漆酶提純分離

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔傾情為你奉上專心專注專業(yè)專心專注專業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔傾情為你奉上專心專注專業(yè)漆酶的提取純化及其脫色研究摘 要 【目的】本實驗通過選取一株突變的高產(chǎn)漆酶的粗毛栓菌發(fā)酵液（培養(yǎng)11天產(chǎn)生漆酶酶活最高），經(jīng)過離心沉淀過濾，硫酸銨沉淀，Sephadex G-75凝膠過柱層析，分離純化漆酶以及測定其純化相關(guān)參數(shù)，并用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定各步分離后的成分變化。最后研究其脫色的效果，為漆酶應(yīng)用的相關(guān)研究提供實驗依據(jù)?！痉椒ā坷眠^濾，硫酸銨沉淀，Sephadex G-75凝膠過柱層析，的方法提取純化漆酶，SDS-聚丙烯酰胺凝膠鑒定分離成分，并用光密度測漆酶的脫色率。

2、【實驗材料】發(fā)酵液，相關(guān)試劑【預(yù)計結(jié)果】選用凝膠濃度為12%，結(jié)果可以明顯看出，經(jīng)過純化的漆酶的條帶是單一的，相關(guān)參數(shù)（蛋白含量，活力回收，比活力，純化倍數(shù)）比較高，另外，脫色效果比較顯著?！窘Y(jié)論】關(guān)鍵詞漆酶 純化 脫色 應(yīng)用1 前言1.1 實驗的研究意義 木質(zhì)素是植物中產(chǎn)生的一類難于降解的高分子化合物的統(tǒng)稱，主要由苯丙烷單元通過醚鍵和碳鍵等多種共價鍵連接而成的雜聚物，是自然界中碳循環(huán)的限速環(huán)節(jié)之一。其降解主要由微生物完成，這類微生物主要包括真菌、放線菌和細(xì)菌。其中白腐真菌（white rot fungi）被認(rèn)為是生物圈中植物天然高分子物質(zhì)木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的重要降解者，能使這些物質(zhì)最終

3、分解為二氧化碳和水。白腐真菌通常通過分泌木質(zhì)素過氧化物酶（Lignin peroxidase，Lip）、錳過氧化物酶（Manganese peroxidase，MnP）和漆酶（Laccase，Ec1.10.3.2）三種主要的木質(zhì)素降解酶類來降解木質(zhì)素。其中漆酶，能夠?qū)⒛举|(zhì)素降解為CO2和H2O，反應(yīng)過程不需要H2O2的參與，在木質(zhì)素降解中起主要作用。 其中漆酶（Laccase）是一種多酚氧化酶（p-diphenol oxidase EC.1.10.3.2），屬于藍(lán)色氧化酶家族。漆酶能催化降解多種芳香族化合物特別是酚類，是一種天然環(huán)保型酵素。因而在紙漿生物漂白、染料脫色、廢水處理、食品加工、生物

4、質(zhì)能源等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，利用漆酶對木質(zhì)纖維及一些高分子化合物的降解作用，進(jìn)行合理的開發(fā)利用，可減少化學(xué)藥品的使用量，降低生產(chǎn)成本和保護(hù)環(huán)境。 本實驗通過過濾，硫酸銨沉淀，凝膠層析柱，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法提取純化漆酶,結(jié)果蛋白含量，活力回收，比活力，純化倍數(shù)都取得較好的效果，對于漆酶的分離、提純及其天然結(jié)構(gòu)和生理功能的研究中有重要的作用。漆酶的脫色實驗很好的證明了漆酶的重要用途，為漆酶的實用性，工業(yè)用途提供了實驗平臺。1.2 實驗的創(chuàng)新性 在以往的漆酶的提取純化過程中，要做到蛋白含量，活力回收，比活力，純化倍數(shù)同時較高是比較困難的，尤其是最后得到的漆酶不僅酶量少，而且酶活較低

5、。在本實驗中，我們經(jīng)過多步驟純化，并注意保持其酶活，最后得到的漆酶酶活高，純度高。 目前，我們從所查閱的大量參考文獻(xiàn)中可知，漆酶的脫色反應(yīng)操作比較困難，主要原因為無法提取純度較高的酶，或者最后得到的漆酶酶活太低，導(dǎo)致脫色效果不明顯。因此，漆酶的脫色反應(yīng)一直沒有被廣泛應(yīng)用。我們設(shè)計這個實驗以純化提取為基礎(chǔ)，具有可行性強(qiáng)、操作簡單、方便等特點。為漆酶的脫色應(yīng)用的研究提供一個參考實驗。2 實驗?zāi)康模?）得出一種能分離，純化漆酶并保持較高酶活的方法。（2）完成漆酶的一個重要的應(yīng)用脫色反應(yīng)，為漆酶的實際應(yīng)用提供實驗研究基礎(chǔ)。3 實驗原理 3.1 硫酸銨沉淀法 蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)周圍親水集

