基多寡和種類(lèi)等均可影響抗原-抗體反應(yīng)。 第十三張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月抗體分子上一個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的抗原決定基之間的結(jié)合能力親和力(affinity)第十四張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 根據(jù)抗原的性質(zhì)、結(jié)合反應(yīng)的現(xiàn)象、參與反應(yīng)的成分等因素分類(lèi)： 1.凝集反應(yīng) 2.沉淀

6、反應(yīng) 3.補(bǔ)體參加的反應(yīng) 4.免疫標(biāo)記技術(shù)（三）、免疫學(xué)檢驗(yàn)方法第十五張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月反應(yīng)類(lèi)型實(shí)驗(yàn)技術(shù)非標(biāo)記凝集反應(yīng)直接凝集試驗(yàn)、間接凝集試驗(yàn)、間接抑制凝集試驗(yàn)、協(xié)同凝集試驗(yàn)沉淀反應(yīng)液相內(nèi)凝集試驗(yàn)、凝膠內(nèi)凝集試驗(yàn)補(bǔ)體參與的反應(yīng)補(bǔ)體溶血試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中和反應(yīng)病毒中和試驗(yàn)、毒素中和試驗(yàn)標(biāo)記標(biāo)記免疫反應(yīng)熒光免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)金免疫技術(shù)第十六張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 顆粒性抗原（細(xì)菌或細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集物，稱(chēng)為凝集反應(yīng)(agglutination) 。用于凝集反應(yīng)中的抗原稱(chēng)凝集原(aggl

7、utinogen)。用于凝集反應(yīng)中的抗體稱(chēng)凝集素（agglutinin)。 凝集反應(yīng)（Agglutination Tests）第十七張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1直接凝集（direct agglutination) ： 細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)抗體直接反應(yīng)，可出現(xiàn)細(xì)菌或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。2間接凝集（indirect or passive agglutination) ： 檢測(cè)針 對(duì)可溶性Ag的Ab3間接凝集抑制試驗(yàn) (direct agglutination inhibition test)4. 協(xié)同凝集試驗(yàn)（co-agglutination test） 載體為金葡菌，其細(xì)胞壁蛋白A與

8、IgG 的Fc結(jié)合，用于細(xì)菌、病毒的快速檢測(cè)。第十八張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十九張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月妊娠免疫診斷試驗(yàn) 孕婦尿中，絨毛膜促性腺激素（HCG）含量明顯增高。（HCG是可溶性抗原 ）反之，非孕婦尿中HCG含量甚微，不足以消耗掉抗HCG抗體。 HCG檢測(cè)為間接凝集試驗(yàn)的應(yīng)用第二十張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Definition:可溶性抗原（血清蛋白、外毒素、細(xì)菌濾液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下，形成出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀物的現(xiàn)象稱(chēng)為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)（Precipitation Tests）用于沉淀反應(yīng)中的抗原稱(chēng)沉淀原(pr

9、ecipitonogen)。用于沉淀反應(yīng)中的抗體稱(chēng)沉淀素（precipitin) 。 第二十一張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月大多沉淀反應(yīng)多用半固體瓊脂凝膠作為介質(zhì)進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散或免疫擴(kuò)散，即可溶性抗原與抗體在凝膠中擴(kuò)散，在比例合適處相遇即形成可見(jiàn)的白色沉淀。第二十二張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1單向免疫擴(kuò)散(single immunodiffusion)2雙向免疫擴(kuò)散(double immunodiffusion)沉淀反應(yīng)第二十三張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月單向免疫擴(kuò)散(Single Immunodiffusion)是將一定量已知抗體混于瓊脂凝膠中制

