口腔生物學：第三章 口腔疾病分子生物學1

1、2012-10-11【口腔生物學】5年制第三章 口腔疾病分子生物學Molecular biology of oral diseases 第三章 口腔疾病分子生物學Molecular biology of oral diseases 參考書目內(nèi)容第一節(jié) 分子生物學基礎(chǔ)一、概述二、基因三、基因表達四、基因表達的調(diào)節(jié)第二節(jié) 分子生物學研究的主要方法一、分子克隆的材料與方法二、分子克隆的主要步驟三、特異核酸的檢測第三節(jié) 牙發(fā)生的分子機制一、釉質(zhì)形成的分子機制二、牙本質(zhì)形成的分子機制第四節(jié) 分子生物學在口腔致病菌研究中的應(yīng)用一、變形鏈球菌屬致齲毒力因子二、核酸雜交法檢測牙周病相關(guān)細菌三、基于16S rR

2、NA基因分析的口腔微生物分類 與鑒定第五節(jié) 口腔病分子生物學基礎(chǔ)一、遺傳疾病的分類二、單基因遺傳病研究中的幾個概念三、基因多態(tài)性與突變第六節(jié) 口腔腫瘤分子生物學一、細胞增值與細胞凋亡二、口腔腫瘤發(fā)生的分子機制三、口腔腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機制四、口腔腫瘤相關(guān)基因的篩選與功能研究策略了解掌握熟悉分子生物學研究的主要方法與原理The Methods and Principles 牙發(fā)生中的分子機制以及口腔常見致病菌的毒力因子及檢測方法Molecular Mechanisms of tooth development理解分子改變所導致遺傳病的原理How can gene mutations affect h

3、ealth and development?基因的基本結(jié)構(gòu)、功能及表達的調(diào)節(jié)The gene structure , function and expression第一節(jié) 分子生物學基礎(chǔ) 概述 基因的基本結(jié)構(gòu)和功能 基因表達 基因表達的調(diào)節(jié) 分子生物學是研究生物分子的特征、相互關(guān)系及其對生命活動影響的學科，分子生物學在醫(yī)學中的應(yīng)用有助于從根本上理解生物的生理及病理機制與過程。 基因的基本結(jié)構(gòu)和功能The Structure and functions of the nucleic acids Molecule (Gene)核酸 nucleic acidsJohannes Friedrich M

4、iescherSwiss physician and biologist 1844-1895 He was the first researcher to isolate and identify nucleic acid.Discoverer of the structure of DNAThey were awarded the 1962 Nobel Prize for Physiology or Medicine, for their discoveries concerning the molecular structure of nucleic acids and its signi

5、ficance for information transfer in living materia.James Dewey Watson 1928, AmericanMaurice Hugh Frederick Wilkins 1916, New ZealandX-ray diffractionFrancis Harry Compton Crick1916, British核糖核酸脫氧核糖核酸腺嘌呤胸腺嘧啶胞嘧啶鳥嘌呤腺嘌呤尿嘧啶胞嘧啶鳥嘌呤核酸 nucleic acidsThe structure of the DNA double helix 嘧啶嘌呤22 wide12 wide基因（g

6、ene）基因是一段DNA序列，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是編碼一條多肽或蛋白質(zhì)的RNA或具有獨立功能的RNA，基因決定遺傳性狀?；蛟诨蚪M上呈直線排列并世代相傳?；蚪M（genome）基因組是指細胞或生物體的整套DNA，基因組包含整套基因的編碼序列，同時還包括基因內(nèi)的非編碼序列及基因間序列。這些序列也同樣含遺傳指令。基因基因組12345671234567DNA新生mRNA成熟mRNA轉(zhuǎn)錄拼接-轉(zhuǎn)錄后修飾翻譯蛋白質(zhì)復制DNA Replication dATP/dGTP/dCTP/dTTP Mg2+ 引物（primer ：DNA or RNA) DNA模板（Template） DNA多聚酶基因表達Gene ex

7、pression 基因表達Gene expression 轉(zhuǎn)錄翻譯轉(zhuǎn)錄 Transcription DNARNASence strandAntience strand反義鏈有意義鏈啟動子PromotorTATA 框CAAT框GC框增強子沉默子終止子Messenger RNA (mRNA) Ribosomal RNA (rRNA)Transfer RNA (tRNA)Long non-coding RNA small nuclear RNA (snoRNA) microRNA (miRNA)Small interfering RNA （siRNA）Piwi-interacting RNA (pi

