2022年偽狂犬病活疫苗

1、偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61 株）生產(chǎn)工藝規(guī)程編制人 ：年 月 日審核人 ：年 月 日批準(zhǔn)人 ：年 月 日目 錄一、目 的：偽狂犬病活疫苗（ Bartha-K61 株）生產(chǎn)工藝規(guī)程的方法和程序；二、適用范疇：適用于偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61 株）的生產(chǎn)的全過程三、依 據(jù)：偽狂犬病活疫苗（ Bartha-K61 株）制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程四、責(zé) 任 者：生產(chǎn)車間、質(zhì)管部；五、正 文： 工藝流程及質(zhì)量掌握要點(diǎn) 操作細(xì)就1、制苗材料的制備2、生產(chǎn)用種毒的制備3、半成品的配制4、配苗5、疫苗的分裝6、疫苗的凍干7、軋蓋貼標(biāo)8、包裝 成品檢驗(yàn) 工藝衛(wèi)生與人員衛(wèi)生 生產(chǎn)設(shè)備一覽表 包裝機(jī)檢查

2、方法 物料平穩(wěn) 勞動(dòng)定員及勞動(dòng)愛護(hù)吉林和元生物工程有限公司GMP治理文件題目偽狂犬病活疫苗 （Bartha-K61 株）生產(chǎn)編碼：共 13 頁工藝規(guī)程SOP-SC- - 制定審核批準(zhǔn)制定日期審核日期批準(zhǔn)日期頒發(fā)部門 辦公室 頒發(fā)數(shù)量 生效日期分發(fā)單位 辦公室、生產(chǎn)技術(shù)部、質(zhì)管部一、目 的：規(guī)定制造偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61 株）的方法和程序；二、適用范疇：適用于偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61 株）的生產(chǎn)的全過程三、依 據(jù)：偽狂犬病活疫苗（ Bartha-K61 株）制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程四、責(zé) 任 者：生產(chǎn)車間、質(zhì)管部；五、正 文：【品 名】偽狂犬病活疫苗（ Bartha-K61

3、株）【質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)】本企業(yè)偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61 株）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)【外 觀】本品為淡黃色海綿狀疏松團(tuán)塊,易與瓶壁脫離,加稀釋液后快速溶解；【規(guī) 格】10 頭份/ 瓶、 20 頭份 / 瓶、 70 頭份/ 瓶【儲(chǔ) 藏】在-15 以下,有效期暫定為 18 個(gè)月【作用與用途】用于高致病性豬繁衍與呼吸綜合征；免疫期為 4 個(gè)月；【用法與用量】1 按瓶簽注明的頭份加生理鹽水稀釋,耳根后部肌肉注射；【成品代碼 】2 仔豬斷奶前免疫1 次,1 頭份 / 頭；3 母豬配種前免疫1 次,1 頭份 / 頭；C 【批量】40000 瓶I 工藝流程及質(zhì)量掌握要點(diǎn)雞胚成纖維細(xì)胞制及 接種種毒制旋轉(zhuǎn)培收獲不合半成品

4、檢驗(yàn)配合苗 格無 害 化 處分裝凍干軋蓋貼標(biāo)包合 格 入 成入待檢成品檢不合格入報(bào)廢品銷售無 害 化 處 理偽狂犬病活疫苗（ Bartha-K61 株）質(zhì)量掌握要點(diǎn)II 工序質(zhì)量掌握要點(diǎn)質(zhì)量掌握項(xiàng)目頻次毒種制備種毒無菌檢驗(yàn)每批病毒含量每批細(xì)胞制備消化時(shí)間、溫度每批細(xì)胞外源病毒檢驗(yàn)每批毒液制備接種接 種 量每批觀察細(xì)胞再生狀況每批無菌檢驗(yàn)每批配苗半成品檢驗(yàn)病毒含量每批半成品、愛護(hù)劑無菌檢驗(yàn)每批配苗比例每批分裝分裝過程無菌檢驗(yàn)分裝過程中前、中、后檢驗(yàn)分 裝 量間隔半小時(shí)標(biāo)定分裝量?jī)龈蓛龈汕€共融點(diǎn)、真空度每批成品檢驗(yàn)成品理化指標(biāo)每批無菌檢驗(yàn)每批鑒別檢驗(yàn)每批效力檢驗(yàn)每批操作細(xì)就安全檢驗(yàn)每批外源病毒檢

