復(fù)旦藥學(xué)專業(yè)課課件相關(guān)專業(yè)復(fù)試看藥物分析定量分析

1、第四章 藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證（二） 干法破壞1、高溫?zé)胱品▽⒂袡C(jī)物灼燒灰化以達(dá)分解的目的。將適量樣品置于瓷坩堝或鉑坩堝中，加入無水碳酸鈉、氫氧化鈣或輕質(zhì)氧化鎂等以助灰化，混勻后，先小火加熱使樣品完全炭化，然后高溫灼燒，使其完全灰化。本法適用于濕法不易破壞完全的藥物以及不能用硫酸進(jìn)行破壞的有機(jī)藥物。2、氧瓶燃燒法(oxygen flask combustion method)系指將有機(jī)藥物放入充滿氧氣的密閉的燃燒瓶中進(jìn)行燃燒，并將燃燒所產(chǎn)生的待測物質(zhì)吸收于適當(dāng)?shù)奈找褐?，然后根?jù)待測物質(zhì)的性質(zhì)，采用適宜的分析方法進(jìn)行鑒別，檢查或含量測定。適用于含鹵素、硫、氮、硒等有機(jī)藥物的分析本法簡便、快

2、速、破壞完全，尤其用于微量樣品分析基本原理有機(jī)物充O2燒瓶燃燒產(chǎn)物吸收液 分析儀器裝置和設(shè)備（1）燃燒瓶（2）稱樣材料及稱樣方法 無灰濾紙：適用于固體樣品 紙袋：適用于液體樣品（3）氧氣：采用鋼瓶氧氣，防止導(dǎo)氣管污染。（4）吸收液 作用：定量吸收供試品的燃燒分解產(chǎn)物，使其轉(zhuǎn)變?yōu)楸阌跍y定的價(jià)態(tài)。 選擇原則：被測物質(zhì)的種類及所用分析方法。藥物破壞后吸收液定量方法含氟氟化氫水茜素氟藍(lán)比色法含氯氯化氫NaOH水溶液銀量法含溴溴+溴化氫NaOH水溶液+還原劑SO2銀量法含碘各種價(jià)態(tài)碘NaOH水溶液+還原劑SO2銀量法含硫三氧化硫H2O2溶液重量法含磷五氧化二磷水磷鉬藍(lán)比色法含硒四價(jià)硒+少量六價(jià)硒硝酸溶液

3、二氨基萘比色法3、注意事項(xiàng)：（1）燃燒瓶：大小適宜、干凈、有防爆措施（2）氧氣要充足：燃燒完全（不得有黑色炭化物）（3）產(chǎn)生煙霧應(yīng)完全被吸收：充分振搖煙霧顏色：碘，紫色；溴，紅棕色；氟、氯,白（4）測定氟化物：石英制燃燒瓶 正確選用燃燒瓶的目的在于：樣品能在足夠的氧氣中燃燒分解完全；有利于將燃燒分解產(chǎn)物較快地吸收到吸收液中；防止爆炸的可能性。 待分解樣品量 燃燒瓶的體積 35mg（微量分析） 150250ml 2030mg（半微量分析） 300500ml 5060mg 1000ml 0.60.7g或更多 2000ml或特殊結(jié)構(gòu)的燃燒瓶第二節(jié) 定量分析方法特點(diǎn)一、容量分析法（一）容量分析法的特點(diǎn)

4、 操作簡單、快速； 比較準(zhǔn)確； 儀器普通易得。1. 滴定度（T）的概念 每1ml滴定液相當(dāng)于被測物質(zhì)的量(mg)2. 滴定度的計(jì)算 aA + bB cC + dD T = Ma/bB3. 百分含量的計(jì)算（原料藥） （1）直接滴定法 D% = V F T/W 100% F = 實(shí)際標(biāo)定的濃度/規(guī)定的濃度 （二）容量分析法的計(jì)算問題（2）生成物滴定法T滴定度，每1ml滴定液相當(dāng)于被測組分的mg數(shù) A% = V F T/W 100%T計(jì)算時(shí)，需考慮A，C，D三者間的化學(xué)劑量關(guān)系A(chǔ) + B C C + D E （D為滴定劑）（3）剩余滴定法T滴定度，每1ml滴定液相當(dāng)于被測組分的mg數(shù) V滴定時(shí)，供試