10、瓊脂板，在適當(dāng)位置打孔后將抗原加入孔中擴(kuò)散。抗原在擴(kuò)散過(guò)程中與凝膠中的抗體相遇，形成以抗原孔為中心的沉淀環(huán)，環(huán)的直徑與抗原含量成正比相關(guān)。本法常用于測(cè)定血清IgG、IgM、IgA 和 C 3等的含量。含抗體的凝膠沉淀環(huán)第二十四張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月雙向免疫擴(kuò)散 （Double Immunodiffusion)是將抗原與抗體分別加入瓊脂凝膠的小孔中，二者自由向周?chē)鷶U(kuò)散并相遇，在比例合適處形成沉淀線(xiàn)。如果反應(yīng)體系中含兩種以上的抗原抗體系統(tǒng)，則小孔間可出現(xiàn)兩條以上的沉淀線(xiàn)。本法常用于抗原或抗體的定性 、組成和兩種抗原相關(guān)性分析的檢測(cè)。第二十五張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于202

11、2年6月第二十六張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（Complement Fixation test, CFT) 敏感性和特異性均較高，但該試驗(yàn)影響因素較多，現(xiàn)在已有被其它新方法取代的趨勢(shì)。第二十七張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(complement fixation test，CFT ) 將免疫溶血作為指示系統(tǒng)，用以檢測(cè)另一反應(yīng) 系統(tǒng)中抗原或抗體的傳統(tǒng)方法。第二十八張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月試驗(yàn)原理作用原理：利用補(bǔ)體的溶細(xì)胞作用進(jìn)行各種物理狀態(tài)的抗原抗體測(cè)定5種成分，3個(gè)系統(tǒng) 反應(yīng)系統(tǒng)（溶菌系統(tǒng)）：已知抗原（或抗體） 與待測(cè)抗

12、體（或抗原） 補(bǔ)體系統(tǒng)： 指示系統(tǒng)（溶血系統(tǒng)）：SRBC與相應(yīng)溶血素。試驗(yàn)時(shí)常將其預(yù)先結(jié)合，成為致敏綿羊紅細(xì)胞（sensitized sheep red blood cell,SRBCS）。溶菌系統(tǒng)第二十九張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月反應(yīng)分兩步進(jìn)行 第一步:反應(yīng)系統(tǒng)與補(bǔ)體的作用 第二步:指示系統(tǒng)利用剩余補(bǔ)體的反應(yīng)不溶血為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陽(yáng)性，而溶血為試驗(yàn)陰性第三十張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月已知抗原加入血清（檢測(cè)抗體）加入標(biāo)準(zhǔn)量補(bǔ)體加入包被抗體的紅細(xì)胞檢測(cè)紅細(xì)胞溶解情況AgPatientsserum AbNo AbAg第三十一張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年

13、6月 用熒光素、酶、放射性核素或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等標(biāo)記抗體或抗原，進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)的檢測(cè)，是目前應(yīng)用最為廣泛的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。標(biāo)記物與抗體或抗原連接后并不改變抗原抗體的免疫特性，具有靈敏度高、快速、可定性、定量、定位等優(yōu)點(diǎn)。免疫標(biāo)記技術(shù)（Immunolabelling technique）第三十二張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待檢標(biāo)本中抗原反應(yīng)，置熒光顯微鏡下觀(guān)察，抗原-抗體復(fù)合物散發(fā)熒光，借此對(duì)抗原進(jìn)行定性或定位。 1免疫熒光法(immunofluorescence, IF)第三十三張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1）直接熒光法：

14、熒光素直接標(biāo)記抗體，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。該法優(yōu)點(diǎn)是特異性高，缺點(diǎn)是檢查任一抗原均須制備相應(yīng)熒光抗體。（2）間接熒光法：用一抗與標(biāo)本中抗原結(jié)合，再用熒光素標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測(cè)。該法優(yōu)點(diǎn)是敏感度比直接法高，制備一種熒光素標(biāo)記的二抗即可用于多種抗原的檢測(cè),但非特異性反應(yīng)亦增強(qiáng)。免疫熒光法分類(lèi)第三十四張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月免疫熒光法圖示第三十五張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 此法將抗原-抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合，借助酶作用于底物的顯色反應(yīng)判定結(jié)果。應(yīng)用酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)定光密度（OD）值可反映抗原含量，靈敏度達(dá)ng/ml甚至pg/ml水平。常見(jiàn)的標(biāo)記物為：辣根