5、驗(yàn)每批支原體檢驗(yàn)每批本品系用偽狂犬病病毒弱毒株接種于雞胚成纖維細(xì)胞收成感染病毒液,加相宜穩(wěn)固劑,經(jīng)冷凍干燥制成,用于預(yù)防豬、牛及綿羊偽狂犬病；1 制苗材料的制備1.1 條件預(yù)備1.1.1 依據(jù)細(xì)胞制備所需物品及設(shè)備條件,進(jìn)行全面預(yù)備；1.1.2 按使用時(shí)間,提前做好滅菌工作后將預(yù)備好的各種物品提前移入干凈工作間待用；1.1.3 在工作開頭前 3040min,按凈化級(jí)別要求調(diào)整送風(fēng)量,達(dá)到干凈級(jí)別要求；1.2 操作規(guī)章1.2.1 細(xì)胞的制備發(fā)育良好的 910 日齡 SPF雞胚；挑選 910 日齡發(fā)育良好的 SPF雞胚,先用碘酒棉消毒蛋殼氣室部位,無菌取出雞胚,去頭、四肢和內(nèi)臟,放入滅菌的玻璃器皿

6、中,用漢克氏液洗滌胚體,用滅菌剪刀剪成米粒大小的組織塊,再用漢克氏液洗滌23 次,然后加 0.25%胰酶溶液（每胚 4ml）,37.5 38.5 消化 2030 分鐘,吸出胰酶溶液,用漢克氏液洗滌 23 次再加入適量的養(yǎng)分液（用含 5%10%犢牛血清乳漢液,加相宜的抗生素適量）吹打,用 46 層紗布過濾,制成每 1ml 含活細(xì)胞數(shù)約 100150 萬的細(xì)胞懸液,分裝于培育瓶中進(jìn)行培育,形成單層后備用；細(xì)胞培育物應(yīng)無細(xì)菌、霉菌（見無菌（純粹）檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程）和支原體（見支原體檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 ）污染,無特異性病變；將細(xì)胞凍融液接種 Marc-145 細(xì)胞,應(yīng)不顯現(xiàn)任何病變 （見外源病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

7、操作規(guī)程 ）；1.3 清場(chǎng)和記錄1.3.1 工作終止后,應(yīng)全面清場(chǎng),對(duì)工作間、所用器具、玻璃器皿、物料及廢棄物等應(yīng)按規(guī)定分別進(jìn)行處理；1.3.2 全面填寫生產(chǎn)工序記錄 ；2 生產(chǎn)用毒種的制備2.1 條件預(yù)備 2.1.1 依據(jù)毒種制備所需物料及設(shè)備條件,進(jìn)行全面預(yù)備； 2.1.2 按使用時(shí)間,將預(yù)備好的各種物品提前移入干凈工作間待用； 2.1.3 在工作開頭前 3040min,按凈化級(jí)別要求調(diào)整送風(fēng)量,達(dá)到干凈級(jí)別要求； 2.2 操作規(guī)章 2.2.1 制苗用病毒液的制備2.2.2.1 細(xì)胞單層培育 將擴(kuò)大培育的種子細(xì)胞接種到轉(zhuǎn)瓶中培育,掌握轉(zhuǎn)速 912轉(zhuǎn)/ 小時(shí)；接種 取所需數(shù)量的、細(xì)胞掩蓋率達(dá)

8、到 80%以上的細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶,棄去生長(zhǎng)液,按 2（V/V）接種病毒,加入含 2%胎牛血清的細(xì)胞培育液, 37 C 旋轉(zhuǎn)（ 912轉(zhuǎn)/ 小時(shí)）培育；收成在顯微鏡下觀看由病毒引起的細(xì)胞病變（CPE）,直至 CPE達(dá)到 70%以上收成細(xì)胞培育物,反復(fù)凍融 1 次,經(jīng)離心或過濾除去細(xì)胞碎片,凍存于 2.2.2 毒種鑒定 毒標(biāo)準(zhǔn)- 40 C 以下；2.2.2.2病毒含量將毒種用無血清培育基做10 倍系列稀釋,取 10-4、10-5、10-6、10-74 個(gè)稀釋度,分別接種于 96 孔細(xì)胞板, 每個(gè)稀釋度接種6 孔,每孔 0.1mL,設(shè)置正常的細(xì)胞對(duì)找孔,放置 5%CO 2,37下培育觀看 35日,依據(jù) Re