5、品消耗滴定液的體積（ml） V0滴定時(shí)，空白消耗滴定液的體積（ml）F濃度校正因子 ms供試品的質(zhì)量 例：雙相滴定法測定苯甲酸鈉含量。取本品0.3220g,加水15ml，乙醚30ml與甲基橙3滴，用0.1062mol/L鹽酸滴定，至水層顯橙紅色，分取水層，置具塞錐形瓶中，加乙醚20ml，振搖，繼續(xù)滴定至持續(xù)橙紅色，消耗鹽酸體積21.00ml。計(jì)算鹽酸滴定液的滴定度？樣品中苯甲酸鈉含量？苯甲酸鈉分子量144.1。99.80%片劑含量測定結(jié)果的計(jì)算 例：煙酸片含量測定 取本品10片,精密稱定為3.5840g,研細(xì),精密稱取0.3729g,置100 mL錐形瓶中,置水浴加熱溶解后,放冷.加酚酞指示劑

6、3滴,用氫氧化鈉滴定液（0.1005mol/L),滴定至粉紅色,消耗25.02 mL.每1mL氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)12.31mg的煙酸. 求供試品中煙酸的標(biāo)示百分含量（標(biāo)示量0.3g/片）標(biāo)示量%=V T F 平均片重W 標(biāo)示量 100 %=25.02 12.31/1000 0.1005/0.10.3584 0.3729 0.3= 99.17%100 %干酵母片含量測定：取本品10片，精密稱定，重5.0160g，研細(xì)，精密稱取片粉0.5001g，凱氏定氮法測定，以2%硼酸溶液50ml為吸收液，甲基紅-溴甲酚綠為指示劑，用硫酸滴定液（0.05mol/L）滴定，消耗硫酸滴定液（F

7、=1.029）14.28ml，空白消耗0.08ml，每1ml硫酸滴定液（0.05mol/L）相當(dāng)于1.401mg的氮，蛋白質(zhì)中氮含量為16%，干酵母片規(guī)格為0.3g，回答下列問題： （1）2%硼酸溶液50ml是否需精密量??？為什么？ （2）若要求相當(dāng)于干酵母0.5g的片粉，根據(jù)上述有關(guān)條件，計(jì)算應(yīng)稱取片粉多少克？ （3）凱氏定氮法中硫酸、無水硫酸鈉、硫酸銅分別起什么作用？ （4）求干酵母片中蛋白質(zhì)含量相當(dāng)于標(biāo)示量的百分含量？42.79% 二、光譜分析法 （一）紫外-可見分光光度法（200nm-760nm) 1. 特點(diǎn) 靈敏度，可達(dá)10-4g/ml-10-7g/ml 準(zhǔn)確度，RSD（%）為2%-

8、5% 儀器價(jià)格低廉操作簡單，易普及，應(yīng)用廣 2. 定量：朗伯-比耳定律 A = E1%1cmCL 3. 儀器校正和檢定波長校正：用汞燈中較強(qiáng)譜線237.38, 253.65, 275.28, 296.73, 313.16, 334.15, 365.02, 404.66, 425.83, 546.07nm與576.96nm或用儀器中氘燈的486.02nm與656.10nm進(jìn)行校正。汞燈譜線吸收度的檢定：用K2CrO7(60mg)+0.005mol/L H2SO4液至1000ml 波長(nm) 235(最小) 257(最大) 313(最小) 350(最大) E1%1cm 124.5 144.0 4

9、8.62 106.6 123.0-126.0 142.8-146.2 47.0-50.3 105.5-108.5雜散光檢查： 試劑 濃度(g/ml) 測定波長 透光率(%) NaI 1.00 220nm 0.8 NaNO2 5.00 340nm 0.8 4. 對溶劑的要求: 220240nm 241250nm 251300nm 300nm以上 溶劑+吸收池A 0.41 0.20 0.10 0.05 5. 測定方法 要求供試品溶液的A應(yīng)在0.3 0.7，狹縫寬度為半峰寬的1/10 常用方法 對照品比較法：Cx=(Ax/Ar)Cr; 含量%=Cx D/W 100 %吸收系數(shù)法： Cx=Ax / (

10、E1%1cm)x 100；含量%= Ax / (E1%1cm )x 100 D/W 100 %計(jì)算分光光度法：VA的三點(diǎn)校正法比色法：加入相應(yīng)的顯色試劑定量計(jì)算方法：（1）對照品比較法（2）吸收系數(shù)法 （二）熒光分光光度法1. 特點(diǎn) 靈敏度高，可達(dá)10-10g/ml-10-12g/ml 在低濃度進(jìn)行測定，防止自熄滅作用,F與C不成正比的情況用基準(zhǔn)物溶液校正儀器靈敏度，防止樣品液熒光衰減 靈敏度高，但干擾因素多制備熒光衍生物，可提高其靈敏度和選擇性用樣品量少 2.熒光分析儀 有二個(gè)單色光器激發(fā)單色光器與發(fā)射單色光器；且激發(fā)光源、樣品池和檢測器成直角。含量測定 常用的方法對照品比較法:Ci = (

