大黃對(duì)幼鼠肝內(nèi)膽汁淤積的治療作用

1、大黃對(duì)幼鼠肝內(nèi)膽汁淤積的治療作用【關(guān)鍵詞】大黃；膽汁淤積；動(dòng)物模型；治療作用Therapeutieffetfrhubarbnintrahepatihlestasisininfantrats【Abstrat】AI:Texplrethetherapeutieffetfrhubarbnintrahepatihlestasisininfantrats.ETHDS:90SDinfantratsererandlydividedint5grups:treatentgrupfrhubarb,untreatedgrup,treatentntrlgrup1fUDA(UrsdexyhliAid,UDA),treat

2、entntrlgrup2fUDAanddeltasne,andblankntrlgrupnttreatedithNaphthylisthiyanate(ANIT)ranythertreatent.JaundiedelfintrahepatihlestasisasestablishedininfantratsbyANIT.Atthetiefthe2nd,3rd,and4theek,thenentratinsfseruTB,DB,ALT,ALPandTBAereassessedbyautatibiheialanalyzer.Thehistpathlgialhangesflivererebserve

3、drespetivelybylightirspeandeletrnirspe.RESULTS:ThenentratinsfseruTBandDBereinreasedintheuntreatedgrupasparediththeblankntrlgrup,andthereeresignifiantdifferenesinthenentratinsfseruALT,ALPandTBAbeteentheuntreatedgrupandtheblankntrlgrupP0.05asell,hihdenstratedthattheanialdelfhepatijaundieithhlestasisas

4、suessfullyestablished.ThenentratinsfseruDB,TB,ALP,ALTandTBAeresignifiantlylerinthetreatentgrupfrhubarbasparediththeuntreatedgrup(P0.05).eanhile,bettereffetsfrelievingthejaundieanddereasingtheALPandTBAlevelsuldbebservedinrhubarbtreatentgrupasparediththeUDAgruprtreatentgrupfbinedusefUDAanddeltasne.nly

5、ildhistpathlgialhangeinliveruldbeseeninrhubarbtreatentgrupbylightirspereletrnirspeasparediththeratsinthergrups.NLUSIN:RhubarbrearkablyreduesthenentratinsfseruTB,DB,ALT,ALPandTBA,relievesthetxiityfbileaidandinhibitsthehepatiinjuryrfibrsis.【Keyrds】rhubarb;hlestasis;anialdel;therapeutieffets【摘要】目的：討論中藥

6、大黃對(duì)幼鼠肝內(nèi)膽汁淤積的治療作用.方法：SD幼鼠90只隨機(jī)分成大黃治療組、未治療組、UDA組熊去氧膽酸,UDA、UDAD組(熊去氧膽酸結(jié)合強(qiáng)的松)、空白對(duì)照組；用萘異硫氰酸酯ANIT灌胃建立幼鼠膽汁淤積性黃疸模型，檢測在不同時(shí)間段血清TB,DB,ALT,ALP和TBA濃度；制作肝組織標(biāo)本，進(jìn)展光鏡、電鏡組織病理學(xué)觀察.結(jié)果：未治療組與空白對(duì)照組比擬，TB和DB均有數(shù)十倍的增高.同時(shí)未治療組血清ALT,ALP,TBA濃度與空白對(duì)照組比擬也有顯著性差異P0.05，說明成功構(gòu)建幼鼠膽汁淤積性黃疸模型.大黃治療組的血清TB,DB,ALT,ALP及TBA值明顯低于未治療組P0.05，與治療對(duì)照組比擬，中

7、藥大黃在退黃、降低ALP,TBA方面優(yōu)于UDA和UDA+強(qiáng)的松；光鏡、電鏡下大黃治療組與未治療組、治療對(duì)照組比擬，肝組織病理改變細(xì)微.結(jié)論：大黃能明顯降低血清中TB,DB,ALT,ALP及TBA濃度，顯著降低膽汁酸的毒性作用，抑制肝纖維化.【關(guān)鍵詞】大黃；膽汁淤積；動(dòng)物模型；治療作用0引言肝內(nèi)膽汁淤積的治療目前尚缺乏有效方法，尤其在嬰幼兒1-2.利膽藥熊去氧膽酸和中藥大黃近年來日益受到廣闊學(xué)者的重視3.大黃為傳統(tǒng)常用中藥，有多種藥用價(jià)值，單味大黃廣泛用于各科疾病的治療，尤其是臨床肝膽疾病的治療，但多數(shù)為初步的臨床療效觀察，缺乏對(duì)其作用機(jī)制的深化討論，而且將大黃用于幼齡鼠進(jìn)展療效觀察及作用機(jī)制的

