大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

1、關(guān)于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)第一張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征 大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì) 全基因組測(cè)序，共有4405個(gè)開(kāi)放型閱讀框架 基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善 繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定 被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物第二張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征 大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢(shì) 缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能 缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng) 內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白 細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素第三張，PPT

2、共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理 啟動(dòng)子 終止子 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 密碼子 質(zhì)?？截悢?shù)轉(zhuǎn)錄翻譯第四張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月P tac = 3 P trp = 11 P lac啟動(dòng)子第五張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理 具有多順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)，基因排列次序?yàn)椋?啟動(dòng)子（lacP）- 操縱基因（lacO） - 結(jié)構(gòu)基因（lacZ-lacY-lacA） 正調(diào)節(jié)因子 CAP 負(fù)調(diào)節(jié)因子 lac I 啟動(dòng)子Lac 表達(dá)系統(tǒng) 以大腸桿菌 lac 操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)、構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng) 第六張，PPT共八十六頁(yè)，

3、創(chuàng)作于2022年6月 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA高效轉(zhuǎn)錄cAMPCAP lacI Plac lacO lacZ lacY lacARNA聚合酶基底水平轉(zhuǎn)錄Lac 表達(dá)系統(tǒng) 正調(diào)節(jié)因子 CAP cAMP激活CAP，CAPcAMP復(fù)合物與 lac 操縱子上專一位點(diǎn)結(jié)合 后，能促進(jìn) RNA 聚合酶與 35、10 序列的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn) Plac 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶RNA聚合酶基因工程中使用的 lac 啟動(dòng)子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即 Plac UV5 cAMP葡萄糖代謝cAMP濃度降低cAMPCAPCAP第七張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Lac

4、表達(dá)系統(tǒng) lac UV5 突變體 Plac UV5 突變體能夠在沒(méi)有 CAP 存在的情形下非常有效的起始 轉(zhuǎn)錄，受它控制的基因在轉(zhuǎn)錄水平上只受 lacI 的調(diào)控，因此用它 構(gòu)建的表達(dá)載體在使用時(shí)比野生型 Plac 更易操作。第八張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Lac 表達(dá)系統(tǒng) 負(fù)調(diào)節(jié)因子 lac I 在無(wú)誘導(dǎo)物情形下， lacI 基因產(chǎn)物形成四聚體阻遏蛋白，與啟動(dòng) 子下游的操縱基因緊密結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄的起始。 lacI Plac lacO lacZ lacY lacARNA聚合酶基底水平轉(zhuǎn)錄 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA高效轉(zhuǎn)錄RNA聚合酶IPTGmRNA

5、第九張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Tac 表達(dá)系統(tǒng) tac 啟動(dòng)子是由 trp 的 35 序列和 lacUV5 的 10 序列拼接而成的雜 合啟動(dòng)子。 調(diào)控模式與 lacUV5 相似，但 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平更高于 trp 和 lacUV5 啟動(dòng)子（P tac = 3 P trp = 11 P lac），因此在要求有較高基因表達(dá) 水平的情況下，選用 tac 啟動(dòng)子比用 lacUV5 啟動(dòng)子更優(yōu)越。第十張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月lac、tac 啟動(dòng)子對(duì)宿主菌的要求 在普通大腸桿菌中， LacI 阻遏蛋白僅能滿足細(xì)胞染色體上 lac 操縱子 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的需要。 當(dāng)多拷貝的

6、lacO 隨著帶有 lacUV5、tac 啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入 大腸桿菌后，LacI 阻遏蛋白與 lacO 的比例顯著下降，無(wú)法保證每一 個(gè) lacO 都能獲得足夠的 LacI 阻遏蛋白參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。表現(xiàn)為在無(wú)誘 導(dǎo)物存在的情形下， lacUV5、tac 啟動(dòng)子有較高的本底轉(zhuǎn)錄。第十一張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月lac、tac 啟動(dòng)子對(duì)宿主菌的要求 為了使以 Lac、Tac 表達(dá)系統(tǒng)具有嚴(yán)緊調(diào)控外源基因轉(zhuǎn)錄的能力，一 種能產(chǎn)生過(guò)量的 LacI 阻遏蛋白的 lacI 基因的突變體 lacIq 被應(yīng)用于表 達(dá)系統(tǒng)。 大腸桿菌 JM109 等菌株的基因型均為 lacIq ，常被選用

7、為 Lac、Tac 表達(dá)系統(tǒng)的宿主菌。 但是這些菌株也只能對(duì)低拷貝的表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)嚴(yán)緊調(diào)控，在使用高拷 貝復(fù)制子構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，仍能觀察到較高水平的本底轉(zhuǎn)錄。 需在表達(dá)載體中插入 lacIq 基因以保證有較多的 LacI 阻遏蛋白產(chǎn)生。第十二張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月lac、tac 表達(dá)系統(tǒng)存在的問(wèn)題 IPTG 用于誘導(dǎo) lac、tac 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，但由于 IPTG 本身具有一定的 毒性。從安全角度，對(duì)表達(dá)和制備用于醫(yī)療目的的重組蛋白并不適合。 一些國(guó)家規(guī)定在生產(chǎn)人用重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)工藝中不能使用 IPTG 解決方法 lac 和 tac 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄受溫度嚴(yán)緊調(diào)控 乳糖替代 I