9、ed-Muench法運(yùn)算 TCID50；病毒含量應(yīng) 10 7.0TCID50；2.2.2.3 鑒別檢驗(yàn)中和試驗(yàn)： 將毒種用無血清培育基稀釋成10 3TCID50/mL,取 0.1mL與等量呼吸綜合征病毒特異性陽性血清混合,同時(shí)設(shè)病毒對(duì)比組和正常細(xì)胞對(duì)比組,37作用 1 小時(shí)后,接種Marc-145 細(xì)胞培育板,觀看 5 日；應(yīng)不產(chǎn)生細(xì)胞病變（ CPE）；1.2.2.2 病毒基因鑒定 應(yīng)用以下引物進(jìn)行 RT-PCR檢測(cè),毒種可擴(kuò)增出 581bp的特異性條帶,以而豬繁衍與呼吸綜合征病毒 NVDC-JXA1-R株為代表的高致病性豬繁衍與呼吸綜合征病毒以及其他豬繁衍與呼吸綜合征病毒核酸為陰性（豬繁衍與

10、呼吸綜合征病毒 JXA1-R 株 RT-PCR檢測(cè)方法見附注 3）；U1 ATTTGAATGTTCGCACGGTCTC D2 CGGAACCATCAAGCACAACTCT 毒力對(duì)仔豬的毒力 用 JXA1-R-R 株毒種（ 10 6.0TCID50/mL）接種 46 周齡抗原豬繁衍與呼吸綜合征病毒、抗體陰性仔豬（陰性豬標(biāo)準(zhǔn)見附注 1）5 頭,每頭頸部肌肉注射 2mL,同時(shí)設(shè) 5 頭陰性豬作對(duì)比,隔離飼養(yǎng)；接種豬逐日測(cè)量體溫,觀看臨床癥狀,均不發(fā)?。òl(fā)病豬判定標(biāo)準(zhǔn)見附注 2）；對(duì)妊娠母豬的毒力 用 JXA1-R-R株毒種（ 10 6.0TCID50/mL）接種懷孕 8090 天的母豬3 頭,每頭頸

11、部肌肉注射 2mL,同時(shí)設(shè)同期懷孕母豬 3 頭做對(duì)比,隔離飼養(yǎng),觀看母豬臨床癥狀和分娩產(chǎn)仔狀況；懷孕母豬應(yīng)不發(fā)生流產(chǎn),所產(chǎn)仔豬的存活率與未接種對(duì)比組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；免疫原性 取 46 周齡豬繁衍與呼吸綜合征病毒抗原、抗體陰性豬（陰性豬標(biāo)準(zhǔn)見附注 1）10 頭,其中 5 頭肌肉注射 JXA1-R-R 株毒種 2mL（10 5.0TCID50/mL）,另 5 頭作為對(duì)比,同條件下隔離飼養(yǎng)； 28 日后,全部豬肌肉注射檢驗(yàn)用強(qiáng)毒NVDC -JXA1株病毒培育液（病毒含量10 4.5TCID50/mL）3mL,每天測(cè)溫并觀看21 日；對(duì)比豬均應(yīng)發(fā)病,且至少2 頭死亡,免疫豬應(yīng)至少 4 頭愛護(hù)（發(fā)病豬判定

12、標(biāo)準(zhǔn)見附注） ；2.2.2.6 純潔 按現(xiàn)行中國獸藥典進(jìn)行檢驗(yàn),應(yīng)無細(xì)菌、霉菌、支原體和外源病毒污染；2.2.3 基礎(chǔ)種子代數(shù) 8290 代；2.2.4 種毒儲(chǔ)存 -70下,儲(chǔ)存期暫定為 12 個(gè)月；2.2.5 強(qiáng)毒標(biāo)準(zhǔn)病毒含量將毒種用無血清培育基做10 倍系列稀釋,取10-3、10-4、10-5、10-64 個(gè)稀釋度,分別接種于 96 孔細(xì)胞板,每個(gè)稀釋度接種6 孔,每孔 0.1mL,在 37下培育觀看 57日,根據(jù) Reed-Muench法運(yùn)算 TCID50；病毒含量應(yīng) 10 5.5TCID50/mL；對(duì)豬的毒力 取 810 周齡的豬繁衍與呼吸綜合征病毒抗原抗體陰性豬（陰性豬標(biāo)準(zhǔn)見附注1）

13、5 頭,每頭豬肌肉注射檢驗(yàn)用強(qiáng)毒NVDC-JXA1-R（10 4.55.0 TCID50/mL）3mL,每天測(cè)溫并觀看21 日；豬均應(yīng)發(fā)病,且至少 2 頭死亡；1.3.3 毒種代次 5 6 代；2.2.6 毒種儲(chǔ)存在- 70以下,儲(chǔ)存期暫定為12 個(gè)月；3 細(xì)胞系病毒培育用細(xì)胞為 Marc-145,由中國動(dòng)物疫病預(yù)防掌握中心鑒定、保管和供應(yīng)；3.1 細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)3.1.1 細(xì)胞形狀用含 8犢牛血清的 DMEM細(xì)胞培育液,37、5CO 2培育 2h 即可貼壁,24h內(nèi)可長(zhǎng)成單層；顯微鏡下,細(xì)胞呈三角形、多角形、圓形等多種形狀；3.1.2 外源病毒檢驗(yàn)3 取 2 個(gè)細(xì)胞單層,每個(gè)單層至少6cm 2,培