6、團(tuán)與水形成水化膜的成都以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。當(dāng)有中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液時，中性鹽對水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失。同時，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀?！?】 3.2 Sephadex G-75凝膠過柱層析 凝膠過濾層析是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來進(jìn)行分離。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，小分子物質(zhì)能進(jìn)入其內(nèi)部，流出速度慢，而大分子物質(zhì)卻被排除在外部，流出速度快，當(dāng)一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中

7、的物質(zhì)就按不同分子大小篩分開。根據(jù)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，粗毛栓菌主要漆酶的表觀分子量為61.5KD【*】，因此，本試驗采用Sephadex G-75（葡聚糖凝膠G-75）填料，孔徑相對分子量范圍2 kD70 kD。3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法 聚丙烯酰胺凝膠電泳是以丙烯酰胺為單體，N，N-甲叉丙烯酰胺為交聯(lián)劑，在催化劑（過硫酸銨）和引發(fā)劑（TEMED）的作用下，聚合成含酰胺基側(cè)鏈的脂肪族長鏈，相鄰的兩個鏈通過甲叉橋交聯(lián)起來而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有分子篩效應(yīng)，分離分子通過網(wǎng)孔的能力取決于凝膠孔大小和形狀，也取決于被分離分子的形狀及大小，但在SDS-聚丙烯酰胺電泳中，蛋白質(zhì)與SDS形成

8、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，由于SDS帶負(fù)電，使各種蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物都帶上相同的負(fù)電荷，它的量大大超過了蛋白質(zhì)原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，而且，其還引起了蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，使蛋白質(zhì)的電泳遷移率只與其質(zhì)量有關(guān)，因此可以測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量及分離提純蛋白質(zhì)?！?】 3.4 A280測定蛋白濃度 蛋白質(zhì)分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯環(huán)結(jié)構(gòu)，在紫外280nm波長處有最大吸收峰，其光吸收值與蛋白質(zhì)濃度成正比，故可以用280nm波長吸收值大小來測定蛋白質(zhì)含量。3.5 漆酶活性測定 漆酶（Laccases, EC 1.10.3.2）活力的測定，參照文獻(xiàn)【*】，采用AB

9、TS2，2-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid）法。反應(yīng)體系含有1.95ml 0.1mol/L NaAc-HAc緩沖液（pH4.0）、2.00ml 0.5mmol/L 連氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）溶液和經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液50uL，于28啟動反應(yīng)并連續(xù)測定反應(yīng)液在3min內(nèi)于420nm（=3.6104cm-1mol-1L）處吸光值的增加值。定義該條件下，每分鐘使1umol/L ABTS轉(zhuǎn)化所需的酶量定為1個活力單位（U）。漆酶活力計算公式如下：漆酶活力（U/L）=nA106V總/=3.61043V酶式中：n為酶液稀釋

10、倍數(shù)V總為反應(yīng)總體積V酶為反應(yīng)酶液體積A為反應(yīng)液在3min內(nèi)在420nm處吸光值的變化值3為反應(yīng)時間（min）3.6104為ABTS氧化態(tài)的摩爾吸光系數(shù)（cm-1mol-1L）3.6 漆酶的脫色測定 由于漆酶具有單電子氧化還原電位高、催化活性強(qiáng)等特點,可以氧化芳香環(huán)化合物,對染料的脫色及降解效果明顯。在紫外可見分光光度計上可得到不同的吸光值，用于比較其脫色效果。4 實驗設(shè)備表1 實驗設(shè)備名 稱規(guī) 格數(shù) 目備 注冰箱1臺4電熱恒溫水浴鍋1臺電子天平1臺電子分析天平1臺紫外分光光度計1臺恒流泵1臺微量加樣器50L1支凝膠成像系統(tǒng)1套大型冷凍離心機(jī)1臺自動部分收集器1臺配套30支小試管玻璃層析柱柱長

