白藜蘆醇體外抑制人胰腺癌細胞增殖的實驗研究

1、白藜蘆醇體外抑制人胰腺癌細胞增殖的實驗研究【摘要】目的:討論白藜蘆醇(resveratrl，Res)體外對胰腺癌IAPaa-2細胞增殖的影響，并討論其初步機制。方法:采用四甲基氮唑藍法TT檢測Res處理后IAPaa-2細胞的增殖情況。用倒置顯微鏡、透射電鏡觀察Res處理后細胞形態(tài)學改變，用流式細胞儀分析經25lL-1、50lL-1、100lL-1、200lL-1Res分別作用48h后IAPaa-2細胞凋亡率。結果:Res體外能明顯抑制IAPaa-2細胞的生長增殖，且在一定范圍內呈時間、濃度依賴性。經Res處理后，倒置顯微鏡觀察到細胞數目減少，局部細胞變圓，核濃縮，提示可能存在細胞凋亡；電鏡證實

2、存在典型的細胞凋亡形態(tài)學改變。用25lL-1、50lL-1、100lL-1、200lL-1Res處理48h后，流式細胞儀檢測出各處理組的細胞凋亡率明顯高于對照組(P0.05)。結論:Res在體外能明顯抑制IAPaa-2細胞的增殖，誘導細胞調亡可能是Res抑制IAPaa-2細胞增殖的主要機制之一?！娟P鍵詞】白藜蘆醇胰腺癌增殖凋亡Abstrat:bjetive:Texplretheeffetfresveratrl(Res)ntheprliferatinfpanreatiarinaIAPaa-2ellsinvitrandexplretherudientalehanis.ethds:ethylthia

3、zlyltetrazliuethd(TT)asusedtdetettheellgrthstatusfIAPaa-2ellsaftertreatentithRes.TherphlgihangesfellsaftertreatentithReseredetetedbyinvertedirspeandtransissineletrnirspe.Theapptsisratesereanalyzedithflytetry(F)aftertheellseretreatedith25lL-1,50lL-1,100lL-1and200lL-1Resfr48h,respetively.Results:Resin

4、hibitedtheprliferatinfIAPaa-2ellsinanentratin-andtie-dependentanneraseasuredbyTTethd.AftertheellseretreatedithRes,invertedirspebservedtheredutinftheellnuberandfundsignifiantrphlgihanges,haraterizedbyellrundingandellnulearenrihentsuggestingapptsis.Andthepreseneftypialrphlgialhangesfapptsisasnfiredith

5、transissineletrnirspe.Theapptsisratesat25lL-1,50lL-1,100lL-1and200lL-1Res-treatedgrupsaftertreatentfr48h,easuredbyF,eresignifiantlyhigherthanthseinntrlgrups(P0.05).nlusin:ThesefindingssuggestthatthenaturalprdutResayhaveaptentanti-prliferativeeffetnIAPaa-2ells,theehanissfhihayberelatedttheindutinfapp

6、tsis.Keyrds:resveratrl;panreatiarina；prliferatin；apptsis胰腺癌是一種惡性程度很高的消化道腫瘤,在美國居癌癥死因的第4位1，在我國其發(fā)病率也有上升趨勢。胰腺癌由于早期臨床表現(xiàn)隱匿，相當局部病人就診時已屬晚期，手術根治性切除率只有25%左右2，所以多數病人只能采用化療、放療等姑息性治療手段，然而現(xiàn)有化療藥物,即使包括吉西他濱在內，對胰腺癌的治療效果均欠佳。白藜蘆醇(resveratrl，Res)是一種多酚類化合物，在我國中藥植物虎杖鮮根中有較高的含量3，近年研究發(fā)現(xiàn)Res對胃癌、乳腺癌等具有顯著體外增殖抑制作用4，5，因此，Res有望成為治療

7、腫瘤的新藥。目前關于Res和胰腺癌治療方面的研究甚少，因此我們選擇Res和胰腺癌IAPaa-2細胞為研究對象，通過體外實驗觀察Res對胰腺癌細胞增殖的影響，來初步討論Res用于胰腺癌治療的可能性。1材料和方法1.1細胞株與試劑人胰腺癌IAPaa-2細胞株購自湖南遠泰生物公司。Res購自美國Siga公司，純度99.9%，用二甲基亞砜(diethylsulphxide，DS)溶解，配成400lL-1貯存液，消毒后，分裝，于-20凍存?zhèn)溆谩｀邕蛩{(TT)和DS均為美國Ares公司產品，處理細胞時，DS濃度0.1%(實驗證實該濃度對細胞生長無影響)。DE培養(yǎng)基(DulbedifiedEagleediu