8、RNA)RNA克雷格梅洛是美國馬薩諸塞大學醫(yī)學院分子醫(yī)學教授。2006年因與斯坦福醫(yī)學院病理學和遺傳學教授安德魯法厄發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象而共同獲得2006年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。1982年獲得美國布朗大學學士學位，1990年在哈佛大學獲得博士學位。1994年加入馬薩諸塞州大學醫(yī)學院任分子醫(yī)學教授Craig C. Mello轉(zhuǎn)錄后修飾 Post-transcriptional modification mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾 Post-transcriptional modification mRNA5 cap addition Splicing Polyadenylation tRNArRNAmRN

9、A翻譯 TranslationmRNAProtein (蛋白質(zhì)）遺傳密碼Start ：AUG一個基因一種酶（EXTL2-糖基化轉(zhuǎn)移酶）一個基因一條多肽鏈血紅蛋白血紅蛋白兩條鏈和兩條鏈組成四聚體的血紅蛋白:鏈鏈一個基因多條多肽鏈（TP63基因）外顯子1外顯子2外顯子3外顯子4外顯子554314231534第1個轉(zhuǎn)錄本第2個轉(zhuǎn)錄本第3個轉(zhuǎn)錄本NF1基因的有義鏈NF1基因的反義鏈外顯子外顯子5533OMGEVI2BEVI2A外顯子OMG、EVI2A、EVI2B三個基因在基因組上定位于NF1基因第36個外顯子和第37個外顯子之間的內(nèi)含子中。紅色：外顯子 藍色：內(nèi)含子重疊基因基因表達的調(diào)節(jié)Regulat

10、ion of gene expression DNA Interactions with proteinsAll the functions of DNA depend on interactions with proteins. These protein interactions can be non-specific, or the protein can bind specifically to a single DNA sequence. Enzymes can also bind to DNA and of these, the polymerases that copy the

11、DNA base sequence in transcription and DNA replication are particularly important.基因表達的調(diào)節(jié)乳糖操縱子模型基因表達的調(diào)節(jié)Regulation of gene expression 螢火蟲熒光素酶報告基因 螢火蟲熒光素酶報告基因系統(tǒng)對照組實驗組基因表達的調(diào)節(jié)實驗數(shù)據(jù)第二節(jié) 分子生物學研究的主要方法與原理The Methods and Principles 核酸蛋白質(zhì)核酸技術(shù)核酸制備與擴增基因組DNA的提取與純化RNA制備和cDNA的合成核酸擴增（PCR技術(shù))核酸檢測核酸雜交SouthernNorthern基因芯

12、片基因克隆分離目的基因切割目的基因和載體目的基因和載體的連接重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞陽性克隆的篩選電泳分析法分光光度分析法常用的分子生物學技術(shù)PCR技術(shù)發(fā)明者1985年，美國科學家Kary Mullis在高速公路的啟發(fā)下，經(jīng)過兩年的努力，發(fā)明了PCR技術(shù)，并在Science雜志上發(fā)表了關(guān)于PCR技術(shù)的第一篇學術(shù)論文。從此，PCR技術(shù)得到了生命科學界的普遍認同，Kary Mullis也因此而獲得1993年的諾貝爾化學獎。聚合酶鏈式反應(yīng) Polymerase Chain Reaction（PCR）PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變

13、性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備。模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降 至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合。3. 引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合 成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。

14、每完成一個循環(huán)需 24分鐘，23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。 聚合酶鏈式反應(yīng) Polymerase Chain Reaction（PCR）模板DNA的變性模板DNA與引物的退火(復性)引物的延伸PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物MarkerPCR產(chǎn)物PCR反應(yīng)要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。 PCR引物設(shè)計應(yīng)遵循以下原則：引物長

15、度： 15-30bp，常用為20bp左右。引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。 引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。 引物中有或能加上合適的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。 引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它