15、過(guò)氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP） 酶免疫測(cè)定(enzyme immunoassay, EIA)第三十六張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月常用的方法如下：（1）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 第三十七張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1） ELISA是酶免疫測(cè)定中應(yīng)用最廣的技術(shù)，用于測(cè)定可溶性抗原或抗體。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性強(qiáng)，可自動(dòng)化檢測(cè)，從而被廣泛用于檢測(cè)多種病原體抗原或抗體、血液及其他體液中微量蛋白成分、細(xì)胞因子等。第三十八張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 分類(lèi)：（1）

16、放射免疫分析法(radioimmunoassay, RIA)（2）免疫放射分析法（immunoradiometric assay, IRMA） 3放射免疫技術(shù)第三十九張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 乃用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)。該法兼有放射性核素的高靈敏度和抗原-抗體反應(yīng)的特異性，檢測(cè)靈敏度達(dá)pg水平。常用于標(biāo)記的放射性核素為125I和131I，分為液相和固相兩種方法。 該法常用于測(cè)定微量物質(zhì)，如胰島素、生長(zhǎng)激素、甲狀腺素、孕酮等激素，嗎啡、地高辛、IgE等。 放射免疫分析法(radioimmunoassay, RIA)第四十張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年

17、6月 屬于非競(jìng)爭(zhēng)性放射性配體結(jié)合分析技術(shù)。他與RIA為代表的競(jìng)爭(zhēng)性放射性配體分析技術(shù)的區(qū)別主要有兩點(diǎn)：一，放射性核素標(biāo)記的是抗體而不是抗原，其二是采用過(guò)量抗體而不是限量抗體。RIMA與RIA相比較，提高了檢測(cè)的靈敏度并使檢測(cè)范圍增寬，特異性和精確度進(jìn)一步提高。 免疫放射分析法（immunoradiometric assay, IRMA） 第四十一張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月免疫放射分析法有以下特點(diǎn)：1.以標(biāo)記抗體作為示蹤劑2.反應(yīng)動(dòng)力學(xué)：因標(biāo)記抗體是過(guò)量的，且反應(yīng)是非競(jìng)爭(zhēng)性 的，抗原抗體是全量反應(yīng)，故反應(yīng)速度比RIA快。3.靈敏度明顯高于放射免疫分析，約為放射免疫分析的1010

18、0倍。4.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)工作范圍寬。5.特異性高。6.穩(wěn)定性好。第四十二張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月金標(biāo)記免疫技術(shù) 膠體金標(biāo)記技術(shù) (Immunogold labeling technique) 是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。第四十三張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月免疫膠乳試驗(yàn)應(yīng)用第四十四張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月膠乳凝集試驗(yàn)原理： 膠乳凝集試驗(yàn)是一種間接凝集試驗(yàn)，它是以聚苯乙烯膠乳微粒作為惰性載體。膠乳為人工合成的載體，因此其性能比生物來(lái)源的紅細(xì)胞穩(wěn)定，均一性好。但膠乳與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力以及凝集性能不如紅細(xì)胞，因此

19、作為間接凝集試驗(yàn)，膠乳試驗(yàn)的敏感度不及血凝試驗(yàn)。 第四十五張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月膠乳凝集試驗(yàn)方法：傳統(tǒng)的膠乳凝集試驗(yàn)分試管法與玻片法。試管法先將受檢標(biāo)本在試管中以緩沖液作倍比稀釋?zhuān)缓蠹尤胫旅舻哪z乳試劑，反應(yīng)后觀(guān)察膠乳凝集結(jié)果。玻片法操作簡(jiǎn)便，1滴受檢標(biāo)本和1滴致敏的膠乳試劑在玻片上混勻后，連續(xù)搖動(dòng)23min即可觀(guān)察結(jié)果。出現(xiàn)大顆粒凝集的為陽(yáng)性反應(yīng)，保持均勻乳液狀為陰性反應(yīng)。 第四十六張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月抗鏈球菌溶血素“O”（ASO）原理： 膠乳凝集試驗(yàn)原理相同，在受檢者血清中，加入溶血素“O”,出現(xiàn)凝集顆粒，即為陽(yáng)性。參考值： ASO250U/L

