蚯蚓纖維蛋白溶解酶的提取分離純化

1、蚯蚓纖維蛋白溶解酶的提取分離純化062 第二組1 酶是植物體內(nèi)具有催化作用的蛋白質(zhì)，動(dòng)植物體內(nèi)的生化反應(yīng)，一般都是在酶的作用下進(jìn)行的，沒(méi)有酶的催化反應(yīng)，動(dòng)植物的生命也就停止了，因此對(duì)酶的研究是闡明生命現(xiàn)象本質(zhì)中十分重要的部分。為要研究酶首先要將酶從組織中提取出來(lái)，加以分離、純化，不同的研究目的對(duì)酶制劑的純度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制劑即可，而有些工作則要求較純的酶制劑，需根據(jù)不同情況區(qū)別對(duì)待。在酶的提取和純化過(guò)程中，自始至終都需要測(cè)定酶的活性，通過(guò)酶活性的測(cè)定以監(jiān)測(cè)酶的去向。 2酶的存在位置？ 存在于動(dòng)植物以及微生物的細(xì)胞的各個(gè)部位 3什么是酶的提取與分離純化？ 酶的提取與分離純化是

2、指將酶從細(xì)胞或其他含酶原料中提取出來(lái)，再與雜質(zhì)分開，而獲得所需要的酶制品的過(guò)程。4酶的粗提液是否只有酶，有沒(méi)有其它物質(zhì)？ 除含有所需要的酶外，還含有其他蛋白質(zhì)，以及其他大分子和小分子化合物雜質(zhì)。因此需要根據(jù)提取酶與雜質(zhì)的性質(zhì)差別進(jìn)行分離純化。5如何將酶從粗提液中分離純化？ 要在許多蛋白質(zhì)的混合物中分離出所需要的酶蛋白，目前常用的方法有鹽析法（利用不同蛋白質(zhì)在不同鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過(guò)在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離），柱層析法，薄膜超濾法，親和層析法，電泳法等。在大體積的提取液中一般先采用硫酸銨分級(jí)鹽析沉淀。鹽析法是提純酶使用最早的方法之

3、一，迄今仍廣泛使用，而且在高濃度的鹽溶液中酶蛋白不易變性而失去活性，利于工作在室溫中進(jìn)行。不同蛋白質(zhì)在高濃度的鹽溶液中溶解度有不同程度的降低，鹽析法就是利用這一性質(zhì)，將不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)分離，選擇合適飽和度的硫酸銨，使沉淀的蛋白質(zhì)的酶活性最大。 6沉淀的蛋白質(zhì)經(jīng)離心后收集之，再溶于少量緩沖溶液中，經(jīng)透析或凝膠柱過(guò)濾，以除去硫酸銨及其他小分子雜質(zhì)，然后再經(jīng)過(guò)柱層析分離。由于吸附劑的不同，又有吸附柱層析、離子交換柱層析和凝膠過(guò)濾柱層析等。對(duì)于不同的支持物采用的洗脫方法也不同，分子篩類型凝膠過(guò)濾柱層析，洗脫液只要用一定濃度的緩沖液就可以了，亦即等濃度洗脫。對(duì)于吸附柱和離子交換柱層析，往往要采用濃度梯度

4、溶液進(jìn)行洗脫，最方便的是線性梯度濃度，當(dāng)然用非線性梯度會(huì)得到更好的分離效果。柱層析一般都需要自動(dòng)收集儀，如果能配用蛋白質(zhì)檢測(cè)儀就更好了。目前柱層析和硫酸銨分級(jí)沉淀一樣，已經(jīng)成為一種常規(guī)的酶的分離提純的步驟之一了 7近年來(lái)純化酶常用的一種有效方法為親和層析。主要利用酶和底物、抑制劑或輔酶具有一定的結(jié)合能力，這一性質(zhì)即可用來(lái)分離、提純酶。首先選擇一支持物，如瓊脂（Sepharose）將底物、競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或輔酶，以共價(jià)鍵的形式連接到支持物上，然后把含有酶的溶液，流過(guò)裝有專一性底物、競(jìng)爭(zhēng)抑制劑或輔酶的層析柱，酶即被保留在支持物上，再經(jīng)過(guò)充分洗滌除去未被吸附的雜質(zhì)，然后用含有一定濃度的底物或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑

