白花蛇舌草乙醇提取物對(duì)肺腺癌A549DDP細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)及其機(jī)制

1、白花蛇舌草乙醇提取物對(duì)肺腺癌A549/DDP細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)及其機(jī)制【摘要】目的討論白花蛇舌草乙醇提取物在體外對(duì)肺腺癌A549/DDP細(xì)胞株的耐藥逆轉(zhuǎn)作用及對(duì)多藥耐藥相關(guān)蛋白R(shí)P表達(dá)的影響。方法TT法測(cè)定白花蛇舌草乙醇提取物對(duì)A549/DDP細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)作用；半定量RT-PR和esternBlt分別檢測(cè)腫瘤細(xì)胞RPRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果白花蛇舌草乙醇提取物使A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥倍數(shù)由10.294下降至5.586；并顯著降低A549/DDPRPRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)論白花蛇舌草乙醇提取物可以局部逆轉(zhuǎn)肺腺癌A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥；其逆轉(zhuǎn)作用可能通過(guò)降低細(xì)胞RP的表達(dá)來(lái)實(shí)

2、現(xiàn)?！娟P(guān)鍵詞】白花蛇舌草乙醇提取物；人肺腺癌A549/DDP細(xì)胞；多藥耐藥相關(guān)蛋白支氣管肺癌是目前最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，早期多無(wú)病癥，不少患者就診時(shí)已經(jīng)失去了手術(shù)治療時(shí)機(jī)，因此治療多采用化療為主的綜合治療。鉑類(lèi)藥物具有廣泛的抗瘤譜，是肺癌化療方案的一線(xiàn)藥物，但隨著晚期肺癌患者化療的開(kāi)展，鉑類(lèi)藥物的獲得性耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重，影響了化療的效果。白花蛇舌草Hedytisdiffusarldenlandiadiffusa為茜草科耳草屬植物，中醫(yī)以全草入藥，性寒，味甘淡，歸心、肺、肝、大腸經(jīng)，清熱解毒，利尿，主治惡瘡腫毒，瀉痢等癥，臨床常用于治療各類(lèi)癌癥1。我們前期研究說(shuō)明2，白花蛇舌草乙醇提取物通過(guò)促進(jìn)

3、肺癌A549細(xì)胞的凋亡來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。為了進(jìn)一步說(shuō)明白花蛇舌草抗腫瘤的作用機(jī)制，為其應(yīng)用于腫瘤臨床提供實(shí)驗(yàn)根據(jù)，我們觀察了白花蛇舌草乙醇提取物在體外對(duì)人肺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP的耐藥逆轉(zhuǎn)作用和對(duì)多藥耐藥相關(guān)蛋白u(yù)ltidrugresistaneassiatedprtEin，RPRNA和蛋白表達(dá)的影響。1材料白花蛇舌草購(gòu)于湖北省藥材公司。取白花蛇舌草全草50g，粉碎研磨，95%乙醇攪拌浸泡15d，濾去殘?jiān)?，水浴至液體全部蒸發(fā)干，而后參加ddH250l溶解，得到生藥濃度為1g/l，0.22濾膜過(guò)濾除菌，4保存，用前用DE培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。四甲基氮唑藍(lán)TT，二甲基亞砜DS，胰酶均為美

4、國(guó)Siga公司產(chǎn)品；順鉑DDP為山東齊魯醫(yī)藥公司產(chǎn)品；RPI1640培養(yǎng)基和DE培養(yǎng)基為Gib公司產(chǎn)品；鼠抗人RP及-atin單抗購(gòu)自美國(guó)Santaruz公司；胎牛血清為杭州四季清生物工程材料公司產(chǎn)品；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。2方法2.1細(xì)胞及其培養(yǎng)肺腺癌細(xì)胞株A549購(gòu)于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP由第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院全軍呼吸病研究所陸俊羽教授惠贈(zèng)，腫瘤細(xì)胞用含10小牛血清的DE培養(yǎng)基，在含52，37飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25胰蛋白酶消化傳代。為保持A549/DDP的耐藥性，該細(xì)胞培養(yǎng)液含6l/L的DDP，實(shí)驗(yàn)前2天更換為無(wú)DDP的DE培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)