8、)、0.25%胰酶為美國GIB公司產品，碘化丙啶(prpidiuidine，PI)為美國Siga公司產品。1.2細胞培養(yǎng)人胰腺癌IAPaa-2細胞在5%2，37條件下，用含10%小牛血清、1%L-谷氨酰胺、100Ul-1青霉素、100gl-1鏈霉素的DE培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)至70%80%交融時，用0.25%胰酶消化傳代繼續(xù)培養(yǎng)。1.3TT法檢測Res處理后IAPaa-2細胞的增殖抑制率胰腺癌IAPaa-2細胞用0.25%胰酶消化后，調整細胞濃度為1105/l，重新接種到96孔培養(yǎng)板上，約1104/孔，于37過夜，使細胞貼壁生長，培養(yǎng)至細胞約70%交融。然后，將細胞分Res處理組、溶劑對照組及空

9、白對照組：Res組分別換用含不同濃度Res(25lL-1、50lL-1、100lL-1、200lL-1)的培養(yǎng)液100l；溶劑對照組換用100l含與Res相應濃度DS的培養(yǎng)液；含100l培養(yǎng)液(不含細胞與藥物)孔板作為空白對照組。每組設3復孔。分別培養(yǎng)12h、24h、48h、72h后，參加TT(5gl-1)20l/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，去上清，參加DS100l/孔，室溫振蕩10in，上酶標免疫測定儀檢測，492n波長測定吸光度值(absrbane，A)。比色時，空白組調零。計算細胞增殖抑制率，抑制率=(1-處理組A/溶劑對照組A)100%。繪制不同時間濃度-抑制率曲線。以上實驗重復3次。1.4形

10、態(tài)學觀察1.4.1倒置光學顯微鏡觀察：胰腺癌IAPaa-2細胞用0.25%胰酶消化后，調整細胞濃度為1105/l，重新接種到96孔培養(yǎng)板上，為1104/孔，于37過夜，使細胞貼壁生長，培養(yǎng)至細胞約70%交融。將細胞分Res組和對照組：Res組分別換用含不同濃度Res(25lL-1、50lL-1、100lL-1、200lL-1)的培養(yǎng)液100l，對照組含不加藥物培養(yǎng)液100l。于5%2、37條件下分別繼續(xù)培養(yǎng)48hr后，倒置光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變并攝片。1.4.2透射電鏡觀察：胰腺癌IAPaa-2細胞用0.25%胰酶消化后，接種到6孔培養(yǎng)板上，于37過夜，使細胞貼壁生長，培養(yǎng)至細胞約70%

11、交融。將細胞分Res組和對照組：Res組換用含25lL-1、50lL-1、100lL-1、200lL-1Res的培養(yǎng)液，對照組含不加藥物培養(yǎng)液。5%2、37條件下分別繼續(xù)培養(yǎng)48h后，分別搜集對照組、Res處理組的細胞，送湘雅醫(yī)學院電鏡中心檢測。1.5流式細胞儀檢測細胞凋亡率胰腺癌IAPaa-2細胞用0.25%胰酶消化后，重新接種到6孔培養(yǎng)板上，于37過夜，使細胞貼壁生長，培養(yǎng)至細胞約70%交融。將細胞分Res組和對照組：Res組換用含不同濃度Res(25lL-1、50lL-1、100lL-1、200lL-1)的培養(yǎng)液，對照組含不加藥物培養(yǎng)液。5%2、37條件下分別繼續(xù)培養(yǎng)48h后，搜集對照組

12、、25lL-1、50lL-1、100lL-1、200lL-1Res處理組細胞(1106)，加預冷70%乙醇固定過夜，用PI染色。流式細胞儀檢測，ultiyle軟件分析結果。1.6統(tǒng)計學處理方法單處理因素組間多樣本均數的多重比擬采用單因素方差分析,并用LSD-t檢驗進展樣本均數間兩兩比擬；多處理因素采用析因設計的方差分析，并用單因素方差分析和LSD-t檢驗進展樣本均數間兩兩比擬，用SPSS10.0軟件分析結果。2結果2.1TT比色法檢測細胞增殖抑制率分別用25lL-1、50lL-1、100lL-1、200lL-1處理IAPaa-2細胞12h、24h、48h、72h后，酶標儀測定A值結果后,計算增

13、殖抑制率，詳細結果見圖1。用兩因素析因設計方差分析后，結果顯示：不同濃度Res對胰腺癌IAPaa-2細胞增殖抑制率不同(F=526.12，P=0.000)；Res不同作用時間對胰腺癌細胞增殖抑制率不同(F=805.27，P=0.000)。并用單因素方差分析和LSD-t檢驗進展樣本均數間兩兩比擬，結果分析示：除100lL-1與200lL-1分別處理12h或72h抑制率差異無統(tǒng)計學意義外，其余各組在同一時間或同一濃度范圍內，組間兩兩差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)?？梢奟es體外對IAPaa-2細胞有明顯抑制作用,且在一定范圍內根本上呈濃度、時間依賴性。2.2形態(tài)學觀察2.2.1倒置光學顯微鏡：對