20、第四十七張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月臨床意義：1.ASO測(cè)定對(duì)于診斷A族鏈球菌感染很有價(jià)值，其存在及含量可反映感染的嚴(yán)重程度。2.風(fēng)濕熱、急性腎小球腎炎、結(jié)節(jié)性紅斑、猩紅熱、急性扁桃體炎等ASO明顯升高。3.少數(shù)肝炎、結(jié)締組織病、結(jié)核病及多發(fā)性骨髓瘤病人亦可使ASO增高。 4.當(dāng)效價(jià)250U/L時(shí)，才被認(rèn)為有診斷價(jià)值。 抗鏈球菌溶血素“O”（ASO）第四十八張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月類(lèi)風(fēng)濕因子（rheumatoid factor,RF） 類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是由自身抗體免疫復(fù)合物引起的自身免疫性疾病。 類(lèi)風(fēng)濕因子是由于感染因子（細(xì)菌、病毒等）引起體內(nèi)產(chǎn)生的以

21、變性IgG為抗原的一種抗體，故又稱(chēng)抗抗體。 第四十九張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月原理： 將變性IgG包被于聚苯乙烯膠乳顆粒上，這種致敏膠乳在與待測(cè)血清中的RF相遇時(shí)，即發(fā)生肉眼可見(jiàn)的凝集。參考值： 正常人1：20稀釋血清為陰性。 類(lèi)風(fēng)濕因子（rheumatoid factor,RF） 第五十張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月臨床意義：1.約90%類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者的RF呈陽(yáng)性。 2.某些自身免疫病，如冷球蛋白血癥、進(jìn)行性全身性硬化癥、干燥綜合征、SLE等。 3.一些其他疾病如血管炎、肝病、慢性感染也可出現(xiàn)RF。 類(lèi)風(fēng)濕因子（rheumatoid factor,

22、RF） 第五十一張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）原理：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。 使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān) 。第五十二張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月ELISA主要有以下幾種類(lèi)型：1.雙抗體夾心法測(cè)抗原（常用）2.雙抗原夾心法測(cè)抗體3.間接法測(cè)抗體（常用）4.競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原5.競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體6.捕獲包被法測(cè)抗體7

23、.親和素-生物素 ELISA法第五十三張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月包被特異性抗體加入待測(cè)樣品加酶標(biāo)特異性抗體底物顯色洗滌孵育洗滌孵育雙抗體夾心法測(cè)抗原第五十四張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第五十五張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月待測(cè)抗原須有兩個(gè)可以與抗體結(jié)合的部位，其一端與包被于固相載體上的抗體結(jié)合，另一端與酶標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合。此法適用于檢驗(yàn)各種二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。不能用于分子量小于5000的半抗原或小分子單價(jià)抗原的測(cè)定。第五十六張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月雙抗原夾心法測(cè)抗體反應(yīng)模

24、式與雙抗體夾心法類(lèi)似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋?zhuān)芍苯佑糜跍y(cè)定。乙肝標(biāo)志物中HBsAb的檢測(cè)常采用本法。關(guān)鍵在于根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同制備酶標(biāo)抗原。第五十七張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第五十八張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 間接法測(cè)抗體間接法是檢測(cè)抗體最常用的方法。原理：利用酶標(biāo)記的抗體檢測(cè)已與固相結(jié)合的 受檢抗體，故稱(chēng)為間接法。第五十九張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月操作步驟： （1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相 抗原，洗滌。 （2）加稀釋的受檢樣本，其中的特異抗體與固 相抗原結(jié)合，形成固相抗原