8、PTG 誘導(dǎo) lac 和 tac 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄第十三張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月lac、tac 表達(dá)系統(tǒng)存在的問(wèn)題 lac 和 tac 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄受溫度嚴(yán)緊調(diào)控 把阻遏蛋白 LacI 的溫度敏感突變體lacI(ts)、lacIq(ts)插入表達(dá)載體或 整合到染色體后，均能使 lac 和 tac 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄受到溫度嚴(yán)緊調(diào)控 在較低溫度（30）時(shí)抑制，在較高溫度（42）時(shí)開(kāi)放。 用乳糖替代 IPTG 誘導(dǎo) lac 和 tac 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄 乳糖在 b-半乳糖苷酶作用下生成異乳糖，異乳糖具有誘導(dǎo)劑的作用 這一過(guò)程涉及乳糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)化，其效率受到多種因素的影響和制約 因此乳糖誘導(dǎo)的有

9、效劑量大大高于IPTG。 乳糖本身作為一種碳源可以被大腸桿菌代謝利用，較多的乳糖存在也 會(huì)導(dǎo)致菌體生理及生長(zhǎng)特性變化。乳糖替代 lPTG 作為誘導(dǎo)劑的研究 要與發(fā)酵工藝結(jié)合起來(lái)，才能顯示其良好的前景。第十四張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理 色氨酸啟動(dòng)子 Ptrp 受色氨酸-阻遏蛋白復(fù)合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底 狀態(tài)。 在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA）， 便可有 效地解除阻遏抑制作用。 在正常的細(xì)菌培養(yǎng)體系中，除去色氨酸是困難的，因此基因工程中 往往添加 IAA 誘導(dǎo) Ptrp 介導(dǎo)的目的基因表達(dá)啟動(dòng)子Trp 表達(dá)系統(tǒng) 以大腸桿菌 trp 操縱子調(diào)控機(jī)理

10、為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)、構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng) 第十五張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Trp 表達(dá)系統(tǒng) Ptrp OtrpRNA聚合酶基底水平轉(zhuǎn)錄高效轉(zhuǎn)錄mRNA Ptrp Otrp去除色氨酸高效轉(zhuǎn)錄mRNA Ptrp Otrp加入IAARNA聚合酶RNA聚合酶第十六張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng) 以 l 噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子 PL 、 PR 為核心構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng) 在野生型 l 噬菌體中， PL 、 PR 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄與否決定了 l 噬菌體進(jìn)入 裂解循環(huán)還是溶源循環(huán)。啟動(dòng)子第十七張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 由 l

11、噬菌體 PE 啟動(dòng)子控制的 cI 基因的產(chǎn)物是 PL 、 PR 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的 阻遏物。cI 基因的產(chǎn)物在大腸桿菌宿主中的濃度取決于一系列宿主與 噬菌體因子之間的錯(cuò)綜復(fù)雜的平衡關(guān)系。由于通過(guò)細(xì)胞因子來(lái)控制cI 基因產(chǎn)物的產(chǎn)生和消失是相當(dāng)困難的。 因此 PL 、 PR 表達(dá)系統(tǒng)都選用溫度敏感突變體 cI 857(ts) 的基因產(chǎn)物 來(lái)調(diào)控 PL 、 PR 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。 在較低溫度（30）時(shí)以活性形式存在 在較高溫度（42）時(shí)失活脫落第十八張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng) 宿主菌中沒(méi)有 cI 基因產(chǎn)物，PL、PR 啟動(dòng)子的高強(qiáng)度直接轉(zhuǎn)錄，帶有PL 或 PR 啟動(dòng)子

12、的表達(dá)載體在普通大腸桿菌中相當(dāng)不穩(wěn)定。 對(duì)宿主菌的要求 用溶源化 l 噬菌體的大腸桿菌作 PL、PR 啟動(dòng)子表達(dá)載體的宿主菌 N4830-1，POP2136 等菌株已經(jīng)溶源化 cI 857(ts) l 噬菌體， 可用作表達(dá)外源基因時(shí)的宿主菌。 把 cI 857(ts) 基因組裝在表達(dá)載體上 宿主菌選擇范圍更大第十九張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng)存在的問(wèn)題 由于 PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)時(shí)不加化學(xué)誘導(dǎo)劑，成本又低廉，最初幾 個(gè)在大腸桿菌中制備的藥用重組蛋白質(zhì)都采用 PL 或 PR 表達(dá)系統(tǒng)。 缺陷 在熱脈沖誘導(dǎo)過(guò)程中，大腸桿菌熱休克蛋白的表達(dá)也會(huì)被激活，其

13、 中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表達(dá)的重組蛋白。 在大體積發(fā)酵培養(yǎng)菌體時(shí)，通過(guò)熱平衡交換方式把培養(yǎng)溫度從30 提高到 42 需要較長(zhǎng)的時(shí)間，這種緩慢的升溫方式影響誘導(dǎo)效 果，對(duì)重組蛋白表達(dá)量有一定的影響。第二十張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 T7 表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌 T7 噬菌體具有一套專一性非常強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄體系，利用這一 體系中的元件為基礎(chǔ)構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)稱為 T7 表達(dá)系統(tǒng)。第二十一張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 T7 表達(dá)系統(tǒng) T7 噬菌體基因 1 編碼的 T7 RNA 聚合酶選擇性的激活 T7 噬菌體啟 動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。 T7 RNA 聚合酶活性高，其合成 RNA 的速

14、度比大腸桿菌 RNA 聚合 酶快 5倍左右。并可以轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌 RNA聚合酶有效轉(zhuǎn) 錄的序列。 在細(xì)胞中存在 T7 RNA聚合酶和 T7噬茵體啟動(dòng)子的情形下，大腸桿 菌宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競(jìng)爭(zhēng)不過(guò) T7 噬菌體轉(zhuǎn)錄體系，最終受 T7噬 菌體啟動(dòng)子控制的基因的轉(zhuǎn)錄達(dá)到很高的水平。第二十二張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月T7 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 T7 噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄完全依賴于 T7 RNA 聚合酶，因此 T7 RNA 聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式就決定了表達(dá)系統(tǒng)的調(diào)控方式。 化學(xué)誘導(dǎo)型 溫度誘導(dǎo)型 雙質(zhì)粒系統(tǒng)T7 RNA 聚合酶T7 啟動(dòng)子 目的基因 T7 RNA 聚合酶基因？