5、用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。2.2對(duì)肺癌A549/DDP耐藥細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用A549和A549/DDP兩株細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1105l-1，接種于96孔板，每孔100l。分設(shè)A549組、A549空白組、A549/DDP組、A549/DDP空白組和白花蛇舌草組，白花蛇舌草組為A549/DDP細(xì)胞參加終濃度為40g/l白花蛇舌草乙醇提取物。細(xì)胞培養(yǎng)24h后，分別參加終濃度為10，20，40，80，100，200l/L的DDP，終體積為200l，每個(gè)濃度設(shè)6復(fù)孔，A549空白組和A549/DDP空白組那么參加等體積的DE，繼續(xù)培養(yǎng)72h后，每孔參加5g/LTT10l，繼續(xù)孵育4h，每

6、孔參加200l二甲基亞砜DS終止，振蕩15in，450型ELISA-Reader酶標(biāo)儀Bi-Rad公司570n主波長(zhǎng)，630n副波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度。以空白對(duì)照組細(xì)胞活力為100，按公式計(jì)算不同濃度DDP對(duì)A549、A549/DDP和參加白花蛇舌草的A549/DDP細(xì)胞增殖的抑制率。公式：細(xì)胞抑制率%(1實(shí)驗(yàn)組吸光度/空白組吸光度)100。采用直線(xiàn)回歸法計(jì)算DDP的半數(shù)抑制濃度I50值。耐藥倍數(shù)計(jì)算公式：耐藥倍數(shù)耐藥株I50值/敏感株I50值。2.3對(duì)肺癌A549/DDP耐藥細(xì)胞RPRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響2.3.1半定量RT-PR檢測(cè)RPRNATRizl裂解培養(yǎng)的A549和A549/DDP細(xì)胞DD

7、P濃度為100l/L，氯仿抽提，異戊醇沉淀，乙醇洗滌枯燥獲取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成DNA，PR擴(kuò)增出RP、內(nèi)參-atin基因片段。RP引物序列參照文獻(xiàn)3上海博亞生物公司合成：上游5-GTAATTAAATGATTGGT-3，下游5-GTTATAGTTGATGAT-3，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度256bp。反響條件：預(yù)變性945in進(jìn)入循環(huán)，94變性30s，54.5退火30s，72延伸60s，共38個(gè)循環(huán)，最后72延伸5in。內(nèi)參-atin基因引物序列上海博亞生物公司合成：上游5-AAGAGTATTG-3，下游5-AAGGATTAGTTG-3，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度141bp。反響條件：預(yù)變性942in進(jìn)入循環(huán)，94變性30

8、s，54.1退火30s，72延伸30s，共30個(gè)循環(huán)，最后72延伸5in。反響完成后取5lIL-5PR產(chǎn)物，3l-atinPR產(chǎn)物及2l5上樣緩沖液，加少量溴乙錠EB染色，行2%瓊脂糖凝膠電泳。于紫外透射儀上觀察電泳結(jié)果。用圖像分析系統(tǒng)分別測(cè)每個(gè)目的基因及看家基因-atin的吸光度A值，取目的基因與-atin的A值比值即相對(duì)A值。2.3.2蛋白免疫印跡試驗(yàn)esternBlt檢測(cè)RP搜集DDP濃度為100l/L的腫瘤細(xì)胞，參加細(xì)胞裂解液，冰上放置15in，12000r/in離心15in，取上清，以Bradfrd法作蛋白質(zhì)定量后置80貯存?zhèn)溆?。灌?0SDS-聚丙烯酰胺凝膠，常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，

9、一抗1500，4孵育過(guò)夜，二抗15000，室溫孵育2h，EL顯色。圖像經(jīng)UvpgrabitIage軟件測(cè)定各條帶的吸光度，以各條帶的吸光度值與-atin吸光度值的比值進(jìn)展細(xì)胞間蛋白表達(dá)量的比擬。2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均用s表示，使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)展t檢驗(yàn)分析。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3結(jié)果3.1白花蛇舌草乙醇提取物對(duì)肺癌A549/DDP耐藥細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用TT結(jié)果見(jiàn)表1，DDP對(duì)A549和A549/DDP細(xì)胞的抑制作用呈濃度依賴(lài)性。DDP對(duì)A549細(xì)胞的I50為27.90l/L，對(duì)A549/DDP細(xì)胞的I50為287.19l/L，A549/DDP的耐藥倍數(shù)為10.294。而經(jīng)過(guò)白

10、花蛇舌草乙醇提取物40g/l作用后的A549/DDP細(xì)胞DDP的I50為155.85l/L，耐藥倍數(shù)為5.586。表1不同濃度DDP作用72h對(duì)A549和A549/DDP細(xì)胞的抑制作用略3.2白花蛇舌草乙醇提取物對(duì)肺癌A549/DDP耐藥細(xì)胞RPRNA表達(dá)的影響A549/DDP細(xì)胞的RPRNA的表達(dá)A值為1.0250.133顯著高于A549細(xì)胞A值為0.1060.018P0.01；而白花蛇舌草乙醇提取物那么使A549/DDP細(xì)胞RPRNA的表達(dá)明顯減少A值為0.5370.062P0.01，但仍高于A549細(xì)胞RPRNA的表達(dá)P0.01，如圖1所示。3.3白花蛇舌草乙醇提取物對(duì)肺癌A549/DD

