鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

1、| 文件編號：版本： 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)作業(yè)指導(dǎo)書修訂歷史記錄至多存五版的歷史修訂記錄版本發(fā)行日期文件更改申請編號修改內(nèi)容目的對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)所用的鱟試劑的靈敏度進(jìn)行復(fù)核。職責(zé)質(zhì)量與法規(guī)部負(fù)責(zé)本規(guī)程的起草，QC及相關(guān)人員執(zhí)行本規(guī)程。范圍適用于本公司細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。參考文件2010年版中國藥典二部 附錄 E細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法2010年版中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法及其應(yīng)用第一版，氣象出版社定義鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)：在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度（），用EU/ml表示。當(dāng)使用新批號的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任

2、何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。反應(yīng)終點(diǎn)濃度：指鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)中，系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽性結(jié)果的濃度。設(shè)備/工具及物料 設(shè)備/工具設(shè)備/工具數(shù)顯恒溫水浴箱電熱恒溫水浴鍋電熱干燥箱混勻器水銀溫度計(jì)可調(diào)式移液器無熱原安瓿無熱原吸嘴試管架砂輪封口膜物料 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品 除另有規(guī)定外，使用由中國藥品生物制品檢定所統(tǒng)一發(fā)放的標(biāo)準(zhǔn)品。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml（凝膠法）且對內(nèi)毒素試驗(yàn)無干擾的滅菌注射用水。鱟試劑規(guī)格一般選用0.25 EU/ml。操作步驟提前30 min開啟超凈工作臺，試驗(yàn)操作過程中不要開啟風(fēng)機(jī)，完畢后用75%乙醇

3、擦拭超凈工作臺。試驗(yàn)操作過程應(yīng)防止微生物和細(xì)菌內(nèi)毒素污染。制備細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品1支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸上部劃痕，用75%乙醇擦拭后啟開，避免玻璃屑落入瓶內(nèi)。按照工作標(biāo)準(zhǔn)品說明書，加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解。封口膜封口，置漩渦混合器上混勻15 min后用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水進(jìn)行稀釋，制成2.0 、1.0 、0.5 、0.25 四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。每稀釋一步均應(yīng)在漩渦混合器上混勻30 s。注：在使用過程中，標(biāo)準(zhǔn)品溶液若靜置超10min，必須重新混勻30s再重新使用。試驗(yàn)舉例設(shè)細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品為100 EU/支；待測鱟試劑=0.25 EU/ml。稀釋

4、過程如下：取細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品100 EU/支+1 ml檢查用水 100 EU/ml取0.2 ml 100 EU/ml溶液+1.8 ml檢查用水 10 EU/ml取0.2 ml 10 EU/ml溶液+1.8 ml檢查用水 1 EU/ml取0.9 ml 1 EU/ml溶液+0.9 ml檢查用水 0.5 EU/ml取0.9 ml 0.5 EU/ml溶液+0.9 ml檢查用水 0.25 EU/ml取0.9 ml 0.25 EU/ml溶液+0.9 ml檢查用水 0.125 EU/ml取0.9 ml 0.125 EU/ml溶液+0.9 ml檢查用水 0.0625 EU/ml即得2.0 、1.0 、0.5

5、、0.25 四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。溶解鱟試劑取0.1 ml裝量的鱟試劑18支，安瓿開啟過程同6.2.1工作標(biāo)準(zhǔn)品。每支鱟試劑加入0.1 ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在試管架上按下面的形狀排列。注：在復(fù)溶鱟試劑時(shí)，應(yīng)使用可調(diào)式移液器連接無熱原吸嘴加樣，而不是使用移液管加樣。鱟試劑復(fù)溶后不能放到漩渦混合器上去混合，因?yàn)閺?qiáng)烈混合容易使復(fù)溶后的鱟試劑產(chǎn)生泡沫，影響凝膠的形成。實(shí)際上只需將鱟試劑復(fù)溶后靜置12分鐘鱟試劑就可變澄清。加樣（鱟試劑安瓿排列如下圖）512345第1列每支加入 2.0 濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 ml 第2列每支加入1.0 濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 ml 第3列每支

6、加入 0.5 濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 ml 第4列每支加入 0.25 濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 ml第5列每支加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水0.1 ml，作為陰性對照注：每次加樣濃度必須是從高到低，加不同濃度的樣品需更換新的移液器吸嘴。 加樣結(jié)束后，用封口膜封口，將鱟試劑安瓿中溶液輕輕混勻，應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，連同試管架垂直放入37 1的恒溫水浴箱中，試管架保持水平狀態(tài)，保溫60 min 2 min。使用溫度計(jì)監(jiān)測恒溫水浴箱溫度是否滿足實(shí)驗(yàn)要求，每30分鐘進(jìn)行溫度記錄，記錄表格參見。 判斷及計(jì)算將鱟試劑安瓿從恒溫水浴箱中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者

7、為陽性“”；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁滑落者為陰性“”。注：保溫和拿取鱟試劑安瓿的過程應(yīng)避免受到振動造成假陰性結(jié)果。當(dāng)最大濃度2.0 4管均為陽性，最低濃度0.25 4管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗(yàn)方為有效。按下式計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值（c）。c=lg -1（X/4）式中X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對數(shù)值（lg）。反應(yīng)終點(diǎn)濃度是系列遞減的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液中最后一個(gè)呈陽性結(jié)果的濃度。當(dāng)c在0.5 2 （包括0.5 和2 ）時(shí)，判定該批鱟試劑靈敏度復(fù)核合格，方可用于干擾試驗(yàn)和供應(yīng)品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度。試驗(yàn)舉例如果待復(fù)核的鱟試劑的標(biāo)示靈敏度為0.25 EU/ml，試驗(yàn)結(jié)果如下：內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（EU/ml）2.0 （0.5）1.0 （0.25）0.5 （0.125）0.25 （0.0625）陰性對照反應(yīng)終點(diǎn)濃度（EU/ml）重復(fù)管數(shù)1+-0.252+-0.253+-空0.1254+-空0.25則鱟試劑靈敏度的測定值c = lg -1（X/4）=lg -1 (lg0.25 + lg0.25 + lg0.125 + lg0.25) / 4