15、啟動(dòng)子第二十三張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 T7 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 化學(xué)誘導(dǎo)型 噬菌體 DE3 是 l 噬菌體的衍生 株，一段含有 lacI、lacUV5 啟 動(dòng)子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中 用噬菌體 DE3 的溶源菌作為表 達(dá)載體的宿主菌，調(diào)控方式為 化學(xué)誘導(dǎo)型，類似于 Lac 表達(dá) 系統(tǒng)。 T7 RNA 聚合酶基因 lac 啟動(dòng)子E.Coli （DE3）T7 啟動(dòng)子 目的基因T7 RNA 聚合酶IPTG誘導(dǎo)第二十四張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 T7 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 溫度誘導(dǎo)型 PL 啟動(dòng)子控制 T7 R

16、NA 聚合 酶基因，通過(guò)熱誘導(dǎo)方式激發(fā) T7 噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。 這種方式可以使本底轉(zhuǎn)錄降到 很低的水平，尤其適用于表達(dá) 對(duì)大腸桿菌宿主有毒性的重組 蛋白質(zhì)。 T7 RNA 聚合酶基因 PL 啟動(dòng)子E.Coli （CE6）T7 啟動(dòng)子 目的基因T7 RNA 聚合酶熱誘導(dǎo)cI857第二十五張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 T7 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 雙質(zhì)粒系統(tǒng) 一個(gè)質(zhì)粒帶有 T7 RNA 聚合酶 基因，另一個(gè)質(zhì)粒帶有 T7 啟 動(dòng)子和目的基因 兩個(gè)質(zhì)粒的復(fù)制子和抗性標(biāo)記 不能相同 調(diào)控方式為控制 T7 RNA 聚合 酶的啟動(dòng)子調(diào)控類型T7 RNA 聚合酶熱誘導(dǎo)T7 啟動(dòng)子 目的基

17、因 T7 RNA 聚合酶基因 PL 啟動(dòng)子 cI857 p15A ori KanRColE1 ori AmpR第二十六張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月T7 表達(dá)系統(tǒng)存在的問(wèn)題 T7 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的基因的水平是目前所有表達(dá)系統(tǒng)中最高的，但 也不可避免出現(xiàn)在相對(duì)較高的本底轉(zhuǎn)錄，如果目的基因產(chǎn)物對(duì)大腸桿 菌宿主有毒性，會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。 解決辦法之一 在表達(dá)系統(tǒng)中低水平表達(dá) T7 溶菌酶基因。 因?yàn)?T7 溶菌酶除了作用于大腸桿菌細(xì)胞壁上肽聚糖外，還能與 T7 RNA 聚合酶結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄的活性。 目前 T7 溶菌酶基因都通過(guò)共轉(zhuǎn)化質(zhì)拉導(dǎo)入表達(dá)系統(tǒng)，它能明顯 降低本底轉(zhuǎn)錄，但對(duì)誘導(dǎo)后目的

18、基因的表達(dá)水平無(wú)明顯影響。 第二十七張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 營(yíng)養(yǎng)調(diào)控型 采用大腸桿菌堿性磷酸酯酶基因 phoA 啟動(dòng)子或甘油 3-磷酸轉(zhuǎn)移系 統(tǒng) ugp 啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體。 這兩個(gè)啟動(dòng)子受在培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)磷（Pi）濃度調(diào)控（Pi5mmol/L 時(shí)抑制，Pi1mmol/L 時(shí)激活)，具有較高的轉(zhuǎn)錄水平。其他表達(dá)系統(tǒng)第二十八張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 糖原調(diào)控型 采用的有大腸桿菌半乳糖轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（mglBAEC) mgl 啟動(dòng)子或沙門 氏菌阿拉伯糖基因 araB 啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體。 這兩個(gè)啟動(dòng)子受葡萄糖抑制，巖藻糖和阿拉伯糖是它們的誘導(dǎo)物。 其調(diào)控機(jī)理類似于

19、Lac 表達(dá)系統(tǒng).其他表達(dá)系統(tǒng)第二十九張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 pH調(diào)控型 采用大腸桿菌賴氨酸脫羧酶基因 cadA 啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體。 cadA 啟動(dòng)子受培養(yǎng)基中 H+ 濃度，即 pH 值調(diào)控。（在pH8 時(shí)抑 制，pH 6時(shí)激活，pH = 6時(shí)轉(zhuǎn)錄活力最高）。 該表達(dá)系統(tǒng)要求菌體發(fā)酵溫度控制在 27 30 之間才能使目的基 因得到穩(wěn)定的表達(dá).其他表達(dá)系統(tǒng)第三十張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月溶氧調(diào)控型 采用大腸桿菌丙酮酸甲酸裂解酶基因 pfl 啟動(dòng)子，硝基還原酶基 因nirB 啟動(dòng)子或透明顫菌血紅蛋白基因 vgb 啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載 體。這些啟動(dòng)子中都含有對(duì)氧響應(yīng)