14、育 7 天,每日觀看細(xì)胞,應(yīng)無細(xì)胞病變；3.1.2.2 血吸附病毒檢驗(yàn) 按現(xiàn)行中國獸藥典進(jìn)行檢驗(yàn),應(yīng)無紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象；3.1.2.3 其它特定病毒的檢驗(yàn) 采納 PCR或 RT-PCR方法檢測(cè),應(yīng)無 BVDV、PCV、CSFV、PPV、PRV和 JEV污染；3.1.3 胞核學(xué)檢查對(duì)不同傳代水平的細(xì)胞,取50 個(gè)處于有絲分裂中期的細(xì)胞進(jìn)行檢查；在基礎(chǔ)細(xì)胞庫細(xì)胞中存在的染色體標(biāo)志,在最高代次細(xì)胞中也應(yīng)存在；與基礎(chǔ)細(xì)胞庫的細(xì)胞相比,全部細(xì)胞的染色體模式數(shù)不得高出15%；核型必需相同；3.1.4 致瘤性檢驗(yàn)用無胸腺小鼠至少10 只,各皮下或肌肉注射10 7個(gè)待檢細(xì)胞,同時(shí)用 Hela細(xì)胞皮下或肌肉注射無

15、胸腺小鼠,每只10 6 個(gè)細(xì)胞,作為陽性對(duì)比,用雞胚成纖維細(xì)胞作為陰性對(duì)比；觀看 21 日, Marc-145 細(xì)胞應(yīng)無腫瘤形成,陽性對(duì)比組應(yīng)顯現(xiàn)明顯的腫瘤,陰性對(duì)比組應(yīng)為陰性；3.1.5 無菌檢驗(yàn) 按現(xiàn)行中國獸藥典進(jìn)行檢驗(yàn),應(yīng)無菌生長(zhǎng)；3.1.6 支原體檢驗(yàn) 按現(xiàn)行中國獸藥典進(jìn)行檢驗(yàn),應(yīng)無支原體生長(zhǎng)；3.2 細(xì)胞代次 基礎(chǔ)細(xì)胞應(yīng)為 110 代,工作細(xì)胞代次應(yīng)為 1025代,生產(chǎn)用細(xì)胞應(yīng)在 40 代以內(nèi)；3.3 儲(chǔ)存液氮儲(chǔ)存；儲(chǔ)存期36 個(gè)月；4 疫苗制造及半成品檢驗(yàn)4.1 生產(chǎn)用毒種制備4.1.1 毒種繁衍 將已長(zhǎng)成單層的 Marc-145 細(xì)胞倒去生長(zhǎng)液,換以含 2毒種的細(xì)胞維護(hù)液,置 3

16、7下培育 23 天,當(dāng) 70以上細(xì)胞顯現(xiàn)病變時(shí)收成,置 然后進(jìn)行鑒定；- 40凍融 1 次,離心后分裝,45 項(xiàng)進(jìn)行,應(yīng)符合規(guī)定；符合上述標(biāo)準(zhǔn)的毒種作為生產(chǎn)用毒種；4.1.3 毒種儲(chǔ)存在- 70下儲(chǔ)存,應(yīng)不超過12 個(gè)月；4.1.4 毒種繼代應(yīng)不超過 3 代；4.2 清場(chǎng)和記錄4.2.1 工作終止后,應(yīng)全面清場(chǎng),對(duì)工作間、所用器具、玻璃器皿、物料及廢棄物等應(yīng)按規(guī)定分別進(jìn)行處理；4.2.2 全面填寫生產(chǎn)記錄 ；5 半成品的制備5.1 條件預(yù)備5.1.1 依據(jù)毒液繁衍所需物料及設(shè)備條件,進(jìn)行全面預(yù)備；5.1.2 按使用時(shí)間,將預(yù)備好的各種物品提前移入干凈工作間待用；5.1.3 在工作開頭前 304

