亞基的拆離、肽鏈降解和肽段的分離

1、亞基的拆離、肽鏈降解和肽段的分離從蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定和聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果，可以知道蛋白質(zhì)是否由多亞基組成。若末端分析只有單一的結(jié)果，說(shuō)明分子由相同亞基組成，無(wú)需將亞基拆開(kāi)、分離。反之，分子若有兩種以上不同亞基組成，首先要將不同亞基之間的連接拆開(kāi)，并進(jìn)行分離提純。提純后的亞基肽鏈一般都是相對(duì)分子質(zhì)量也比較大，需要將大的肽鏈降解成小的肽段，并將肽段提純，然后才能正式開(kāi)始順序測(cè)序工作。一、亞基拆離和二硫鍵斷裂蛋白質(zhì)由一條以上的肽鏈組成時(shí)，肽鏈間的結(jié)合可能是靠非共價(jià)鍵結(jié)合，也可能是靠共價(jià)鍵結(jié)合。在進(jìn)行肽鏈順序分析時(shí)，首先要將它們分離開(kāi)來(lái)。若多亞基間以非共價(jià)鍵連接，在溫和條件下即可以拆離亞基

2、，如改變?nèi)芤?，將降低到或升高到；或者加入變性劑，如尿素或鹽酸胍等。例如：血紅蛋白經(jīng)脲處理后，及鏈可以得到分離；核酮糖二磷酸羧化酶在巰基乙醇即溶液中保溫小時(shí)，大小亞基便相互分開(kāi)。拆離后的亞基可以用凝膠過(guò)濾方法進(jìn)行分離?？抗矁r(jià)鍵結(jié)合的因此比較牢固須用特殊的化學(xué)作用使其破壞。最常見(jiàn)的是半胱氨酸殘基經(jīng)氧化作用而形成胱氨酸殘基，即二硫鍵結(jié)構(gòu)。1、過(guò)甲酸氧化法優(yōu)點(diǎn)：能將巰基和二硫鍵同時(shí)氧化成磺酸基，生成的磺酸基很穩(wěn)定，肽鏈不再重新形成二硫鍵，便于肽鏈分離。缺點(diǎn)：氧化過(guò)程中，同時(shí)將蛋黃酸的側(cè)鏈氧化成亞砜，色氨酸的側(cè)鏈也遭破壞。2、還原法一般可使用過(guò)量巰基化合物，如巰基乙醇。在室溫或條件下放置數(shù)小時(shí)，即可使二

3、硫鍵還原成巰基。加入尿素或鹽酸胍使蛋白質(zhì)變性。在這種情況下，還原劑才能有效地作用于暴露的二硫鍵。二硫鍵還原后，需要用巰基保護(hù)試劑，如碘乙酸，以防止其重新被氧化。二、肽鏈的部分降解由于氨基酸順序測(cè)定多數(shù)采用降解法，它一次能分析肽鏈長(zhǎng)度約1余0個(gè)氨基酸殘基，所以分離得到的肽鏈如果太長(zhǎng)，須將長(zhǎng)的肽鏈斷裂成易分析的較短的肽鏈。肽鏈部分降解的方法要求選擇性強(qiáng)、裂解點(diǎn)少、反應(yīng)率高，一般采用化學(xué)裂解和酶解法。1、化學(xué)裂解法與肽鏈中側(cè)鏈的硫醚基發(fā)生反應(yīng)，生成環(huán)化的溴化亞氨內(nèi)酯，此產(chǎn)物水解后，產(chǎn)生高絲氨酸內(nèi)酯，使羧基端的肽鍵斷裂。所以它只專一性切斷肽鏈中由殘基的羧基參加形成的肽鍵。由于大多數(shù)只含有很少的，因此裂

4、解產(chǎn)生的肽段不多。這些肽段可以用胰蛋白酶處理使成更小的肽段。斷裂反應(yīng)在70甲酸中進(jìn)行，這樣可以使卷曲的多肽鏈松散開(kāi)來(lái)，以便暴露側(cè)鏈，有利于和發(fā)生作用。優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)率高（可達(dá)85）%，專一性強(qiáng)，切點(diǎn)少，故實(shí)際應(yīng)用較多；缺點(diǎn)：多為大肽段。2、酶解法酶解法相對(duì)化學(xué)裂解法而言，有許多優(yōu)點(diǎn)，如專一性強(qiáng)、裂解條件溫和、副反應(yīng)少等，再則蛋白水解酶對(duì)肽鍵的水解率很高，且不同蛋白水解酶對(duì)不同氨基酸形成的肽鍵水解專一性不同，故作用位點(diǎn)不同，水解所得片段大小也不一樣，因此酶解法被廣泛用于的部分水解。酶有內(nèi)切酶和外切酶，常用的內(nèi)切酶有胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶等；而外切酶主要是羧肽酶和氨肽酶，它們分別從肽

5、鏈羧基端和氨基端水解。幾種常用蛋白水解酶的作用位點(diǎn)蛋白水解酶主要作用位點(diǎn)胰蛋白酶y等堿性氨基酸的羧基端胰凝乳蛋白芳香族氨基酸的羧基端胃蛋白酶、等氨基酸的羧基端梭菌蛋白酶的羧基端蛋白酶、等酸性氨基酸的羧基端內(nèi)肽酶的羧基端3、羥胺裂解法羥胺()在下能專一性地?cái)嗔阎g肽鍵，也能部分裂解及鍵，故專一性不是很強(qiáng)。在酸性條件下可以斷裂間的肽鍵，產(chǎn)率可達(dá)。4、部分酸水解一般認(rèn)為酸水解沒(méi)有什么專一性而被忽視，后來(lái)發(fā)現(xiàn)部分酸水解還是有一定的專一性。在稀酸的條件下，也即在高濃度胍的甲酸中().可裂解間的肽鍵，產(chǎn)率高達(dá)。在濃酸條件下，含羥基氨基酸氨基端肽鍵容易斷裂。但是終究部分酸水解的專一性差，副反應(yīng)多，此法比較難掌握。三、肽鏈的分離提純肽鏈經(jīng)部分裂解得到肽片段必須分離提純，才能進(jìn)一步測(cè)定其氨基酸順序。先采用凝膠過(guò)濾，得到