20、的調(diào)節(jié)因子 fnr 的作用位點(diǎn)。 在富氧條件下轉(zhuǎn)錄被抑制，在貧氧或微氧條件下轉(zhuǎn)錄被激活。其他表達(dá)系統(tǒng)第三十一張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月溶氧調(diào)控型 大腸桿菌 GJ100 有透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）啟動(dòng)子控制下 的 T7 RNA 聚合酶基因表達(dá)質(zhì)粒， vgb 基因的轉(zhuǎn)錄是受環(huán)境溶氧 濃度調(diào)控的，在貧氧條件下 vgb 基因的啟動(dòng)子被激活。 因此，用大腸桿菌GJ100 作為宿主時(shí)，表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控方式為貧氧 誘導(dǎo)型， 菌體發(fā)酵時(shí)的溶氧濃度可以通過(guò)控制攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量 加以調(diào)節(jié)，與其他調(diào)控模式相比更適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程。其他表達(dá)系統(tǒng)第三十二張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月生物

21、素調(diào)控型 用大腸桿菌生物素操縱子及其調(diào)控區(qū)構(gòu)建表達(dá)載體，菌體生長(zhǎng)過(guò)程 中生物素會(huì)不斷消耗，當(dāng)濃度到達(dá) 2ng/ml 以下時(shí)啟動(dòng)子被激活。 能夠在沒(méi)有外界的物理，化學(xué)信號(hào)的介入條件下自動(dòng)誘導(dǎo)表達(dá)目的 基因是這類表達(dá)載體的特點(diǎn)，其缺陷是不容易精確控制自動(dòng)誘導(dǎo)的 時(shí)刻。其他表達(dá)系統(tǒng)第三十三張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止的必要性 外源基因在強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過(guò)頭現(xiàn)象，即 RNA 聚合酶滑過(guò)終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的 DNA 序列，形成長(zhǎng)短不一的 mRNA 混合物過(guò)長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會(huì)影響外源基因的表達(dá)，其原因如下： 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長(zhǎng)，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分

22、子 mRNA 所需的時(shí)間就相應(yīng)增加，外源基 因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降； 如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或 DNA功能區(qū)域，如選擇性標(biāo) 記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等，則 RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其 它生物功能，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性； 過(guò)長(zhǎng)的 mRNA 往往會(huì)產(chǎn)生大量無(wú)用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無(wú)謂的能量消耗； 更為嚴(yán)重的是，過(guò)長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級(jí)結(jié)構(gòu)， 從而大大降低外 源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率終止子第三十四張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月強(qiáng)終止子的選擇與使用 目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來(lái)自大腸桿菌 rRNA 操縱子上 的 rrnT1T2 以及

23、 T7 噬菌體 DNA 上的 Tf。 對(duì)于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特 殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用終止子第三十五張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月核糖體結(jié)合位點(diǎn) 外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的頻 率，而且在很大程度上還與 mRNA 的翻譯起始效率密切相關(guān)。 大腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不同的 mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時(shí)可高達(dá)數(shù)百倍。 mRNA 翻譯的起始效率主要由其 5 端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS） 核糖體結(jié)合位點(diǎn)第三十六張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十七張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作

24、于2022年6月核糖體結(jié)合位點(diǎn) 大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括下列四個(gè)特征結(jié)構(gòu)要素： 位于翻譯起始密碼子上游的 68 個(gè)核苷酸序列 5 UAAGGAGG 3 即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過(guò)識(shí)別大腸桿菌核糖體小亞 基中的 16S rRNA 3 端區(qū)域 3 AUUCCUCC 5 并與之專一性結(jié)合 將mRNA 定位于核糖體上，從而啟動(dòng)翻譯； 翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以 AUG作為閱讀框架的 起始位點(diǎn)，有些基因也使用 GUG 或 UUG 作為翻譯起始密碼子 SD 序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成 基因編碼區(qū) 5 端若干密碼子的堿基序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)第三十八張，PPT

25、共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響 SD 序列的影響 一般來(lái)說(shuō)，mRNA 與核糖體的結(jié)合程度越強(qiáng)，翻譯的起始效率就 越高，而這種結(jié)合程度主要取決于 SD （ UAAGGAGG）序列與 16S rRNA 的堿基互補(bǔ)性，其中以 GGAG 四個(gè)堿基序列尤為重要。 對(duì)多數(shù)基因而言，上述四個(gè)堿基中任何一個(gè)換成 C 或 T，均會(huì)導(dǎo) 致翻譯效率大幅度降低核糖體結(jié)合位點(diǎn)第三十九張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響 SD 序列與起始密碼子之間的序列的影響 SD 序列下游的堿基若為 AAAA 或 UUUU，翻譯效率最高；而 CCCC 或 GG

26、GG 的翻譯效率則分別是最高值的 50% 和 25%。 緊鄰 AUG 的前三個(gè)堿基成份對(duì)翻譯起始也有影響。 對(duì)于大腸桿菌 b-半乳糖苷酶的 mRNA 而言，在這個(gè)位置上最佳 的堿基組合是 UAU 或 CUU，如果用 UUC、UCA 或 AGG 取代 之，則酶的表達(dá)水平低 20 倍核糖體結(jié)合位點(diǎn)第四十張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響 SD 序列與起始密碼子之間的距離的影響 SD 序列與起始密碼子 AUG 之間的精確距離保證了 mRNA 在 核糖體上定位后，翻譯起始密碼子 AUG 正好處于核糖體復(fù)合物 結(jié)構(gòu)中的 P 位，這是翻譯啟動(dòng)的前提條件。 在很多情

27、況下，SD 序列位于 AUG 之前大約七個(gè)堿基處，在此 間隔中少一個(gè)堿基或多一個(gè)堿基， 均會(huì)導(dǎo)致翻譯起始效率不同 程度的降低核糖體結(jié)合位點(diǎn)第四十一張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響 起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響 大腸桿菌中的起始 tRNA 分子可以同時(shí)識(shí)別 AUG、GUG 和 UUG 三種起始密碼子，但其識(shí)別頻率并不相同，通常 GUG 為 AUG 的 50%，而 UUG 只及 AUG 的 25%。 除此之外，從 AUG 開(kāi)始的前幾個(gè)密碼子堿基序列也至關(guān)重要，至 少這一序列不能與 mRNA 的 5 端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則便 會(huì)嚴(yán)重干擾 mRN