8、討論，國內(nèi)少有報(bào)道.我們討論大黃對(duì)幼鼠肝內(nèi)膽汁淤積的治療效果，為大黃治療肝內(nèi)膽汁淤積提供理論根據(jù).1材料和方法11材料安康SpragueDaley(SD)大鼠90只第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄各半，2周齡由母鼠哺乳至3k齡分窩，體質(zhì)量2228g.日立7600生化自動(dòng)檢測儀；日本島津公司紫外分光光度計(jì)UV1700；萘異硫氰酸酯ANITSiga公司熊去氧膽酸膠囊250g/粒德國福克大藥廠消費(fèi)；丙二醛(DA)測定試劑盒、總抗氧化才能(TA)試劑盒、一氧化氮(N)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供.2周齡幼鼠相當(dāng)于人嬰幼兒期90只隨機(jī)分為空白對(duì)照組、未治療組、大黃治療組、UDA組、UDA

9、D組，共5組，每組各18只，于實(shí)驗(yàn)2，3，4k分別取6只幼鼠進(jìn)展血清和肝組織的檢測.12方法大黃治療組、治療對(duì)照組和未治療組均給予20g/LANIT花生油溶液灌胃誘導(dǎo)肝損傷4，劑量60g/kg，隔日1次，連續(xù)用藥4k.給予ANIT灌胃3次即6d后，UDA組、UDAD組和大黃治療組全程另分別給予熊去氧膽酸UDA、UDA+強(qiáng)的松、大黃煎液灌胃，1次/d.UDA、強(qiáng)的松、大黃劑量按人與動(dòng)物等效劑量折算公式5計(jì)算幼鼠用量(g/kg)=人用量21人轉(zhuǎn)換因子/4.5大白鼠轉(zhuǎn)換因子，得每日劑量分別為50g/kg，7.5g/kg和2.3g/kg.空白對(duì)照組為同期正常喂養(yǎng)大鼠.將UDA50g,強(qiáng)的松片劑7.5g

10、研磨成粉溶于30L生理鹽水中，充分混勻，制成混懸液，小鼠按30L/g灌胃；取生大黃2.3g，洗凈后放入30L沸水中，加蓋密閉，浸泡20in，過濾，取上清，小鼠按30L/g灌胃.經(jīng)以上措施處理2,3,4k后，所有被觀察大鼠均以乙醚吸入麻醉后剪開右頸部暴露頸靜脈，剪斷頸靜脈取血23L，靜置2h后(2000r/in)離心，移液器別離血清.立即取肝臟左葉組織46小塊，40g/L甲醛緩沖液室溫下固定,24h后制備標(biāo)本，用于光鏡觀察；25g/L戊二醛固定4冰箱保存，4h后制備標(biāo)本，組織經(jīng)酒精、丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂618#包埋，光鏡下定位，制備60n的超薄切片，采用H600透射電鏡觀察.取血清0.5L立即

11、送檢測TB,DB,ALT,ALP和TBA濃度.用日立7600生化自動(dòng)檢測儀檢測，移液器將0.5L血清移入加樣管中，系統(tǒng)自動(dòng)取樣分析，獲取結(jié)果.常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，中性樹脂封片，光鏡檢查.著重觀察有無肝細(xì)胞變性壞死，肝纖維化，肝細(xì)胞及膽小管內(nèi)有無膽汁淤積現(xiàn)象.在實(shí)驗(yàn)第4k，取各組動(dòng)物的肝臟標(biāo)本，經(jīng)上述方法處理后送重慶醫(yī)科大學(xué)電鏡室超薄切片徠卡，枸櫞酸鉛及醋酸雙氧鈾染色，H600透射電鏡觀察.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SAS8.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)展分析.計(jì)量資料用xs表示；組間比擬，由于方差不齊，將原始數(shù)據(jù)進(jìn)展對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換前方差齊同，再采用方差分析，兩兩比擬采用SNKq檢驗(yàn)；P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性