16、序列無明顯同源性。計算機軟件輔助設(shè)計 特異性強 引物與模板DNA特異正確的結(jié)合、堿基配對原則、聚合酶合成反應(yīng)的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，特異性擴增靶基因區(qū)片段。2. 靈敏度高 PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級的 起始待測模板擴增到微克水平。3. 簡便、快速 只需將引物、酶、dNTP、模板和緩沖液混合后放入PCR儀中即可。一 般在24小時完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析即可。4. 對標本的純度要求低 不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA粗制品可作為擴增模板?？?直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等 DNA擴增檢測。PC

17、R優(yōu)點PCR技術(shù)在臨床上的應(yīng)用在遺傳病診斷上的應(yīng)用： 直接檢出基因突變位點篩查與遺傳病有關(guān)的點突變在現(xiàn)代醫(yī)學檢驗中的應(yīng)用： 病原體的定性及定量檢測(如病毒感染）在腫瘤基因診斷中的應(yīng)用： 通過檢測與癌變有關(guān)的基因標志物來判定組織學的良、惡性程度，癌的進展以及腫瘤的耐藥性在基因表達水平檢測中的應(yīng)用： 定量PCR可用于檢測與疾病相關(guān)蛋白基因表達水平。 臨床上檢測腫瘤抗原的基因表達水平能對腫瘤做出早期診斷及治療效果評價等實時熒光定量PCR （Real-time PCR）技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強

18、、自動化程度高等特點定量基因表達水平 （mRNA 、Protein）疾病診斷 基因克隆：基因經(jīng)無性繁殖獲得許多相同拷貝的過程。通常是將單個基因?qū)胨拗骷毎袕椭贫伞；蚩寺〖夹g(shù)：一般來說，基因克隆技術(shù)包括把來自不同生物的基因同有自主復制能力的載體DNA在體外人工連接，構(gòu)建成新的重組DNA，然后送入受體生物中去表達，從而產(chǎn)生遺傳物質(zhì)狀態(tài)的轉(zhuǎn)移和重新組合。因此基因克隆技術(shù)又稱為分子克隆、基因的無性繁殖、基因操作、重組DNA技術(shù)以及基因工程等。步驟：1.分離目的基因 2.切割目的基因和載體 3.目的基因和載體的連接 4.重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞（E.Coli） 5.陽性克隆的篩選 6.DNA測序分析

19、基因克隆技術(shù)限制性內(nèi)切核酸酶 (restriction endonuclease)DNA 連接酶 (DNA ligase)質(zhì)粒 (plasmid, vector) 6.DNA測序RT-PCR（ 反轉(zhuǎn)錄）1. 目的基因2.切割目的基因和載體3.目的基因和載體的連接4.轉(zhuǎn)化(E.Coli)5.陽性克隆基因克隆技術(shù)PCR 6.DNA測序 Transfection(Green Fluorescent Protein )克隆/體外表達目地基因（GFP）核酸雜交技術(shù)Southern blot：檢測DNANorthern blot：檢測RNASouthern blot：檢測DNANorthern blot：

20、檢測RNARNA蛋白質(zhì)技術(shù)蛋白質(zhì)的提取分離與純化及定量（Protein isolation）蛋白印記法（Western blot）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immnosorbent, ELISA)免疫組織化學（ Immunohistochemistry，IHC）免疫共沉淀反應(yīng)（co-immunoprecipitation)細胞免疫熒光染色方法 (Immunol Fluorescence Assay, IFA）蛋白印記法（Western blot）一種分析和鑒定特定蛋白質(zhì)的技術(shù)。即將混雜的蛋白質(zhì)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至固相膜上，再用標記的抗體或二抗與之反應(yīng)，以顯示膜

21、上特定的蛋白條帶。The western blot (sometimes called the protein immunoblot) is a widely accepted analytical technique used to detect specific proteins in the given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native proteins by 3-D structure or denatured proteins by the le

22、ngth of the polypeptide. The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are stained with antibodies specific to the target protein.Western blot protocol一種分析和鑒定特定蛋白質(zhì)的技術(shù)。即將混雜的蛋白質(zhì)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至固相膜上，再用標記的抗體或二抗與之反應(yīng)，以顯示膜上特定的蛋白條帶。蛋白樣品制備和上樣電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗二抗底物（ECL）

23、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA)基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結(jié)合，此種結(jié)合不會改變抗體的免疫學特性，也不影響酶的生物學活性。此種酶標記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過ELISA檢測儀進行定量測定，這樣就將酶化學反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。免疫組織化學（ Immunohistochemistry，