11、Ri-Rib)/(Rr-Rrb)Cr Ch.P收載地高辛片、利血平片、洋地黃毒苷片。 （三）色譜分析法 按分離原理分為：吸附；分配；離子交換；排阻色譜 方法分類 按分離方法分為：PC；TLC；柱色譜；GC，HPLC。 （一）HPLC法 1. 對HPLC儀器一般要求 色譜柱、流動相按品種項(xiàng)下要求。 色譜柱的理論板數(shù)：n = 5.54(tR /Wh/2)2 分離度：R = 2（tR2 tR1)/(W1 + W2); 要大于1.5 重復(fù)性：RSD2% 拖尾因子：T = W0.05h/2d1 應(yīng)在0.95 1.05 2. 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中主成分含量3. 測定方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線法

12、 外標(biāo)法測定供試品中主成分含量 外標(biāo)一點(diǎn)法 含量= CRAXAR 外標(biāo)一點(diǎn)法：一種濃度對照物對比樣品中待測組分含量前提：截距接近0，對照品濃度與待測組分濃度接近內(nèi)標(biāo)法：對內(nèi)標(biāo)物要求：a內(nèi)標(biāo)物須為原樣品中不含組分b內(nèi)標(biāo)物與待測物保留時(shí)間應(yīng)接近且R1.5c內(nèi)標(biāo)物為高純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，或含量已知物質(zhì)校正因子（f）=AS/CSAR/CR含量（CX）=fAS/CSAX內(nèi)標(biāo)法優(yōu)點(diǎn)：進(jìn)樣量不超量時(shí)，重復(fù)性及操作條件對結(jié)果無影響只需待測組分和內(nèi)標(biāo)物出峰，與其他組分是否出峰無關(guān) 。內(nèi)標(biāo)法缺點(diǎn)：制樣要求高；須尋找合適內(nèi)標(biāo)物外標(biāo)法特點(diǎn)： 不需要校正因子，不需要所有組分出峰 結(jié)果受進(jìn)樣量、進(jìn)樣重復(fù)性和操作條件影響大 每次

13、進(jìn)樣量應(yīng)一致，否則產(chǎn)生誤差 色譜操作：醋酸氫化可的松的含量采用HPLC法測定：取本品對照品適量，精密稱定，加甲醇定量稀釋成每ml約含0.35mg的溶液。精密量取該溶液和內(nèi)標(biāo)溶液（0.30mg/ml炔諾酮甲醇溶液）各5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，取10ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖。 另取本品適量，同法測定，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算含量。已知：對照品取樣為36.2mg，樣品取樣為35.5mg，測得對照液中醋酸氫化可的松和內(nèi)標(biāo)的峰面積分別為5467824和6125843，樣品液中藥物和內(nèi)標(biāo)的峰面積分別為5221345和6122845，計(jì)算本品的含量 5467824/36.2/(612584

14、3/s)=5221345/c2/(6122845/s)含量=C2/35.5*100%97.42%（二）GC法1. 對GC儀器一般要求 色譜柱、流動相、柱溫、載氣、檢測器，均按品種項(xiàng)下要求。2. 測定法 除了HPLC方法外，還有標(biāo)準(zhǔn)加入法。需驗(yàn)證的分析項(xiàng)目1. 鑒別試驗(yàn)；2. 雜質(zhì)定量或限度檢查；3. 原料或制劑中有效成分含量測定；4. 制劑中其它成分（降解產(chǎn)物、防腐劑等）的測定；5. 溶出度、釋放度等功能檢查中的溶出量等的測試方法。 第三節(jié) 藥品分析方法的驗(yàn)證 準(zhǔn)確度 精密度（包括重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性） 專屬性 檢出限 定量限 線性 范圍 耐用性驗(yàn)證內(nèi)容一、準(zhǔn)確度 （Accuracy）

15、是指用該方法測定結(jié)果與真實(shí)值接近的程度，用回收率表示（一）含量測定方法的準(zhǔn)確度 1. 原料藥 可用已知純度對照品或樣品進(jìn)行測定；或與已建準(zhǔn)確 度的另一方法測定的結(jié)果進(jìn)行比較。 2. 制劑 要考察輔料對回收率的影響。采用在空白輔料中加入原 料對照品的方法作回收率試驗(yàn)，然后計(jì)算RSD。 （二）雜質(zhì)定量測定方法：標(biāo)準(zhǔn)加入法或主成分百分含量法；明確表示單個(gè)雜質(zhì)或雜質(zhì)總量相當(dāng)于主成分的重量比或面積比 （三）數(shù)據(jù)要求測定高、中、低三個(gè)濃度（n=3）, 共9個(gè)數(shù)據(jù)來評價(jià)，回收率的RSD2%；用UV和HPLC法時(shí)，一般回收率可達(dá)98%102%；容量法可達(dá)99.7%100.3%。 二、精密度（Precision