25、抗體復(fù)合物，孵育洗滌。（3）加酶標(biāo)抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶，孵育洗滌。 （4）加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。 第六十張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月間接法的特點(diǎn)本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗體檢測(cè)相應(yīng)抗體。間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì)。若抗原中含有無(wú)關(guān)蛋白，也會(huì)因竟?fàn)幬蕉绊懓恍Ч５诹粡?，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原第六十二張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 操作步驟 ：（1

26、）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗 體洗滌。（2）待測(cè)管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的 混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng)，孵育洗 滌。 （3）加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原 最多，故顏色最深。待測(cè)管顏色越淡，表示標(biāo) 本中抗原含量越多。參考管顏色深度與待測(cè)管 顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本抗原的量。第六十三張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽(yáng)性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。 第六十四張，PPT共一

27、百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月捕獲包被法測(cè)抗體樣品中針對(duì)某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在，后者會(huì)干擾IgM抗體的測(cè)定。因此測(cè)定IgM抗本多用捕獲法。先將所有樣品IgM（包括特異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再測(cè)定特異性IgM。第六十五張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 操作步驟： （1）將抗IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗 IgM，洗滌。 （2）加入稀釋的待測(cè)標(biāo)本：孵育后樣品中的IgM抗體被、 固相抗體捕獲，洗滌。 （3）加入特異性抗原試劑：其僅與固相上的特異性IgM 結(jié)合，洗滌。 （4）加入針對(duì)抗原的酶標(biāo)抗體：使之與結(jié)合在固相上 的抗原反

28、應(yīng)結(jié)合，洗滌。 （5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示標(biāo)本中存在、 特異性IgM抗體，是為陽(yáng)性反應(yīng)。 第六十六張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第六十七張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月親和素-生物素-ELISA法親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。每個(gè)分子由4個(gè)亞基組成，可以和4個(gè)生物素分子親密結(jié)合。生物素（biotin）又稱(chēng)維生素H，存在于蛋黃中?？膳c蛋白質(zhì)、糖類(lèi)和酶等多種類(lèi)型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和力大，形成一種極為穩(wěn)定的復(fù)合體。把親和素和生物素與ELISA偶聯(lián)起來(lái)，就可大大提高ELISA的敏感度。 第六十八

29、張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第六十九張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月乙型肝炎血清學(xué)檢驗(yàn)臨床意義 乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（HBV）引起的、以肝臟炎性病變?yōu)橹鳎⒖梢鸲嗥鞴贀p害的一種疾病。乙肝廣泛流行于世界各國(guó)，主要侵犯兒童及青壯年，少數(shù)患者可轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌。傳播途徑：血液傳播、性接觸傳播和母嬰傳播第七十張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月HBV的抗原有3種：表面抗原（HBsAg）、核心抗原（HBcAg）和e抗原（HBeAg）。表面抗原大量存在于感染者血液中，是HBV感染以及檢測(cè)的主要標(biāo)志。核心抗原是乙肝病毒核心顆粒的唯一結(jié)構(gòu)蛋白。由于它存在于Dane

30、顆粒核心結(jié)構(gòu)表面，被表面抗原覆蓋，故不易在血循環(huán)中檢出。可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗-HBc。e抗原為可溶性蛋白質(zhì)，在病理上認(rèn)為是HBV復(fù)制以具有強(qiáng)感染性的一個(gè)指標(biāo)?？?HBe的出現(xiàn)，是預(yù)后良好的征象。第七十一張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月HBsAg抗-HBsHBeAg抗HBe抗-HBc臨床意義過(guò)去和現(xiàn)在均未感染HBV 曾感染HBV，急性感染恢復(fù)期 過(guò)去和現(xiàn)在均已感染過(guò)HBV 預(yù)防注射疫苗 既往感染；急性HBV感染恢復(fù)期 既往感染；急性HBV感染已恢復(fù) 急性HBV感染；慢性HBsAg攜帶者 第七十二張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月HBsAg抗-HBsHBeAg抗HBe抗-HBc臨