24、IHC）應(yīng)用免疫學（抗原抗體特異性結(jié)合）及組織化學原理，對組織切片中的某些化學成分進行原位的定性、定位或定量研究，這種技術(shù)稱為免疫組織化學技術(shù)Immunohistochemistry or IHC refers to the process of detecting antigens (e.g., proteins) in cells of a tissue section by exploiting the principle of antibodies binding specifically to antigens in biological tissues. IHC takes its

25、 name from the roots immuno, in reference to antibodies used in the procedure, and histo, meaning tissue (compare to immunocytochemistry).1 免疫熒光方法先將已知抗體標上熒光素，當抗原抗體復合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會發(fā)出一定波長的熒光，在熒光顯微鏡下可觀察到某種抗原的定位，進而還可進行定量分析。由于免疫熒光技術(shù)特異性強、靈敏度高、快速簡便，所以在臨床病理診斷、檢驗中應(yīng)用比較廣。2 免疫酶標方法基本原理是先以酶標記的抗體與組織作用，然后加入酶的底物，生

26、成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，在顯微鏡下對各種抗原成分進行定位研究。本方法與免疫熒光技術(shù)相比的主要優(yōu)點是：定位準確，對比度好，染色標本可長期保存。免疫組織化學（ Immunohistochemistry，IHC）免疫酶標方法免疫熒光方法免疫共沉淀反應(yīng)（co-immnoprecipitation)免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。原理：當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)

27、X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。Immunoprecipitation (IP) is the technique of precipitating a protein antigen out of solution using an antibody that specifically binds to that particular protein. This process can be used to isolate and concentrate a particu

28、lar protein from a sample containing many thousands of different proteins. Immunoprecipitation requires that the antibody be coupled to a solid substrate at some point in the procedure.免疫共沉淀反應(yīng)（co-immnopricipitation)Western blot結(jié)果：K8PPFRecQLMSH2抗體：anti-K8細胞免疫熒光染色方法Immunol Fluorescence Assay（IFA）免疫染色的

29、實驗原理類似于Western Blotting，兩者都是運用抗體的特異性識別作用來顯示目的蛋白，但是由于免疫染色需要在細胞內(nèi)原位進行，而且蛋白沒有經(jīng)過富集，因此其實驗難度較高。Immunofluorescence is a technique used for light microscopy with a fluorescence microscope and is used primarily on biological samples. This technique uses the specificity of antibodies to their antigen to target

30、 fluorescent dyes to specific biomolecule targets within a cell, and therefore allows visualisation of the distribution of the target molecule through the sample. Immunofluorescence is a widely used example of immunostaining and is a specific example of immunohistochemistry that makes use of fluorop

31、hores to visualise the location of the antibodies.激光共聚焦顯微鏡激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞 基因表達譜分析Confirm by qPCRSelect some High or Low DNA-蛋白之間的相互關(guān)系DNA affinity purificationHIV VirusH1N1 VirusEB VirusSARS Virus細菌 bacteria Question？2012-10-11【口腔生物學】5年制王彥Email:23730215532014-10-28第三章 口腔疾病分子生物學Molecular biology of oral

32、 diseases 第三節(jié) 牙發(fā)生的分子機制Part I I I The Molecular Mechanisms of tooth development Tooth development牙板牙乳頭成釉器牙胚：成釉器（enamel organ） 牙乳頭（dental papilla) 牙囊（dental sac)一、牙釉質(zhì)形成的分子機制成釉器鐘狀期：前成釉細胞分化前成牙本質(zhì)細胞-牙本質(zhì)細胞牙本質(zhì)形成成釉細胞分化釉質(zhì)形成 （ 釉質(zhì)分泌-釉質(zhì)成熟）釉基質(zhì)特性：65%水、20%有機物、15%無機物 釉原蛋白（疏水)amelogenin釉蛋白（親水）enamelin成釉蛋白ameloblastin