28、A 在核糖體上的準(zhǔn)確定位 目前廣泛用于外源基因表達(dá)的大腸桿菌表達(dá)型質(zhì)粒上，均含有與 啟動(dòng)子來(lái)源相同的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列，序列和間隔是最佳的。核糖體結(jié)合位點(diǎn)第四十二張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對(duì)簡(jiǎn)并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛(ài)性，其決定因素是：生物基因組中的堿基含量 在富含 AT 的生物（如單鏈 DNA噬菌體X174）基因組中，密碼子 第三位上的 U 和 A 出現(xiàn)的頻率較高； 在 GC 豐富的生物（如鏈霉菌）基因組中，第三位上含有 G 或 C 的 簡(jiǎn)并密碼子占 90% 以上的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)密碼子與反密碼子相互作用的自由能 性中等強(qiáng)

29、度規(guī)律 如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU 等使用少 如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG 等使用多細(xì)胞內(nèi) tRNA 的含量密碼子生物體對(duì)密碼子的偏愛(ài)性第四十三張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月密碼子密碼子偏愛(ài)性對(duì)外源基因表達(dá)的影響 由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程大的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動(dòng)物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個(gè)重要因素是密碼子的正確選擇。 一般而言，有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細(xì)胞中獲得最佳表達(dá)： 外源基因全合成 同步表達(dá)相關(guān) tRNA 編碼基因第四十四張，PPT

30、共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的影響 目前實(shí)驗(yàn)室里廣泛使用的表達(dá)型質(zhì)粒在每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中可達(dá)數(shù)百甚至上千個(gè)拷貝，質(zhì)粒的擴(kuò)增過(guò)程通常發(fā)生在受體細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，而此時(shí)正是細(xì)菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過(guò)度增殖以及其后目的基因的高效表達(dá)勢(shì)必會(huì)影響受體細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達(dá)水平的下降 解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴(kuò)增納入可控制的軌道第四十五張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)蛋白質(zhì)的合成是在細(xì)胞之中進(jìn)行的 目標(biāo)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的主要優(yōu)點(diǎn)是： 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建比較簡(jiǎn)單；

31、能夠達(dá)到很高的目標(biāo)蛋白表達(dá)量，一般可以達(dá)到占細(xì)胞總蛋白的 20%40%。 目標(biāo)蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的形式有二種： 在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為不溶性的包涵體顆粒 包涵體存在于大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中 在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì) 可溶性的目標(biāo)蛋白質(zhì)除可存在于細(xì)胞質(zhì)中外，還可借助于本身的 功能序列和大腸桿菌蛋白質(zhì)加工、運(yùn)輸體系，最終分泌到周質(zhì)空 間，或外泌到培養(yǎng)液中。第四十六張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 分泌型異源蛋白的表達(dá) 融合型異源蛋白的表達(dá) 寡聚型異源蛋白的表達(dá) 整合型異源蛋白的表達(dá) 蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)第

32、四十七張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月包涵體及其性質(zhì) 在某些生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無(wú)膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（Inclusion Bodies，IB）。 富含蛋白質(zhì)的包涵體多見(jiàn)于生長(zhǎng)在含有氨基酸類似物培養(yǎng)基的大腸桿菌細(xì)胞中，由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質(zhì)往往會(huì)喪失其理化特性和生物功能，從而集聚形成包涵體。 由高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì)，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。 除此之外，包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子包涵體型異源

33、蛋白的表達(dá)第四十八張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn) 包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn) 在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 能夠避免細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利于目標(biāo)蛋白的富集 簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作 包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，菌 體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過(guò)高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì) 菌裂解物中分離出來(lái) 能夠表達(dá)對(duì)大腸桿菌宿主有毒或有致死效應(yīng)的目標(biāo)蛋白。包涵體型異源蛋白的表達(dá)第四十九張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn) 包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn) 以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，

34、必須通過(guò) 有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具 有生物活性）的目標(biāo)蛋白，因此包涵體變復(fù)性操作的效率對(duì)目標(biāo) 產(chǎn)物的收率至關(guān)重要。 經(jīng)過(guò)復(fù)性處理的目標(biāo)蛋白不一定能完全恢復(fù)原來(lái)的生物學(xué)活性， 有時(shí)甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的 Cys殘基數(shù)目較高時(shí)，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)停?一般不 超過(guò) 30% 復(fù)性處理工藝可使目標(biāo)蛋白的制備成本上升。包涵體型異源蛋白的表達(dá)第五十張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月包涵體的變性與復(fù)性操作 包涵體的溶解與變性 包涵體的溶解與變性的主要任務(wù)是拆開(kāi)錯(cuò)配的二硫鍵和次級(jí)鍵。在 人工條件下，使包涵體溶解并重新進(jìn)入復(fù)性途徑中。

35、 能有效促進(jìn)包涵體溶解變性的試劑和條件包括： 清 洗 劑 SDS、正十二醇肌氨酸，廉價(jià)， 但影響復(fù)性和純化 促 溶 劑 鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素便宜， 但常被自發(fā) 形成的氰酸鹽污染， 后者能與多肽鏈中的氨基反應(yīng) 混合溶劑 如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用， 溶解力增強(qiáng) 極 端 pH 廉價(jià)，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng)包涵體型異源蛋白的表達(dá)第五十一張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月包涵體的變性與復(fù)性操作 包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding） 包涵體的復(fù)性與重折疊的主要任務(wù)： 將多肽鏈中被拆開(kāi)的游離巰基重新折疊 通過(guò)次級(jí)鍵的形成使蛋白質(zhì)復(fù)性包涵體型異源蛋白的表達(dá)第五十