11、P耐藥細(xì)胞RP蛋白表達(dá)的影響esternBlt檢測(cè)顯示，A549/DDP細(xì)胞的RP蛋白表達(dá)顯著高于A549細(xì)胞的表達(dá)；白花蛇舌草乙醇提取物可以減少A549/DDP細(xì)胞RP蛋白的表達(dá)。結(jié)果見(jiàn)圖2。4討論肺癌化療療效的降低，主要是肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性所致，因此積極尋找有效的肺癌化療耐藥逆轉(zhuǎn)的有效方法是肺癌治療的研究熱點(diǎn)。研究說(shuō)明4，5，多種中藥如鴉膽子油乳、苦參堿、姜黃素等具有不同程度逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的作用。白花蛇舌草是臨床廣泛使用的抗腫瘤中藥之一，現(xiàn)代研究說(shuō)明68，其主要化學(xué)成分有熊果酸、免疫多糖、烏索酸、白花蛇舌草素等，這些主要的有效成分具有增強(qiáng)免疫活性、抗氧化和抗腫瘤活性。我們研究結(jié)

12、果顯示，A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥倍數(shù)為10.294，白花蛇舌草乙醇提取物40g/l可以明顯降低A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥性耐藥倍數(shù)由10.294下降至5.586，增敏倍數(shù)高達(dá)1.843倍。肺癌細(xì)胞的多藥耐藥與P-糖蛋白P-gp、多藥耐藥相關(guān)蛋白R(shí)P、肺耐藥相關(guān)蛋白LRP、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶、細(xì)胞膜離子通道等多種因素相關(guān)，其中RP在肺癌細(xì)胞表達(dá)的增強(qiáng)是重要的耐藥機(jī)制之一。RP的主要作用是在消耗ATP的根底上將細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)離子或細(xì)胞毒性物質(zhì)逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，降低細(xì)胞核內(nèi)的藥物濃度，使藥物對(duì)DNA靶點(diǎn)的絕對(duì)濃度降低，并可改變胞漿和細(xì)胞器的pH值及通過(guò)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和胞吐作用將

13、藥物排出細(xì)胞，使藥物到達(dá)其作用部位的濃度減少、藥物活性成分脫離其作用部位和胞內(nèi)藥物濃度降低，從而使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性9，10。我們研究結(jié)果說(shuō)明，白花蛇舌草乙醇提取物可以明顯抑制肺癌A549/DDP耐藥細(xì)胞RPRNA和蛋白的表達(dá)，從而增加肺癌細(xì)胞內(nèi)DDP的濃度和分布，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)肺癌A549/DDP細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。綜上所述，白花蛇舌草乙醇提取物對(duì)肺腺癌A549/DDP細(xì)胞株具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用，其逆轉(zhuǎn)作用可能通過(guò)減低膜外表轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白R(shí)P的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)，其詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步的研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1宋立人.中華本草，第1版.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：433.2高寶安，陳世雄，楊俊，等.白花蛇舌草乙醇提

14、取物對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞株增殖和凋亡的影響J.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2022，206：1392.3馮覺(jué)平，孔慶志，黃濤，等.三氧化二砷對(duì)肺腺癌耐藥細(xì)胞A549/R耐藥性的影響J.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2022，23(2):201.4湯濤，蒙凌華，陳陵際，等.鴉膽子油乳具有多藥耐藥逆轉(zhuǎn)和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制作用J.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2001，175：534.5陳旭昕，張艱，趙峰，等.姜黃素對(duì)人肺腺癌A549/DDP細(xì)胞增殖活性的影響J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，2824：2287.6Lin,NgLT,YangJJ,etal.Antixidantativityfextratsfpeh-hue-jua-hi-ainaellfreesysteJ.AJhined.2022,32(3):339.7GuptaS,ZhangD,YiJ,etal.AntianerativitiesfldenlandiadiffusaJ.JHerbPharather.2022,4(1):21.8單保恩，張金艷，杜肖娜，等.白花蛇舌草的免疫調(diào)節(jié)活性和抗腫瘤活性J.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2001，215：370.9ZhuSF,angLL,DiY,etal.Substratesandinhibitrsfhuanult