33、釉叢蛋白 tuftelin蛋白水解酶(主要是MMP20）啟動釉質(zhì)礦化支持晶體生長調(diào)節(jié)晶體生長釉原蛋白（疏水)amelogenin在釉質(zhì)的分泌階段 釉原蛋白是釉基質(zhì)的主要成分，占90% 由Amelogenin（AMEL）基因編碼 AMEL基因位于X、Y染色體上，基因突變 與釉質(zhì)發(fā)育不全相關(guān) 牙特異性基因多形式釉原蛋白在釉質(zhì)發(fā)育不同階段發(fā)揮不同的功能釉原蛋白 Amelogenin釉蛋白 Enamelin牙特異性基因人類ENAM基因定位與4q13.3ENAM基因突變與釉質(zhì)發(fā)育不全相關(guān)成釉蛋白ameloblastin釉叢蛋白 tuftelin蛋白水解酶(主要是MMP20）釉基質(zhì)蛋白在釉質(zhì)發(fā)育中的作用啟

34、動釉質(zhì)礦化作為晶體生長的支持相調(diào)節(jié)晶體生長鼠牙釉質(zhì)發(fā)育不同階段各參與成份的變化絲蛋白酶內(nèi)源性金屬蛋白酶磷酸酶在釉質(zhì)發(fā)育過程中，如果任何因素導致蛋白酶不能有序地分解、清除晶體表面的蛋白質(zhì)，將引起釉質(zhì)礦化障礙。二、牙本質(zhì)形成的分子機制無機物 70% -羥基磷灰石有機物 18%水 12%膠原collagen（Type I /V） 非膠原蛋白Non-collagenous proteins成牙本質(zhì)細胞源性非成牙本質(zhì)細胞源性，IgG,白蛋白，2HS-糖蛋白牙本質(zhì)特異性蛋白礦化組織特異性蛋白多組織非特異性蛋白牙本質(zhì)磷蛋白 (DPP)牙本質(zhì)涎蛋白 (DSP)骨涎蛋白 (BSP)骨鈣素 (OC)牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白

35、I (DMPI)骨橋素(OPN)糖胺多糖 (PGs)牙本質(zhì)有機成分牙本質(zhì)有機成份分類牙本質(zhì)/骨相關(guān)基因簇牙本質(zhì)磷蛋白 牙本質(zhì)涎蛋白 骨涎蛋白牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白I骨橋素糖胺多糖 (PGs)第四節(jié) 分子生物學在口腔致病菌研究中的應(yīng)用變形鏈球菌 Streptococcus mutans齲病相關(guān)細菌特性： 能牢固地黏附至牙面 能利用外源性糖類產(chǎn)乳酸 能利用外源性糖產(chǎn)生細胞內(nèi)多糖 在外源性糖缺乏時利用這些多糖產(chǎn)酸 能在酸性環(huán)境中（pH5以下）生存并繼續(xù)產(chǎn)酸（耐酸性）葡糖基轉(zhuǎn)移酶（GTF/GTase）葡聚糖結(jié)合蛋白（GBP)果糖基轉(zhuǎn)移酶（FTF)果聚糖酶（Fru）表面蛋白（PAC、SPA）變形鏈球菌屬（變鏈菌

36、）Streptococcus mutans致齲毒力因子： 細 菌 基因標記酶名稱氨基酸數(shù)目合成的葡聚糖 S.mutansgtfBGTFI14751SG*gtfCGTFSI13751SG/SGgtfDGTFS1430SG S.sobrinusgtfIGTFI15811SG S.downeigtfSGTFS1359SGgtfIGTFI15971SG主要致齲菌的葡糖基轉(zhuǎn)移酶及其基因 *1SG: 非水溶性葡聚糖 SG: 水溶性葡聚糖茸毛鏈球菌變形鏈球菌道勒鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶（GTF/GTase）由于合成葡聚糖而誘導細菌對牙面的黏附葡糖基轉(zhuǎn)移酶及葡聚糖結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)氨基端信號肽酶催化活性區(qū)羧基端氨基酶重復

37、區(qū)葡聚糖結(jié)合蛋白葡糖基轉(zhuǎn)移酶GTFI酶C端缺損對功能的影響N端/氨基端C端/羧基端變異鏈球菌候選致齲基因基因作 用突變株致齲力下降Pac 表面蛋白黏 附無變化gtfB 葡糖基轉(zhuǎn)移酶黏 附下 降gtfC 葡糖基轉(zhuǎn)移酶黏 附下 降gtfD 葡糖基轉(zhuǎn)移酶 黏 附無變化ftf 果糖基轉(zhuǎn)移酶黏 附無變化糖儲存無變化Fru 果聚糖酶 利用果聚糖無變化glg糖儲存下 降牙周病相關(guān)細菌伴放線放線桿菌 actinobacillus actinomycetemcomitans牙齦卟啉菌Prophyromonas gingivalis中間型擬桿菌 Bacteroid intermedia核酸雜交法檢測牙周病相關(guān)細菌