36、二張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì) 目標(biāo)蛋白以可溶性蛋白質(zhì)形式表達(dá)雖然可以避免包涵體復(fù)性帶來(lái)的問(wèn)題，但是也有一定的缺陷，主要表現(xiàn)為大腸桿菌本身存在于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)往往只含有少量的，甚至沒(méi)有半胱氨酸殘基。富含半胱氨酸殘基，需要形成二硫鍵的蛋白質(zhì)大部份被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞的其他部位。 分泌型異源蛋白的表達(dá)第五十三張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 這是因?yàn)榇竽c桿菌細(xì)胞質(zhì)微環(huán)境的氧化還原態(tài)勢(shì)不利于蛋白質(zhì)二硫鍵的形成，而且缺少一種形成二硫鍵所必須的體系。一些需要通過(guò)二硫鍵的形成來(lái)維持其構(gòu)象的目標(biāo)蛋白在大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中往往不能正確折疊。 解決這一問(wèn)題的途徑之一是

37、用大腸桿菌氧硫還蛋白還原酶基因 trxB 缺陷株作為宿主菌表達(dá)目標(biāo)蛋白。研究表明trxB 缺陷株細(xì)胞質(zhì)的氧化還原態(tài)勢(shì)發(fā)生了變化，蛋白質(zhì)在 trxB 缺陷株的細(xì)胞質(zhì)中能夠形成二硫鍵。這一菌株對(duì)于表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)而言是一個(gè)相當(dāng)重要的工具。分泌型異源蛋白的表達(dá)第五十四張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月在細(xì)胞質(zhì)中直接表達(dá)不帶有前導(dǎo)序列的成熟蛋白質(zhì) 在細(xì)胞質(zhì)中直接表達(dá)不帶有前導(dǎo)序列的成熟蛋白質(zhì)需要起始密碼，通常為編碼甲硫氨酸的 ATG。 在多數(shù)情況下，N 端附加的甲硫氨酸對(duì)蛋白質(zhì)的性質(zhì)沒(méi)有特別的影響，但是也有附加的甲硫氨酸嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)生物學(xué)活力的報(bào)道。 另外，附加的甲硫氨酸也可能改變蛋白質(zhì)

38、的免疫性質(zhì)和藥理性質(zhì)。從制備用于醫(yī)療目的的蛋白質(zhì)的角度來(lái)看，這是一個(gè)需要引起重視的問(wèn)題。 第五十五張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月去除附加的甲硫氨酸有二種方法： 在表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)甲硫氨酸氨肽酶基因。 在分離純化后在體外用外肽酶處理。 但它們都對(duì)與甲硫氨酸相鄰的氨萊酸殘基類型有一定要求，因此在使用上有一定的限制。第五十六張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月目標(biāo)蛋白與有親合配基的序列融合表達(dá) 與純化包涵體相比，細(xì)胞質(zhì)中以可溶性形式表達(dá)蛋白質(zhì)的分離純化過(guò)程比較復(fù)雜，一般要通過(guò)親合層析才能達(dá)到比較高的純度。 目標(biāo)蛋白與有親合配基的序列融合表達(dá)既可以提高分離純化的效率，又能在融合蛋白切

39、離的過(guò)程中得到?jīng)]有附加甲硫氨酸目標(biāo)蛋白。 金黃色葡萄球菌蛋白G、A和衍生物Z，日本血吸蟲(chóng)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白，His-tag 等是目前常用的與目標(biāo)基因融合表達(dá)的序列。第五十七張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第五十八張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá)目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá)的優(yōu)點(diǎn) 大腸桿菌周質(zhì)空間中自身蛋白質(zhì)的數(shù)量約為 100 種，只占菌體總蛋白數(shù)量的4%。蛋白水解酶的含最與在細(xì)胞質(zhì)中相比也少得多，因此目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá)有利于分離純化和減少蛋白水解酶的降解。 目標(biāo)蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)空間過(guò)程中信號(hào)肽被加工切除，有效地避免了

40、N 端附加的甲硫氨酸的產(chǎn)生。 周質(zhì)空間中呈氧化型的氧化還原態(tài)勢(shì)使目標(biāo)蛋白能夠較好折疊，維持正確的構(gòu)象。第五十九張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月目標(biāo)蛋白外泌表達(dá) 把所表達(dá)的目標(biāo)蛋白外泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中可以進(jìn)一步減少蛋白水解酶的降解，也有利于分離純化。 目前成功的例子主要是采用以下方案: （1）與大腸桿菌本身的外泌蛋白基因融合表達(dá) （2）與一些能提高細(xì)胞外膜通透性的因子融合或共表達(dá) （3）改變培養(yǎng)基的成分 歸納現(xiàn)有的研究結(jié)果顯示這些方法僅對(duì)外泌分子量較小的蛋白有效，而且外泌效率一般都比較低。第六十張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù)表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和

41、設(shè)計(jì)共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 基因提高目標(biāo)基因 mRNA 和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性高密度發(fā)酵和工程化宿主細(xì)胞第六十一張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù)表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì) 在各種表達(dá)載體中，啟動(dòng)子和 SD序列的下游都設(shè)計(jì)了一段含有各種限制性酶切位點(diǎn)的序列，用于目標(biāo)基因的插入。這一插入位點(diǎn)附近的序列將成為核糖體結(jié)合位點(diǎn)的一部分，因此它對(duì)于構(gòu)建高效表達(dá)質(zhì)粒是至關(guān)重要的。 由于每一個(gè)基因都具有各自獨(dú)特的 5 端結(jié)構(gòu)，最終構(gòu)建成的各種表達(dá)質(zhì)粒所具有的核糖體結(jié)合位點(diǎn)是一個(gè)變量。第六十二張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第六十三張，PPT共八十六頁(yè)，