12、差異.A:肝細(xì)胞內(nèi)膽色素顆粒;B:肝臟毛細(xì)膽管內(nèi)膽汁淤積;:肝細(xì)胞混濁腫脹和氣球樣變性;D:匯管區(qū)明顯纖維增生;E:大黃組肝細(xì)胞輕度變性，少數(shù)毛細(xì)膽管淤膽;F:大黃組匯管區(qū)少量纖維增生;G:UDA組肝細(xì)胞輕度變性，點(diǎn)狀壞死;H:UDA+D組肝細(xì)胞灶性壞死.圖1各組幼鼠肝臟的病理變化HE400略2結(jié)果光鏡下，空白對(duì)照組：肝小葉構(gòu)造完好，肝細(xì)胞形態(tài)正常.無變性壞死、炎癥細(xì)胞浸潤和纖維組織增生等改變.未治療組：肝細(xì)胞內(nèi)見膽色素沉積，毛細(xì)膽管內(nèi)膽汁淤積圖1A，B.可見肝細(xì)胞大量混濁腫脹、空泡變性，匯管區(qū)較多纖維組織增生圖1，D.說明給實(shí)驗(yàn)大鼠口服ANIT后，成功構(gòu)建肝內(nèi)膽汁淤積性黃疸動(dòng)物模型.大黃治療

13、組：肝細(xì)胞輕度變性，無肝細(xì)胞壞死，少數(shù)毛細(xì)膽管內(nèi)膽汁淤積，匯管區(qū)少量纖維組織增生圖1E，F(xiàn).說明大黃明顯減輕了肝細(xì)胞的損傷，抑制肝纖維化.UDA組：少數(shù)毛細(xì)膽管內(nèi)膽汁淤積，肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死、輕度濁變和空泡變性圖1G.UDAD組：肝細(xì)胞灶性壞死，少數(shù)毛細(xì)膽管內(nèi)淤膽圖1H.電鏡下，空白對(duì)照組：肝細(xì)胞核大，染色質(zhì)豐富，核仁明顯，可見雙核仁，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富明晰，可見興旺的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體，成桿狀或橢圓形的線粒體超微構(gòu)造正常，細(xì)胞基質(zhì)電子密度均勻一致，糖原散在分布于細(xì)胞質(zhì)中.未治療組：肝細(xì)胞核不同程度溶解，異染色質(zhì)邊集，胞漿大片空化，有糖原堆積，脂滴增多，線粒體形態(tài)尚可，毛細(xì)膽管擴(kuò)張，嚴(yán)密連接翻

14、開.變性壞死及線粒體腫脹明顯，肝細(xì)胞內(nèi)可見髓樣構(gòu)造.血竇內(nèi)可見成纖維樣細(xì)胞及少量膠原纖維，少量纖維細(xì)胞呈現(xiàn)局灶性壞死(圖2A，B，).UDA組：少數(shù)肝細(xì)胞核異染色質(zhì)邊集，肝細(xì)胞間隙擴(kuò)大，髓樣構(gòu)造增多，少數(shù)線粒體輕度內(nèi)室腫脹，溶酶體增多(圖2D).UDAD組：肝細(xì)胞胞質(zhì)空化，糖原增多，線粒體內(nèi)室腫脹，少數(shù)肝細(xì)胞核異染色質(zhì)邊集，毛細(xì)膽管輕度擴(kuò)張，微絨毛變短(圖2E).大黃組：大多數(shù)肝細(xì)胞超微構(gòu)造根本正常，僅有少數(shù)肝細(xì)胞胞質(zhì)呈局灶性溶解，其毛膽管構(gòu)造明晰，無明顯擴(kuò)張(圖2F).各組大鼠血清TB,DB,ALT,ALP,TBA濃度有差異(表1,2).3討論中藥大黃已被廣泛應(yīng)用于臨床肝膽疾病的治療.A:未