38、探針 probe：是一小段單鏈DNA或者RNA片段用于檢測與其互補的核酸序列 核酸雜交：兩條核酸單鏈可以通過序列互補形成雙鏈化合物的過程。 有DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA等雜交類型。 核酸雜交是一種很重要的、被廣泛應(yīng)用的技術(shù)。探針的敏感性 檢測到所有屬內(nèi)的細菌探針的特異性性 檢測某個特異性細菌探針：DNA 、oligonucleotide核酸雜交的應(yīng)用及臨床意義： 1、省時大樣本研究 2、早期診斷 3、病程判斷 4、監(jiān)控療效、調(diào)整治療方案基于16S rRNA基因分析的口腔微生物分類和鑒定原理：存在于所有細胞生物中，具有功能和進化的同源性， 可作為一個通用的分子指標對各種微生物

39、進行分析比較方法： 1.提取和純化總DNA2. 用通用或?qū)Ｒ灰颬CR擴增16S rRNA基因3. PCR純化、克隆、構(gòu)建16S DNA文庫4. 篩選克隆、測序及序列分析5.結(jié)果判斷16S rRNA基因分析原理第五節(jié) 口腔遺傳病生物學基礎(chǔ)口腔遺傳病生物學基礎(chǔ)染色體?。喝旧w結(jié)構(gòu)數(shù)目異常單基因病：單個基因突變多基因?。憾鄠€單個基因突變線粒體病：線粒體中DNA改變體細胞遺傳?。后w細胞遺傳物質(zhì)的改變 CCD家族成員疾病表現(xiàn)度差異A：家系圖 B：患病母親（II:2）全頜曲面斷層片C：II:2胸片 D：患病女兒（III:1）全頜曲面斷層片E：III:1胸片顱骨鎖骨發(fā)育不全第6染色體p21基因突變激活蛋白

40、酶基因第16號外顯子發(fā)生了同義突變，該突變未改變，所編碼的氨基酸（甘氨酸）似乎是一個沉默突變。然而，該突變導致了第16外顯子內(nèi)的一個隱蔽剪接供體序列（AGGGCAAAAG）的激活，形成異常剪接，導致第16外顯子編碼序列的丟失和移碼。同義突變引起剪接異常FAM83H基因突變導致無活性的截短蛋白ABA：釉質(zhì)發(fā)育不全口內(nèi)照及全口曲面斷層片：示釉質(zhì)鈣化不全及病變未累及根管B：箭頭示FAM83H mRNA第973個堿基由C置換為U后導致其編碼的氨基酸由精氨酸變?yōu)榻K止碼牙本質(zhì)磷蛋白 DPP基因突變后改變氨基酸序列EAD：牙本質(zhì)發(fā)育不全患者口內(nèi)照及全口曲面斷層片E：牙本質(zhì)發(fā)育不全患者DPP基因移碼突變后改變

41、氨基酸序列，S等磷酸化位點缺失導致疾病發(fā)生遺傳性牙本質(zhì)發(fā)育不全EDA基因移碼突變導致截短蛋白突變型EDA基因的mRNA第855個堿基G缺失后導致移碼突變，產(chǎn)生一個截短蛋白無汗性外胚層發(fā)育不全EDA蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬圖野生型EDA蛋白突變型EDA蛋白（c.855delG）第六節(jié) 口腔腫瘤分子生物學一、細胞增殖與細胞凋亡（一）細胞增殖 （二）細胞凋亡二、口腔腫瘤發(fā)生的分子機制 （一） 癌基因 （二） 抑癌基因 三、口腔腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機制（一）口腔腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程（二）口腔腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的分子機制四、口腔腫瘤相關(guān)基因的篩選與功能研究策略一、細胞增殖與細胞凋亡1.細胞增殖是指通過細胞分裂增加細胞數(shù)量。2.細胞周