11、28 cm、柱直徑1.5 cm1支移液槍5mL、1mL、200L各1支配套槍頭穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀1臺水平振蕩器1量筒50mL、200ml、500 mL、1L各一個燒杯50mL、100mL、500mL夾心式垂直板電泳儀各品牌皆可1臺玻璃板、0.1cm薄膠條、夾子、0.1cm梳子、導(dǎo)線吸管試劑瓶剪刀玻璃棒3支試管10ml20個配套試管架：2個膠塞錐形瓶玻璃管乳膠管1米圓底燒瓶1L1個接液管1個鐵架臺1個含有夾子等酸式滴定管1支50mL標(biāo)簽紙若干廣泛pH試紙一包 保鮮膜1卷紙卷1卷5 實驗材料及試劑5.1 實驗材料5.1.1 由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)研究所提供高產(chǎn)漆酶粗毛栓菌發(fā)酵粗酶液5.2 實驗試劑表2

12、 實驗試劑試劑名稱規(guī)格丙烯酰胺（Acr）分析純甲叉雙丙烯酰胺（Bis）分析純濃鹽酸分析純氯化鈉分析純磷酸二氫鈉分析純磷酸氫二鈉分析純過硫酸銨（AP）生化試劑四甲基乙二胺（TEMED）生化試劑標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker14.4-90KDa生化試劑三羥甲基氨基甲烷（Tris）生化試劑SDS分析純甘氨酸生化試劑甘油分析純二硫代蘇糖醇（DTT）分析純-巰基乙醇 分析純冰乙酸硫酸銨分析純考馬斯亮藍(lán)R-250分析純考馬斯亮藍(lán)G-250分析純甲醇無水氯化鈣葡聚糖凝膠 G-75凡士林溴酚藍(lán)分析純硼酸分析純甲基紅分析純溴甲酚氯 或 次甲基藍(lán)分析純氧化鎂碳酸鈉分析純無水乙醇分析純氫氧化鈉分析純PEG 20000分析純5

13、.3 硫酸銨沉淀相關(guān)試劑配備 PBS溶液（pH 6.8）：取490 ml 0.2mol/L Na2HPO4, 510ml 0.2mol/L NaH2PO4混合后定容至1L。5.4 Sephadex G-75凝膠準(zhǔn)備及相關(guān)試劑配制5.4.1 Sephadex G-75凝膠準(zhǔn)備1.從廠家提供的溶脹系數(shù)和需要的裝柱的大約柱床體積計算需要的凝膠干粉的量。將計算量的凝膠干粉加入到兩倍的計算凝膠終體積的凝膠過濾脫鹽緩沖液中。 2.用玻璃棒小心攪拌懸液，讓凝膠室溫條件下溶脹過夜，或90水浴3h，適時攪拌保持凝膠呈懸浮狀。 3.讓凝膠沉淀，輕輕倒出霧狀溶液以除去細(xì)小和破碎的凝膠顆粒。重復(fù)這一步驟，直到凝膠沉淀

14、床清晰可見，然后將其稀釋，使凝膠沉淀床和凝膠過濾緩沖液體積比為1：1。5.4.2 相關(guān)試劑配制 1.洗脫緩沖液（pH 7.5 0.05mol/L Tris-HCl溶液）：50 mL 0.1mol/L Tris溶液與40.3 mL 0.1 mol/L 鹽酸混勻后，加蒸餾水定容至100mL。 5.5 SDS電泳凝膠相關(guān)試劑的配制 1.30%丙烯酰胺凝膠貯備液：取30g 丙烯酰胺（Acr）和0.8g 雙丙烯酰胺（Bis）冗余蒸餾水中，定容至100mL，過濾后4下貯存?zhèn)溆谩?2.10%過硫酸銨（AP）溶液：稱取0.10g 過硫酸銨溶解于1ml蒸餾水中，現(xiàn)配現(xiàn)用。 3. 10%四甲基乙二胺（TEMED）

15、：取0.20g四甲基乙二胺（TEMED），加蒸餾水溶解，定容至2mL。4.分離膠緩沖液（1.5mol/L Tris-HCl 緩沖液，pH 8.8）：取18.15gTris（三羥甲基氨基甲烷）溶解后，加1mol/L HCl溶液約48mL，調(diào)pH至8.8定容至100mL。5.濃縮膠緩沖溶液（0.5mol/L Tris-HCl緩沖液，pH6.8）：取3.00gTris（三羥甲基氨基甲烷）溶解后，加加1mol/L HCl溶液約20mL，調(diào)pH至6.8定容至50mL。6.10%SDS溶液：取5g SDS加蒸餾水溶解并定容至50ml。7.樣品緩沖液（0.1% SDS-1% 巰基乙醇-或20%甘油-0.02