31、床意義急性HBV感染趨向恢復(fù)；慢性HBsAg攜帶者，傳染性弱；長(zhǎng)期持續(xù)易癌變 急性或慢性乙肝，傳染性極強(qiáng) 急性HBV感染早期，HBsAg攜帶者 急性HBV感染早期，傳染性強(qiáng) 急性感染中期 急性感染趨向恢復(fù)；慢性攜帶者 急性感染趨向恢復(fù) 急性感染趨向恢復(fù) 第七十三張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月艾滋病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn) 艾滋病是一種危害性極大的傳染病，由感染艾滋病病毒（HIV病毒）引起。HIV是一種能攻擊人體免疫系統(tǒng)的病毒。它把人體免疫系統(tǒng)中最重要的T淋巴細(xì)胞作為主要攻擊目標(biāo)，大量破壞該細(xì)胞，使人體喪失免疫功能， HIV在人體內(nèi)的潛伏期平均為89年 。第七十四張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2

32、022年6月艾滋病從感染到發(fā)病的一般過(guò)程感染分期臨床分期維持時(shí)間感染標(biāo)志物傳染性原發(fā)感染潛伏期潛伏期2-4周 抗體陰性 (窗口期)傳染危險(xiǎn)性高原發(fā)感染癥狀期急性HIV感染1-2周 傳染危險(xiǎn)性高慢性感染潛伏期無(wú)癥狀HIV感染215年(平均 8-10 年)抗體陽(yáng)性有傳染性臨床發(fā)病期艾滋病03年(平均 1-2 年)抗體陽(yáng)性抗原陽(yáng)性傳染性強(qiáng)第七十五張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月艾滋病檢測(cè)的方法檢驗(yàn)標(biāo)志物檢驗(yàn)?zāi)康臋z 驗(yàn) 方 法HIV(1+2) 抗體篩查試驗(yàn)金標(biāo)法、硒標(biāo)法 快速診斷試驗(yàn)明膠顆粒凝集試驗(yàn)(PA) 微孔板法酶聯(lián)免疫試驗(yàn)（ELISA） 第三代：雙抗原夾心法 第四代：增加檢測(cè)P24抗

33、原確證試驗(yàn)免疫印跡法(WB) 手工/儀器第七十六張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月HIV抗體篩查試驗(yàn)第七十七張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月明膠顆粒凝集試驗(yàn)的操作和結(jié)果判斷第七十八張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月5 450/630nm下測(cè)定OD值混勻，加蓋，37溫育 洗板3 加入底物第二次特異性結(jié)合4 加入終止液1 加入樣品 洗板2 加入酶標(biāo)記物 加蓋，37溫育加蓋，37溫育第一次特異性結(jié)合酶聯(lián)免疫分析 ELISA（雙抗原夾心、兩步法）第七十九張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月HIV抗體檢測(cè)結(jié)果處理規(guī)范檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果檢驗(yàn)報(bào)告處理篩查試驗(yàn)陰性HIV抗

34、體陰性陰性告知陽(yáng)性HIV抗體待復(fù)查上送確證確證試驗(yàn)陰性HIV抗體陰性（-）陰性告知陽(yáng)性HIV抗體陽(yáng)性（+）陽(yáng)性告知，個(gè)案調(diào)查不確定HIV抗體不確定（）告知，3個(gè)月后復(fù)查共2次第八十張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月樣品初篩檢測(cè)陽(yáng)性反應(yīng)陰性反應(yīng)篩查試劑復(fù)查原有試劑加另一種篩選試劑均陽(yáng)性反應(yīng)一陰一陽(yáng)均陰性反應(yīng)送確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)報(bào)告陰性第八十一張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月HIV抗體確證試驗(yàn) Western Blot 免疫印跡法 針對(duì)各種病毒蛋白的特異抗體 區(qū)分ELISA真陽(yáng)性與假陽(yáng)性 檢測(cè)HIV-1和HIV-2第八十二張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月全自動(dòng)免疫印跡