14、照組細胞貼壁生長良好，細胞充分生長，透光度好。25lL-1Res外理IAPaa-2細胞48h后，倒置顯微鏡觀察見極少量細胞變圓，核濃縮，隨著藥物作用濃度的增加，核濃縮細胞數量增多，細胞間隙增大，細胞數目減少，提示可能存在細胞凋亡，詳見圖2。2.2.2透射電鏡觀察：對照組細胞核大，圓形或橢圓形，形態(tài)較規(guī)那么，染色質分布均勻,胞漿內有豐富的細胞器(見圖3A)。25lL-1Res處理48h后，電鏡下見少數細胞出現(xiàn)細胞體積縮小，內容物濃縮，核體積變小，染色質聚集變粗，成塊靠邊，細胞器濃縮，細胞外表有突起，但細胞膜尚完好(見圖3B)；隨著藥物濃度增大,電鏡示細胞染色質更加密集，核碎裂增多及大量典型凋亡小

15、體產生(見圖3、圖3D)。結果見圖3。2.3流式細胞儀檢測凋亡率結果示對照組細胞凋亡率為(2.400.50)%，25lL-1、50lL-1、100lL-1、200lL-1Res處理48h后細胞凋亡率分別為(4.601.25)%，(12.770.825)%，(23.402.50)%，(25.402.46)%，詳見表1。各組均數比擬的單因素方差分析得F=107.50，P=0.000，用LSD-t檢驗進展樣本均數間兩兩比擬示各處理組與對照組之間差異具有顯著性(P0.05)，25lL-1、50lL-1、100lL-1Res處理組凋亡率兩兩差異皆有顯著性(P0.05)，而100lL-1與200lL-1R

16、es處理組之間凋亡率差異無統(tǒng)計學意義。3討論3.1Res的分子構造及生物學作用Res的化學名為芪三酚(3，5，4-trihydrxystibene)，分子式是14H123，相對分子量為228.25，屬于非黃酮類多酚化合物，于1940年首次從毛葉藜蘆(veratrugrandiflru)的根局部離獲得。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Res廣泛存在多種植物中，以中藥植物虎杖中含量較為豐富。研究還證實，Res對人體具有調節(jié)脂類代謝、防止低密度脂蛋白氧化、去除自由基、抑制血小板聚集、保護心腦血管和抗炎、抗過敏與抗腫瘤等多種藥理作用6；而且，Res為天然化合物,無毒副作用,故其藥用價值極大，已引起了全世界科研人員的

17、高度關注。本研究通過觀察Res對胰腺癌IAPaa-2細胞體外增殖的影響并討論其初步機制,旨在進一步認識該藥的藥理作用，為進一步利用開發(fā)該類藥物提供實驗根據。3.2Res對IAPaa-2細胞的增殖的影響腫瘤對藥物敏感的實驗分為體內實驗和體外實驗兩種，體外實驗是體內實驗的基矗本實驗通過TT法檢測到Res對IAPaa-2細胞有顯著增殖抑制作用，25lL-1Res對胰腺癌IAPaa-2細胞增殖抑制作用已經相當明顯，作用72h平均抑制率已達29.48%；當濃度進步到200lL-1時，作用24h、48h、72h其平均抑制率分別為45.41%，58.17%，76.04%。可見Res對胰腺癌IAPaa-2細胞

18、的增殖抑制作用根本上呈時間、濃度依賴性。本實驗為了進一步為Res體外對IAPaa-2細胞的增殖抑制作用提供形態(tài)學支持并討論其初步作用機制，采用倒置顯微鏡和透射電鏡對細胞形態(tài)進展了觀察，結果證實Res作用后，胰腺癌細胞數目減少，并存在明顯的細胞凋亡。而且，25lL-1、50lL-1、100lL-1Res組凋亡率呈濃度依賴性(P0.05)(100lL-1與200lL-1Res處理組之間凋亡率無差異可能是因為大量Res作用后局部凋亡細胞出現(xiàn)自溶或繼發(fā)壞死,導致凋亡細胞比例不再增加)。綜上所述，Res體外可顯著抑制胰腺癌IAPaa-2細胞的增殖，誘導凋亡是Res抑制胰腺癌IAPaa-2細胞增殖的重要機制，且誘導凋亡作用呈濃度依賴性。凋亡是細胞自身調節(jié)的一個程序性死亡過程，它不引起炎癥反響，機體亦不會因此而引發(fā)不良現(xiàn)象。Res誘導胰腺癌IAPaa-2細胞凋亡進一步說明，它對治療胰腺癌可能有著很好的應用前景；而且，由于Res是天然化合物,在自然界分布極廣，目前體內實驗又未發(fā)現(xiàn)任何毒副作用,為理想的天然抗癌藥物。目前有關Res抗癌作用的機制研究進展很快，但多數還限于實驗室階段，如能徹底理解其抗癌機制，將會使該藥物有更廣闊的臨床