16、%溴酚藍(lán)-0.2%SDS）：取0.05g SDS、0.5ml巰基乙醇、10ml甘油、0.1mL0.5%溴酚藍(lán)、1mL10%SDS溶液，用蒸餾水定容至50mL。8.電極緩沖液（0.1%SDS-0.05mol/L Tris-0.384 mol/L 甘氨酸緩沖液，pH8.3）：取Tris、甘氨酸和SDS加水溶解后，調(diào)pH值至8.3，定容至1000mL。9.染色液（0.1%考馬斯亮藍(lán)-45%甲醇溶液-10%冰乙酸溶液）：取0.1g 考馬斯亮藍(lán)R-250，加入45mL 甲醇溶液、10mL 冰乙酸，用蒸餾水定容至100mL。10.脫色液（7.5%冰乙酸-5%甲醇溶液）：取75mL 冰乙酸、50mL 甲醇溶

17、液，加蒸餾水定容至1000mL。11.指示劑（0.5%溴酚藍(lán)溶液）：去0.25g溴酚藍(lán)，加蒸餾水溶解，定容至50mL。 5.4 材料的處理5.4.1 發(fā)酵液的處理 用最佳培養(yǎng)基發(fā)酵高產(chǎn)漆酶粗毛栓菌，培養(yǎng)11天停止發(fā)酵，10000rad/min 離心10分鐘，取上清液，抽濾除去菌絲體等雜質(zhì)，得到發(fā)酵液，置于4冰箱保存。6 實驗操作步驟6.1硫酸銨分級鹽析分離粗酶（因所需時間較長，所以在正式實驗前完成） （1）在100mL發(fā)酵液中緩慢加入硫酸銨粉末，并溫和攪拌（冰浴中），直至終濃度達(dá)到45%，4 靜置過夜后10 000 r/min、4 、離心30 min，分別收集上清液和沉淀。一級沉淀產(chǎn)物用適量P

18、BS溶液溶解，得到一級沉淀粗酶液。分別測定上清液和一級沉淀粗酶液的酶活。一級沉淀溶解液置于4冰箱，備用，用于SDS電泳。 （2）在步驟（1）中得到的上清液繼續(xù)緩慢加入硫酸銨粉末，并溫和攪拌（冰浴中），直至終濃度達(dá)到45%，4 靜置過夜后10 000 r/min、4 、離心30 min，分別收集上清液和沉淀。二級沉淀產(chǎn)物用適量PBS溶液溶解，得到二級沉淀粗酶液。分別測定上清液和二級沉淀溶解液的酶活。二級沉淀粗酶液取出少量樣品置于4冰箱，用于SDS電泳 （3）將所得二級沉淀粗酶液放入截留相對分子量為6 kD的透析袋中，排除多余的空氣，扎緊兩端，透析袋上覆蓋聚乙二醇20000，4 放置約23 h，當(dāng)

19、透析袋中酶樣品濃縮到需要體積時，將用蒸餾水沖洗凈袋體上的聚乙二醇20 000，然后取出樣品，置于4冰箱，用于凝膠過柱層析。6.2凝膠過柱層析 （1）裝柱：將層析柱垂直固定在鐵架臺上，緩緩攪拌凝膠懸浮液，然后慢慢倒入預(yù)先置好的層析柱中。傾倒完畢，下端出口管用螺旋夾控制，勿產(chǎn)生氣泡。當(dāng)凝膠已完全沉降后，保持液面在凝膠床表面以上，最后放入略小于層析柱內(nèi)徑的濾紙片，保護(hù)凝膠床面，蓋上上蓋。 （2）平衡：連接好恒流泵，繼續(xù)用洗脫液平衡，調(diào)整恒流泵流量使膠床表面保持2cm液層，并使流速為0.5 ml/min，平衡30分鐘。 （3）上樣：當(dāng)膠床表面僅留約1mm液層時，吸取1mL二級沉淀粗酶液樣品，小心地注入