35、儀第八十三張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的臨床應(yīng)用腫瘤標(biāo)志物的定義 腫瘤標(biāo)志物（tumor marker，TM）是指在腫瘤的發(fā)生和增殖過(guò)程中，由腫瘤細(xì)胞本身所產(chǎn)生的或者是由機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞反應(yīng)而產(chǎn)生的，反映腫瘤存在和生長(zhǎng)的一類(lèi)物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、激素、酶（同工酶）、多胺等?？稍谀[瘤患者血液或體液中檢測(cè)到腫瘤標(biāo)志物。第八十四張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月腫瘤標(biāo)志物的分類(lèi)癌胚抗原類(lèi)標(biāo)志物 糖類(lèi)抗原標(biāo)記物酶類(lèi)標(biāo)志物激素類(lèi)標(biāo)志物蛋白類(lèi)標(biāo)志物第八十五張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月胚胎抗原類(lèi)標(biāo)志物1、甲胎蛋白AFP 胎兒發(fā)育早期，由肝臟和卵黃囊合成的一種

36、血清糖蛋白，電泳時(shí)位于白蛋白和1球蛋白之間，胎兒出生后不久即逐漸消失。成人血清中含量甚微。 參考值： AFP300ng/mL，但也有18%的病人AFP并不升高。（2）良性肝病，如病毒性肝炎、肝硬化患者AFP濃度有不同程度的升高，但其水平通常低于100ng/mL。 其升高原因主要是由于受損傷的肝細(xì)胞再生而形成幼稚化細(xì)胞，幼稚化的肝細(xì)胞具有產(chǎn)生AFP的能力。但隨著受損肝細(xì)胞的修復(fù)，AFP逐漸恢復(fù)正常。（3）生殖腺胚胎性腫瘤患者血清中AFP濃度可見(jiàn)升高。（4）婦女妊娠3個(gè)月后，血清AFP濃度開(kāi)始升高，78個(gè)月時(shí)達(dá)到高峰，一般在400g/L以下，分娩后3周恢復(fù)正常。若孕婦血清中AFP異常升高，應(yīng)考慮胎

37、兒神經(jīng)管缺損畸形的可能性。第八十七張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、癌胚抗原CEA 是一種可溶性糖蛋白，胚胎期主要存在于胎兒的胃腸管、胰腺和肝臟。胃腸道惡性腫瘤時(shí)可見(jiàn)血清CEA升高，在乳腺癌、肺癌及其他惡性腫瘤中也可出現(xiàn)表達(dá)，并分泌于體液中。 參考值： CEA5ug/L （ELISA） 第八十八張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1）血清CEA升高主要見(jiàn)于結(jié)腸癌、直腸癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌，其他惡性腫瘤也有不同程度的陽(yáng)性率。（2）隨著臨床應(yīng)用的發(fā)展，CEA變得越來(lái)越廣譜。主要用于連續(xù)的隨訪(fǎng)檢測(cè)，可用于惡性腫瘤手術(shù)后的療效觀(guān)察及預(yù)后判斷，也可用于對(duì)化療病人的

38、療效觀(guān)察。（3）某些良性疾病，如直腸息肉、結(jié)腸炎、肝硬化、肝炎和肺部疾病也有不同程度的升高，但陽(yáng)性率較低。（4）98%的非吸煙者CEA5ng/mL 臨床意義第八十九張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月糖類(lèi)抗原腫瘤標(biāo)志物1、糖類(lèi)抗原12-5（CA12-5）是卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌的腫瘤標(biāo)志物分子量為20萬(wàn)的糖蛋白可被單克隆抗體OC125所識(shí)別在卵巢腫瘤上皮和Mullerian副腎管來(lái) 源的病理和正常組織中表達(dá)，其生物學(xué)功能不明。 參考值： CA12-53.5萬(wàn)U/L （ELISA） 第九十張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1）卵巢癌病人血清中CA125水平明顯升高。手術(shù)和化療后期