42、創(chuàng)作于2022年6月第六十四張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù)表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì) 構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)首先要考慮使目標(biāo)基因的翻譯起始密碼 ATG 與 SD 序列之間的距離和堿基組成處于一個(gè)適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)。 核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列的變化對(duì) mRNA 的翻譯效率有顯著影響，具體表現(xiàn)為： SD 序列 UAAGGAGG 的翻譯效率要比 AAGGA 高36倍 翻譯起始密碼 ATG 與 UAAGGAGG的最適距離是 68 個(gè)堿基長(zhǎng)度， 與 AAGAA 的最適距離是57 個(gè)堿基長(zhǎng)度 ATG 與 UAAGGAGG 至少相隔 3 4個(gè)堿基，與 AAGAA 至少相隔 5 個(gè)堿基； m

43、RNA 的翻譯才能進(jìn)行 ATG 與 SD 序列之間的堿基組成為 A，T 堿基豐富時(shí)，mRNA 翻譯效 率較高。第六十五張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 核糖體結(jié)合位點(diǎn)本身和附近的序列決定了目標(biāo)基因 mRNA 5 端的二級(jí)結(jié)構(gòu)，研究表明討 mRNA 5端形成的 “莖環(huán)” 結(jié)構(gòu)阻礙了 mRNA 與核糖體 30S 亞基的結(jié)合，從而抑制了翻譯的起始。 盡量提高核糖體結(jié)合位點(diǎn)本身和附近的序列中 A/T 堿基的含量，降低 mRNA 5 端形成的 “莖環(huán)” 結(jié)構(gòu)的可能性，也是構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)需要注意的事項(xiàng)。 在必要的情況下，還可通過(guò)定點(diǎn)突變，PCR 等技術(shù)改變個(gè)別關(guān)鍵的堿基來(lái)破壞 mRNA 5 端的

44、 “莖環(huán)” 結(jié)構(gòu) 。 把目標(biāo)基因設(shè)計(jì)成多順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)，在大腸桿菌本身的高效翻譯起始元件后加上第二個(gè) SD 序列和目標(biāo)基因，一起插入表達(dá)載體。這一方法通常適用于目標(biāo)基因 5 端序列容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，而又不宜改變其序列的情形下第六十六張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì) 在構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，充分利用各個(gè)基因的結(jié)構(gòu)特征和特點(diǎn)，注意引入翻譯增強(qiáng)子序列 能提高 mRNA 翻譯效率的特殊核苷酸序列，稱為翻譯增強(qiáng)子 。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù)第六十七張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 基因 表達(dá)水平高的基因呈現(xiàn)的密碼子偏愛(ài)性高于表達(dá)水

45、平低的基因。 現(xiàn)已闡明的在大腸桿菌中的稀有密碼子有： 編碼 Arg 的密碼子 AGA、AGG、CGA、CGG 編碼 Pro 的密碼子 CCC、CCU、CCA 編碼 Cys 的密碼子 UGU、UGC; 編碼 Gly 的密碼子 GGA、GGG 編碼 Leu 的密碼子 CUA、CUC 編碼 Ile 的密碼子 AUA 編碼 Ser 的密碼子 UCA、AUG、UCG、UCC 編碼 Thr 的密碼子 ACA四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù)第六十八張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 基因 由于同義密碼子的使用頻率與細(xì)胞內(nèi)對(duì)應(yīng)的 tRNA 的豐度有正比關(guān)系稀有密碼子對(duì)

46、應(yīng)的 tRNA 的豐度很低，有可能在翻譯過(guò)程中發(fā)生中止和移碼突變。 解決這一問(wèn)題的辦法： 通過(guò)基因突變把稀有密碼子改變?yōu)槠渌褂妙l率高的同義密碼子。 在表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)稀有密碼子 tRNA 基因，以提高大腸桿菌細(xì)胞 內(nèi)稀有密碼子 tRNA 的豐度四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù)第六十九張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 在所有的大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 中，tRNA Arg (AGG/AGA) 含量最少，而 AGG 和 AGA 密碼子在真核基因中經(jīng)常出現(xiàn)。 人尿激酶原 ProUK，新型組織纖溶酶原激活劑 NTA 等基因中都含有較多的 AGG 和 AGA 密碼子， 在大腸桿菌中直接表

47、達(dá)的水平很低，但在大腸桿菌中共表達(dá) tRNA Arg(AGG/AGA) 基因 argU 后， 這些基因的表達(dá)水平能明顯得到提高。 現(xiàn)在還沒(méi)有一個(gè)固定規(guī)則來(lái)判定稀有密碼子的存在是否確實(shí)會(huì)對(duì)翻譯過(guò)程產(chǎn)生明顯的不利影響。因?yàn)橄∮忻艽a子存在的位置、分布的均勻性、mRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)的不同決定了它對(duì)翻譯過(guò)程的影響是有差別的。所有的結(jié)論要通過(guò)實(shí)驗(yàn)才能得出。四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù)第七十張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月提高目標(biāo)基因 mRNA 和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性 由于大腸桿菌防御體系的自身保護(hù)作用，大腸桿菌中的核酸酶和蛋白水解酶能夠降解目標(biāo)基因 mRNA 和目標(biāo)基因產(chǎn)物，這種降解作用程度