20、層析柱膠床面中央，慢慢打開螺旋夾，待大部分樣品進(jìn)入叫膠床，床面僅有1mm液層時，用滴管加入少量洗脫液，使剩余樣品進(jìn)入膠床，然后滴管小心加入25 cm高的洗脫液。 （4）洗脫：用洗脫緩沖液洗脫，繼續(xù)控制流速為0.5 ml/min，開啟部分收集器，4min/管，2mL/管，分管受集流出液。 （5）測定蛋白含量以及漆酶活力：以洗脫液為空白對照，于A280測定每個收集管的OD值，連續(xù)測定30管，繪制以分光度為縱坐標(biāo)，收集管號為橫坐標(biāo)的曲線。選取A280 OD值不為零的搜集管用ABTS法測定漆酶酶活，繪制以漆酶活力為縱坐標(biāo)，收集管號為橫坐標(biāo)的曲線。 （6）把酶活較高的收集液合并到一管，測定其酶活，取樣用

21、于SDS凝膠電泳。6.3 不連續(xù)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳6.3.1 不連續(xù)SDS-聚丙烯酰胺凝膠的制備表3 SDS不連續(xù)系統(tǒng)分離膠和濃縮膠的配制加樣順序試劑名稱封膠12%分離膠所需試劑量5%濃縮膠液所需試劑量130%凝膠貯液2000L4000l810l2濃縮膠緩沖貯液（pH 6.8）-2500l3分離膠緩沖貯液（pH 8.8）-5000l-4去離子水6000L650l1500l510%過硫酸銨120l150l70l6TEMED200l100l70l （1）用2塊干凈的玻璃平板和墊片組裝電泳裝置中的玻璃平板夾層，并固定在灌膠支架上。（2）將配好的分離膠溶液沿夾層中一片墊片的邊緣加入于玻璃夾層中

22、，上面封1-2ml去離子水，室溫下聚合3060 min。（3）傾去上層水，將配好的濃縮膠溶液沿夾層加入玻璃夾層中，直至離夾層的頂部約1 cm高為止。（4）將梳子插入夾層的濃縮膠液體中，室溫下聚合3045 min。（5）在具螺口蓋的微量離心管中，用2SDS樣品緩沖液按1：1（v/v）稀釋待測蛋白質(zhì)樣品，于100 煮沸35 min。同樣緩沖液溶解蛋白質(zhì)相對分子量標(biāo)準(zhǔn)混合物。（6）小心地拔出梳子，將玻璃平板安裝在電泳裝置上，倒入1SDS電泳電極緩沖液，使之淹沒凝膠的加樣孔。6.3.2電泳過程表4 不連續(xù)SDS電泳點樣表膠孔號1234567891011樣品名稱Marker發(fā)酵液一級沉淀粗酶液二級沉淀粗

23、酶液過柱后純化酶液點樣量10L10L10L10L10L（1）樣品要加入3L樣品緩沖液以及指示劑，按表4用微量注射器點樣。（2）連接電源，先在5 mA恒流下電泳至溴酚藍(lán)指示劑從積層膠進(jìn)入分離膠，再將電流調(diào)至10 mA至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)凝膠底部為止。（3）關(guān)閉電源并撤去導(dǎo)線，棄去電極緩沖液。（4）將凝膠剝離出來并切去凝膠的一角做上標(biāo)記。6.3.3染色及脫色（1）將聚丙烯酰胺凝膠放在塑料容器中并以35倍體積的考馬斯亮藍(lán)R-250固定染色液覆蓋，在旋轉(zhuǎn)搖床上緩慢搖動12h。（2）傾去固定染色液，以脫色液覆蓋凝膠，緩慢搖動，開始時每隔15分鐘更換一次脫色液，之后每30分鐘更換一次染色液，直至獲得藍(lán)色條帶及干凈的背景。拍照存檔。6.4 漆酶對染料脫色的研究6.4.1染料吸收光譜的測定 配制考馬斯亮藍(lán)G-250染料溶液,以去離子水為參比,在UV23100紫外可見分光光度計上對其進(jìn)行紫外-可見光區(qū)（ 200800 nm）光譜掃描,得到染料的最大吸收波長。6.4.2染料脫色試驗 脫色的反應(yīng)體系:考馬斯亮藍(lán)的終濃度為100 mg/L,按酶液與染料液1:3加入 ,同時添加一定量的介質(zhì)ABTS（0.5ml）,在不同溫度30和pH 5.8下,每隔半個小時記錄染料在特征波長處的吸光值A(chǔ) ,相同試驗條件下,加入等量滅活酶液（100加熱10min）作為對照,三個重復(fù)，取平均值。測定吸光值為A0 ,脫色率（%）