17、0min,按凈化級(jí)別要求調(diào)整送風(fēng)量,達(dá)到干凈級(jí)別要求；5.2 操作規(guī)章5.2.1 接種 取所需數(shù)量的、細(xì)胞掩蓋率達(dá)到 80%以上的細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶,棄去生長(zhǎng)液,按 2（V/V）接種病毒,加入含 2%胎牛血清的細(xì)胞培育液, 37 C 旋轉(zhuǎn)（ 912轉(zhuǎn)/ 小時(shí)）培育；5.2.2 收成 在顯微鏡下觀看由病毒引起的細(xì)胞病變（CPE）,直至 CPE達(dá)到 70%以上收成細(xì)胞培育物,反復(fù)凍融 1 次,經(jīng)離心或過濾除去細(xì)胞碎片,凍存于- 40 C 以下；5.3 半成品檢驗(yàn)5.3.1 檢驗(yàn),病毒含量應(yīng) 10 7.0TCID50/mL；5.3.2 無菌檢驗(yàn) 按現(xiàn)行中國獸藥典進(jìn)行檢驗(yàn),應(yīng)無菌生長(zhǎng)；5.4 清場(chǎng)和記錄5.4.

18、1 工作終止后,應(yīng)全面清場(chǎng),對(duì)工作間、所用器具、玻璃器皿、物料及廢棄物等應(yīng)按規(guī)定分別進(jìn)行處理；5.4.2 全面填寫生產(chǎn)記錄 ；6 配苗6.1 條件預(yù)備6.1.1 依據(jù)配苗所需物料及設(shè)備條件,進(jìn)行全面預(yù)備；6.1.2 按使用時(shí)間,將預(yù)備好的各種物品提前移入干凈工作間待用；6.1.3 在工作開頭前 3040min,按凈化級(jí)別要求調(diào)整送風(fēng)量,達(dá)到干凈級(jí)別要求；6.1.4 將檢驗(yàn)合格的半成品于配苗前取出,融解待用；6.2 操作規(guī)章6.2.1 配制將經(jīng)檢驗(yàn)合格的病毒液按比例添加蔗糖脫脂乳凍干愛護(hù)劑,充分混合勻稱；6.3 清場(chǎng)和記錄6.3.1 工作終止后,應(yīng)全面清場(chǎng),對(duì)工作間、所用器具、玻璃器皿、物料及廢

19、棄物等應(yīng)按規(guī)定分別進(jìn)行處理；6.3.2 全面填寫生產(chǎn)記錄 ；7 疫苗的分裝操作內(nèi)容見分裝崗位標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 ；8 疫苗的凍干操作內(nèi)容見凍干標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 ；7 軋蓋、貼標(biāo)操作內(nèi)容見軋蓋標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 、貼標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 ；8 包裝操作內(nèi)容見包裝標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程III 成品檢驗(yàn)見偽狂犬病活疫苗（ Bartha-K61 株）制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程、工藝衛(wèi)生與人員衛(wèi)生1 定期對(duì)干凈室進(jìn)行消毒,并依據(jù)沉降菌測(cè)定結(jié)果打算消毒周期；2 操作間的衛(wèi)生按各自區(qū)域的清潔消毒規(guī)程進(jìn)行；3 生產(chǎn)設(shè)備按各自清潔規(guī)程進(jìn)行清潔消毒；4 原輔料進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)按規(guī)定程序進(jìn)行清潔消毒；5 人員進(jìn)入干凈區(qū)時(shí),必需按規(guī)定進(jìn)行人凈；進(jìn)入干凈區(qū)程序：更

20、鞋脫外 衣穿一般工作服更鞋脫一般工作服洗手穿干凈服手消毒進(jìn)入十萬 級(jí)干凈區(qū)更鞋手消毒套干凈服手消毒進(jìn)入萬級(jí)干凈區(qū)；6 人員在生產(chǎn)區(qū)內(nèi)按區(qū)域個(gè)人衛(wèi)生要求進(jìn)行治理；萬級(jí)區(qū)工 7 一般區(qū)工作服每三天清洗一次,十萬級(jí)區(qū)工作服每天清洗一次,作服每班清洗一次, 萬級(jí)干凈區(qū)使用的工作服在清洗后進(jìn)行滅菌,活毒操作區(qū)的工 作服須經(jīng)滅菌后才能進(jìn)行清洗；8 干凈室溫度掌握在 1826,相對(duì)濕度掌握在 30-65%；干凈區(qū)與非干凈 5 帕；區(qū)的靜壓差應(yīng) 10 帕；不同級(jí)別的相鄰干凈區(qū)間壓差應(yīng)9 每批生產(chǎn)完畢,都應(yīng)按清場(chǎng)治理規(guī)程進(jìn)行清場(chǎng)； 更換產(chǎn)品應(yīng)進(jìn)行完全清場(chǎng)；、生產(chǎn)設(shè)備一覽表主要生產(chǎn)設(shè)備及生產(chǎn)才能一覽表編號(hào)設(shè) 備 名 稱