48、對(duì)不同的基因或蛋白質(zhì)而言是不同的，具有一定的專一性和選擇性。四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù)第七十一張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月蛋白水解酶的特點(diǎn) 細(xì)胞質(zhì)是蛋白水解酶含量最多的區(qū)域，目標(biāo)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中最容易受 到蛋白水解酶的作用。 通過(guò)對(duì)已知大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)半衰期的蛋臼質(zhì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn) N末 端為Arg 、 Lys 、 Leu 、 Phe 、 Tyr 、 Trp 殘基的蛋白質(zhì)，含有Pro Glu 、Ser 、Thr 豐富區(qū)的蛋白質(zhì)容易降解，穩(wěn)定性較差。 在細(xì)胞內(nèi)有多肽碎片、突變的異常蛋白和外界物理因素的刺激的條件 下，大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的蛋白水解酶活力往往能達(dá)到比較高的水平。四、高效

49、表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù)第七十二張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月提高目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性的措施主要有： 利用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)把目標(biāo)蛋白最終累積在周質(zhì)空間，或分泌到培養(yǎng)基中 采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作為宿主菌。 對(duì)分子量較小的目標(biāo)基因進(jìn)行融合表達(dá)或串聯(lián)聚合表達(dá)。 共表達(dá)能提高特定目標(biāo)蛋白穩(wěn)定性的輔助因子，如分子伴侶基因。 對(duì)蛋白質(zhì)序列中的蛋白水解酶敏感區(qū)域和識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行改造。 在較低的溫度下培養(yǎng)菌體和優(yōu)化發(fā)酵條件。四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù)第七十三張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 但必須指出的是，由于目標(biāo)蛋白本身的性質(zhì)和用途的不同，上述幾種方法在使用上是受到一定的限制

50、的。主要表現(xiàn)為： 大腸桿菌對(duì)分子量較大的目標(biāo)蛋白的較運(yùn)和分泌效率一般比較低，不能滿足大規(guī)饃制備的需要。 蛋白水解酶含量低的菌株往往代謝不旺盛，生長(zhǎng)速率慢，使高密度發(fā)酵比較困難。 融合表達(dá)使目標(biāo)蛋白的構(gòu)象與天然狀態(tài)不一樣，導(dǎo)致生物比活力降低，甚至沒(méi)有活性。 融合蛋白和串聯(lián)聚合蛋白需要用酶或化學(xué)的方法切割出單體目標(biāo)蛋白。酶法成本比較高且加入的酶蛋白還必須分離去除?；瘜W(xué)法比酶法成本低，但不少裂解試劑有毒性。 對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行改造需要有基本的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，而目前這方面的數(shù)據(jù)庫(kù)還不完整。第七十四張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù)高密度發(fā)酵和工程化宿主細(xì)胞 大腸桿

51、菌高密度發(fā)酵是大規(guī)模制備重組蛋白質(zhì)過(guò)程中不可缺少的工藝步驟。其目的是在單個(gè)菌體對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)水平基本不變的前提下，通過(guò)單位體積的菌體數(shù)量的成倍增加來(lái)實(shí)現(xiàn)總表達(dá)量的提高。 目前常用的發(fā)酵方式有：恒定培養(yǎng)、流加補(bǔ)料培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)三種 第七十五張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌 高密度發(fā)酵后期由于菌體的生長(zhǎng)密度較高，培養(yǎng)基中的溶氧飽和度往往比較低，氧氣的不足導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)速率降低和乙酸的累積，乙酸的存在對(duì)目標(biāo)基因的高效表達(dá)有明顯的阻抑作用。這是高密度發(fā)酵工藝研究中最迫切需要解決的問(wèn)題。 雖然在發(fā)酵過(guò)程中可采取通氧氣，提高攪拌速度，控制補(bǔ)料速度等措施來(lái)控制溶氧飽

52、和度，減少乙酸的產(chǎn)生。但從實(shí)際應(yīng)用上看，這些措施都有一定的滯后效應(yīng)，難以做到比較精確的控制。因此構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌，是從恨本上解決問(wèn)題的途徑之一。四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù)第七十六張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 利用透明顫菌血紅蛋白能提高大腸桿菌在貧氧條件下對(duì)氧的利用率的生物學(xué)性質(zhì)，把透明顫菌血紅蛋白基因 vgb 導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)以增加其對(duì)溶氧的寬容度。從而降低菌體產(chǎn)生乙酸所要求的溶氧飽和度閥值。 用基因敲除技術(shù)缺失大腸桿菌的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因 pta1 和乙酸激酶基因ackA，使從丙酮酸到乙酸的合成途徑被阻斷。 改變代謝流的方向，通過(guò)共轉(zhuǎn)化把枯草桿菌、釀酒酵母

53、的乙酰乳酸合成酶基因 alsS，單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因 pdc1 和乙醇脫氫酶基因 adh2 導(dǎo)入大腸桿菌，使丙酮酸的代謝有選擇地向生成3-羥基丁酮或乙醇的方向進(jìn)行。四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù)第七十七張，PPT共八十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 對(duì)于以可溶性或分泌形式表達(dá)的目標(biāo)蛋日而言，隨著發(fā)酵后期各種蛋白水解酶的累積，目標(biāo)蛋白會(huì)遭到蛋白水解酶的作用而被降解。為了使對(duì)蛋白水解酶比較敏感的目標(biāo)蛋白也能獲得較高水平的表達(dá)，需要構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌。 rpoH 基因編碼大腸桿菌 RNA 聚合酶的 r32 亞基， r32 亞基對(duì)大腸桿菌中多種蛋白水解酶的活力有正調(diào)控作用。 rpoH 基因缺陷的突