15、治組幼鼠肝內(nèi)毛細(xì)膽管擴(kuò)張，嚴(yán)密連接翻開25000;B:未治組肝細(xì)胞核溶解，異染色質(zhì)邊集，胞質(zhì)大片空化，有糖原堆積，脂滴增多;:未治組肝纖維化明顯;D:UDA組少數(shù)肝細(xì)胞核異染色質(zhì)邊集，線粒體輕度腫脹;E:UDA+D組肝細(xì)胞胞質(zhì)空化，糖原增多，線粒體腫脹，少數(shù)肝細(xì)胞核異染色質(zhì)邊集;F:大黃組肝細(xì)胞根本正常，毛細(xì)膽管無明顯擴(kuò)張.圖2各組幼鼠肝臟的超微構(gòu)造變化TE8000略表1大鼠血清TB，DB和TBA測定結(jié)果略aP0.05vs未治療.表2血清中ALT，ALP測定結(jié)果略aP0.05vs未治療.為深化討論中藥大黃對(duì)肝內(nèi)膽汁淤積的治療作用，建立肝內(nèi)膽汁淤積性黃疸動(dòng)物模型成為深化研究本課題的關(guān)鍵.實(shí)驗(yàn)證明

16、，異硫氰酸萘酯ANIT能誘發(fā)大鼠肝臟損害，引起血液中膽紅素和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶急劇升高，膽汁流量減少，炎性細(xì)胞增加以及肝細(xì)胞壞死等相似于人類肝內(nèi)膽汁淤積的病理改變6.從本實(shí)驗(yàn)中未治療組的檢測結(jié)果說明，由ANIT引起的高膽血癥，以結(jié)合膽紅素為主，符合膽汁淤積性黃疸特征，同時(shí)說明本組所建立的肝內(nèi)膽汁淤積性黃疸模型是成功的.血清總膽紅素TB，堿性磷酸酶ALP，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT，總膽汁酸TBA是膽汁淤積的4項(xiàng)常規(guī)指標(biāo)7.我們將這4項(xiàng)指標(biāo)作為判斷膽汁淤積程度的指標(biāo)，同時(shí)也作為衡量膽汁淤積藥物療效的指標(biāo).本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：大黃、UDA和UDA+強(qiáng)的松對(duì)膽汁淤積均有效，大黃在退黃、降低血清膽紅素、降低ALP和

17、TBA方面療效優(yōu)于UDA和UDA+強(qiáng)的松，而在降低ALT方面無優(yōu)勢；UDA+強(qiáng)的松退黃、降低ALT的作用稍強(qiáng)于UDA.肝組織學(xué)檢查結(jié)果示：光鏡下，大黃治療減輕了肝細(xì)胞的損傷和膽汁淤積，抑制了肝纖維化.電鏡下，大黃治療減輕了肝細(xì)胞的損傷和膽汁淤積，同時(shí)減輕了線粒體的損傷.膽汁淤積屬中醫(yī)“黃疸范疇，病機(jī)系濕熱瘀毒郁阻血分，阻滯百脈，逼迫膽液外溢，浸漬肌膚所致.大黃系通腑祛瘀的主要藥物，具有通腑解毒、活血化瘀、攻逐濕濁、通便瀉下等作用，不僅利肝膽濕熱，還清瀉血分之瘀熱，并具降氣、利尿、降黃疸、抗菌、抗毒等諸多成效.本實(shí)驗(yàn)說明UDA對(duì)膽汁淤積是有效的，但由于缺乏合適嬰兒的劑型，限制了它在兒科的應(yīng)用.熊

18、去氧膽酸UDA是鵝去氧膽酸的7表異構(gòu)物，較鵝去氧膽酸及其他膽酸更具親水性.由于其外表活性弱，因此分裂、溶解膜質(zhì)的傾向很弱，能穩(wěn)定被疏水性膽酸結(jié)合的肝細(xì)胞膜，拮抗其細(xì)胞毒作用7.腎上腺皮質(zhì)激素對(duì)膽汁淤積有一定利膽退黃作用，但長期使用副作用多，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為認(rèn)為激素對(duì)淤膽型肝炎并無突出的效果,目前的中醫(yī)治療對(duì)淤膽型肝炎有更好的效果,且沒有激素的副作用.本研究說明盡管加用激素后在降低TB，ALT方面療效優(yōu)于單用UDA組，但是從病理改變看加用強(qiáng)的松后病情有加重的趨勢，故膽汁淤積時(shí)是否加用激素治療有待進(jìn)一步討論.【參考文獻(xiàn)】1ThieR,pitzG,BluHE,etal.hlestatiliverdiseaseJ.TherUsh,2022,61(8):521-527.2NgVL,BalistreriF.TreatentptinsfrhrnihlestasisininfanyandhildhdJ.urrTreatptinsGastrenterl,2022,8(5):419-430.3劉莉，梅其炳，李保莉，等.唐古