16、） 是指在規(guī)定的測試條件下，同一個(gè)均勻樣品，經(jīng)多次測定結(jié)果 之間的接近程度。 （一）精密度表示方法 1. 偏差(deviation , d) d = 測得值-平均值=Xi-X 2. 標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation, SD或S） S =(Xi X)2/(n-1)1/2 3. 相對標(biāo)準(zhǔn)差(relative standard deviation, RSD) RSD=標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值100%=S/X 100%（二）重復(fù)性、中間精密度及重現(xiàn)性 1. 重復(fù)性 在相同條件下,由一個(gè)分析人員測定所得結(jié)果的精密度。 2. 中間精密度 在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，不同時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備測定結(jié)果的精密

17、度。 3. 重現(xiàn)性 在不同實(shí)驗(yàn)室由不同分析人員測定結(jié)果的精密度。 三、專屬性 （Specificity） 是指在其他成分(如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等)可能存在下，采用的方法能準(zhǔn)確測定出被測物的特性。鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢查、含量測定方法，均應(yīng)考察其專屬性。（一）鑒別反應(yīng) 應(yīng)能與其它共存的物質(zhì)或相似化合物區(qū)分，不含被測組分的樣品均應(yīng)呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)。（二）含量測定和雜質(zhì)測定 色譜法和其他分離法，應(yīng)附代表性的圖譜，以說明專屬性。圖中應(yīng)注明各組分的位置，色譜法中分離度應(yīng)符合要求。在能獲得雜質(zhì)的情況下，可加到試樣中，考察對結(jié)果的干擾。在雜質(zhì)和降解物不能獲得的情況下，可用已驗(yàn)證的方法和藥典方法進(jìn)行對照；也可用對試樣加

18、速破壞的方法進(jìn)行驗(yàn)證。 是指試樣中被測物能被檢測出的最低濃度或量，是限度檢驗(yàn)效能指標(biāo)。它無需測定，只要指出高于或低于該規(guī)定的濃度或量即可。 （一）常用的方法1.非儀器分析目視法 用已知濃度被測物，試驗(yàn)出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。2.儀器分析方法 GC和HPLC法： LOD = S/N = 2或3 四、檢測限 （limit of detection，LOD） 是指樣品中被測物能被定量測定的最低量，其測定結(jié)果應(yīng)具一定準(zhǔn)確度和精密度。雜質(zhì)和降解產(chǎn)物進(jìn)行定量測定時(shí)，要求LOQ。 常用信噪比法確定定量限，一般以S/N=10時(shí)，相應(yīng)的濃度進(jìn)行測定。 五、定量限 （limit of quantitat

19、ion，LOQ） 是指在設(shè)定的范圍內(nèi)，測試結(jié)果與試樣中被測物濃度直接呈正比關(guān)系的程度。 UV法：首先制備一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列，濃度點(diǎn)n=5; A=0.3-0.7，建立回歸方程C=aA+b; r0.999。 HPLC法：制備一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列，濃度點(diǎn)n=5-7; 以C對h或A或與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比，建立回歸方程r0.999。 六、線性 （linearity） 是指達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性、測試方法適用的高低限度或量的區(qū)間。原料藥和制劑含量測定：范圍應(yīng)為測試濃度的80%-120%。制劑含量均勻度檢查：范圍應(yīng)為測試濃度的70%-130%。溶出度或釋放度中的溶出量測定：范圍應(yīng)為限度的20%。 七、范圍 （Range） 是指在測定條件有小的變動時(shí)，測定結(jié)果不受影響的承受程度。典型的變動因素有：被測溶液的穩(wěn)定性、樣品提取次數(shù)、時(shí)間等。 HPLC法變動因素有：流動相組成與pH，色譜柱，柱溫，流速等。 GC法變動因素有：色譜柱，固定相，擔(dān)體、柱溫、進(jìn)樣口和檢測器溫度等。 八、耐用性 （durability）分析方法效能指標(biāo)的要求 1、非定量方法：用于鑒別試驗(yàn)、雜質(zhì)的限量檢查，只對專屬性、耐用性和檢測限有要求，其余均無須要求。 2、用于原料藥中主成分或制劑中有效成分含量測定及溶出度測定，除了檢測限和定量限外，其余均要求。 3、雜質(zhì)測定或制劑中降