5、或輔酶的緩沖液，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性洗脫。如果親和劑選擇合適，往往能得到較高純度的酶，是酶分離、純化中既方便又最有效的一種方法。 8 蚯蚓, 俗稱地龍, 在我國(guó)入藥已有幾千年的歷史。地龍為環(huán)節(jié)動(dòng)物門鉅蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、威廉環(huán)毛蚓或櫛肓毛蚓的干燥體。前一種習(xí)稱“廣地龍”,后三種習(xí)稱“瀘地龍”,主產(chǎn)于廣西、廣東、福建。性寒,味咸。清熱定驚,通絡(luò)、平喘,利尿;用于高熱神昏驚癇抽搐,關(guān)節(jié)麻痹,肢體麻木,半身不遂,肺熱喘咳,尿少水腫,高血壓癥。地龍是我國(guó)重要的中藥材之一。最早的中藥學(xué)專著神農(nóng)本草經(jīng)中收載的6 7種動(dòng)物藥中就有蚯蚓。李時(shí)珍著本草綱目蟲部4 2卷中用蚯蚓入藥的處方有4 0多種。 9蚯蚓中含

6、有蚯蚓素, 酶, 維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分, 具降壓平喘, 解熱, 利尿通絡(luò), 抗過(guò)敏, 解毒生肌,溶栓纖維及抗凝血等藥理作用。自1983年日本宮崎醫(yī)科大學(xué)美源恒極道、從蚯蚓中提取了具有較高活性的纖溶酶以來(lái), 國(guó)內(nèi)外紛紛研究此酶, 大量實(shí)驗(yàn)證明, 該藥在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中口服及注射均有抗栓溶栓作用。10蚯蚓構(gòu)造圖11蚯蚓纖維蛋白溶解酶的提取 將蚯蚓放在水組織搗碎機(jī)搗碎勻漿, 放入離心機(jī)進(jìn)行離心, 取出上清液, 加人丙酮產(chǎn)生沉淀, 再加人乙醚脫水, 即得粗品。12纖溶酶活檢測(cè)方法 采用纖維蛋白法側(cè)纖溶活性, 制板按Astrup法。以尿激酶為標(biāo)準(zhǔn)蛋白, 以直徑為5mm濾紙片為樣品載體, 點(diǎn)樣6ul,35 一3

7、7度保存, 測(cè)溶圈面積, 以不同單位尿激酶的溶圈面積, 以不同單位尿激酶的溶圈面積與單位作標(biāo)準(zhǔn)曲線（ul一mm）計(jì)算樣品酶活。13蛋白質(zhì)純度的檢測(cè) 以聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)分離膠濃12.5%, 濃縮膠濃度為4.5%, 樣品在濃度縮膠內(nèi)時(shí)以120v電壓電泳, 樣品進(jìn)人分離膠后以250v電壓電泳。14蛋白質(zhì)濃度的檢測(cè) 以752一型紫外光柵分光光度計(jì)測(cè)其在280nm處光吸收。151、將粗酶液過(guò)2萬(wàn)d及5萬(wàn)d超濾膜。2、超濾后各段酶液以上述纖維酶活檢測(cè)方法中測(cè)活力得纖溶酶主活力部分在2一5萬(wàn)d之間3、將超濾后2一5萬(wàn)d間酶液經(jīng)濃縮5倍后上G一100柱, 以PH6.5的磷酸緩沖液洗脫,以FC一95收集63（4.2ml/管, 8秒/滴), 以752紫外光柵分光光度計(jì)測(cè)280nm處吸收情況。4、測(cè)洗脫液酶活, 得其活力部分在第2峰酶活曲線。165、將G一100柱洗脫液活力峰合并, 加人DEAE-C52柱進(jìn)一步純化, 先以PBS洗滌至下柱液A2800.03后以0.5一1.4%NaCl-PBS液梯度洗脫, 收集120管。4秒/滴、3.2ml/管、以752紫外光柵分光光度計(jì)測(cè)光吸收。6.測(cè)酶活，找出主峰活力峰，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)此峰得到條帶得以分離此蛋白