39、水平很快下降。當(dāng)復(fù)發(fā)時(shí)，在臨床確診前幾個(gè)月便可呈現(xiàn)CA125增高，尤其卵巢癌轉(zhuǎn)移患者的血清CA125更明顯高于正常參考值。（2）其他非卵巢惡性腫瘤也有一定陽(yáng)性率，如乳腺癌40%，胰腺癌50%，胃癌47%，肺癌41.4%，結(jié)腸直腸癌34.2%，其他婦科腫瘤43%。（3）非惡性腫瘤，如子宮內(nèi)膜異位癥、盆腔炎、卵巢囊腫、胰腺炎、肝炎、肝硬化等疾病也有不同程度升高，但陽(yáng)性率較低，診斷時(shí)應(yīng)注意鑒別。（4）在許多良性和惡性胸腹水中發(fā)現(xiàn)有CA125升高，羊水中也能檢出較高濃度的CA125。（5）早期妊娠的頭3個(gè)月內(nèi)，也有CA125升高的可能。 臨床意義第九十一張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、

40、 糖類(lèi)抗原15-3（CA15 -3） CA15-3是乳腺癌的最重要的特異性標(biāo)志物。30%-50%的乳腺癌患者的CA15-3明顯升高，是乳腺癌患者診斷和監(jiān)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)、觀(guān)察療效的最佳指標(biāo)。 參考值： CA12-52.5萬(wàn)U/L （ELISA）第九十二張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1）乳腺癌患者常有CA15-3升高，但在乳腺癌的初期敏感性較低，約為60%，轉(zhuǎn)移性乳腺癌陽(yáng)性率可達(dá)80%。CA15-3可以作為原發(fā)性乳腺癌的輔助診斷指標(biāo)，也可以作為手術(shù)后隨訪(fǎng)，監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。（2）其他惡性腫瘤，如肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、原發(fā)性肝癌等也有不同程度的陽(yáng)性率。（3

41、）肝臟、胃腸道、肺、乳腺、卵巢等非惡性腫瘤疾病，陽(yáng)性率一般低于10%。 臨床意義第九十三張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3、糖類(lèi)抗原19-9（CA19-9） CA19-9是胰腺、胃、膽囊和腸癌的標(biāo)記物。 參考值： CA19-93.7萬(wàn)U/L （ELISA）第九十四張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1）胰腺癌、膽囊癌、膽管壺腹癌患者血清CA19-9水平明顯升高，尤其是胰腺癌晚期病人，血清CA19-9濃度可達(dá)40萬(wàn)U/mL，陽(yáng)性率約為74.9%，是重要的輔助診斷指標(biāo)。（2）胃癌陽(yáng)性率約為50%，結(jié)腸癌陽(yáng)性率約為60%，肝癌陽(yáng)性率約為64.6%。（3）急性胰腺炎、膽囊炎、膽汁

42、淤積性膽管炎、肝硬化、肝炎等疾病，CA19-9也有不同程度的升高，應(yīng)注意鑒別。 臨床意義第九十五張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月酶類(lèi)腫瘤標(biāo)志物前列腺特異性抗原（PSA）PSA是前列腺的特異性標(biāo)記物 屬于器官特異性抗原，不具備腫瘤特異性 PSA屬于酶類(lèi)腫瘤標(biāo)記物，具有糜蛋白酶樣和胰蛋 酶的活性 PSA在正常男性含量小于4g/L 參考值： 血清t-PSA4.0ug/L （ELISA） f-PSA0.2第九十六張，PPT共一百零五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1）PSA是前列腺癌標(biāo)志物。隨著年齡的增大，血清PSA會(huì)逐漸增加。（2）前列腺肥大、前列腺炎、腎脹和泌尿生殖系統(tǒng)的疾病患者，也可見(jiàn)t-PSA和f-PSA水平輕度升高，必須結(jié)合其他檢查進(jìn)行鑒別。（3）單獨(dú)使用t-PSA和f-PSA升高來(lái)診斷前列腺癌時(shí)很難排除前列腺肥大對(duì)前列腺癌診斷的影響，特別是當(dāng)t-PSA在5ng/mL20ng/mL時(shí)。此時(shí)應(yīng)